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Real-time PCR을 처음 접하는 사람이 보면 좋을 자료 평가A+최고예요

Real Time PCR1. PCR의 개요TV뉴스나 많은 범죄 다큐멘터리, 그리고 요즘 많은 인기를 누리고 있는 미국 드라마(일명 미드)를 보면 우리의 과학적 사실이 많이 반영되고 있는 다는 것을 알 수가 있는데, 이런 많은 과학적 사실 중에서도 PCR기술 등이 많이 사용되고 있는 것을 알 수가 있다. 예를 들어 한 살인사건에서 범인을 잡아내기 위해 살인 현장에 있던 혈액이나, 머리카락, 그리고 심지어 칫솔의 치석 등을 채취해 그것을 PCR과정을 통해 DNA를 분석 해 냄으로써 범인을 잡거나 하는 것을 우리는 방송 매체 등을 통해서 일상 생활에서 많이 접하고 있고, 친자의 확인이나 유전을 밝히는 데에서 이러한 과학적 방법들이 적용이 되고 있다.중합 효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)이라고 일컫는 PCR은 DNA의 원하는 부분을 복제·증폭시키는 분자생물학적인 기술로, DNA가닥의 열변성(denaturation step), primer와의 결합(annealing step), polymerase에 의한 DNA 합성신장(extension step)을 반복하여 실시함으로써 in vitro에서 DNA를 증폭하는 방법을 일컫는다. 이러한 PCR의 과정은 총 4단계로 나뉘게 되는데, 4단계의 과정들을 한 개의 cycle로 하여 여러 cycles을 반복하게 된다.- PCR의 과정Step1. : primer, dNTP, 내열성 DNA polymerase를 함유하는 반응액 중에, 목적으로 하는 두 가닥 DNA단편을 열변성 한다. denaturation단계로 적절한 energy에 의해서 double strand가 손상 없이 각각의single strand로 풀어지게 된다.Step2. : annealing 단계로 각각 풀어진 single strand에 primer가 상보적인 sequense를 찾아서 결합하게 된다.Step3. : extension로 Taq polymerase가 primer의 3’말단의 free OH기를 시작점으로해서 단일가닥 template의 상보적인 dNTP를 가져와서 붙여 나가며 사슬 신장을하게 된다.Step4. : 증폭 산물로써의 두 가닥 DNA를 재 열변성 하여 한 가닥 DNA를 형성한다.(Step 1으로 돌아가 반족 수행 하게됨).이러한 과정을 통해 진행되는 PCR 위에서 언급 하였던 것과 마찬가지로 단계의 과정들을 한 개의 cycle로 하여 여러 cycles을 반복하게 된다.2. Real-Time PCR의 개념현재 PCR 기술의 최첨단은 real-time PCR이다. 기존의 PCR (conventional PCR) 의 단면적인 특성을 보완하여, PCR의 동역학을 고려하여 정량적인 측면을 강화한 실험방법이다. 유전자 단편이 polymerase에 의해 증폭되는 과정을 형광 색소를 이용하여 실시간으로 확인함으로써 정량적인 분석을 가능하게 한 것이 real-time PCR이다. Real-time PCR를 하기 위해서는 thermal cycler와 분광형광광도계가 일체화된 real-time PCR 전용장치가 필요하다. Thermal cycler로 DNA를 증폭시키면서 분광형광광도계로 그 증폭산물을 측정해 나간다. 고속으로 PCR 반응이 되도록 연구된 것과 96 well plate 단위로 반응할 수 있는 것 등 다양한 특성을 갖춘 real-time PCR 장비들이 판매되고 있다. PCR 증폭산물의 증가를 실시간으로 확인 할 수 있는 real-time PCR은 기존의 PCR법에 비해서 다음과 같은 장점을 갖고 있다.① DNA와 RNA의 정확한 정량이 가능하다.② 전기영동이 필요 없어 신속하고 간편하게 해석 할 수 있으며, 오염의 위험성이 적다.3. Real-Time PCR에 의한 정량분석의 원리Real-time PCR에서는 PCR 증폭산물을 실시간으로 모니터링하여 증폭이 지수적으로 일어나는 영역에서 정량하기 때문에 기존 PCR과 달리 PCR의 증폭속도이론을 기초로 정확한 정량이 가능하다. PCR에서는 1 cycle마다 DNA가 지수적으로 증폭하다가 plateau에 도달한다. 이 증폭의 모습을 실시간으로 모니터링한 그림이 증폭곡선이다. 아래의 모식도는 DNA 농도(실제의 증폭산물량)를 청색으로 나타내고 그것을 형광으로 검출한 signal 강도를 적색으로 나타내었다. PCR 증폭산물량이 형광으로 검출가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 signal이 상승하다가 plateau에 도달 한다.초기 DNA량이 많을수록 증폭산물량이 검출 가능한양에 달하는 cycle 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 real-time PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 threshold를 설정하면 threshold와 증폭곡선이 교차하는 지점: Ct값 (Threshold Cycle)이 산출된다.Ct값과 초기 template량간에 직선적인 관계가 있어 아래 그림과 같은 검량선을 만들 수 있다. 미지의 시료에 대해서도 표준시료와 마찬가지로 Ct값을 산출하여 이 검량선과 대조하면 초기 template량을 구할 수 있다.4. 검출방법Real-time PCR에서는 PCR 증폭산물을 형광을 통해 검출한다. 검출방법은 크게 interchelating법과 형광표식 probe를 이용하는 2가지 방법이 있다. Interchelating법은 double strand DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별로 probe를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있는 장점이 있는 반면 검출 특이성은 그다지 높지않다. 형광표식 probe를 이용하는 방법은 비용은 많이 들지만 검출 특이성이 높아 비슷한 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다. 검출방법은 실험 목적에 따라서 선택한다.1) Interchelating법(SYBR Green I)SYBR green I은 double strand DNA에 specific-binding하는 물질로서, binding했을 때 특이적으로 형광 색소의 성질을 나타낸다. 증폭된 단편은 extension phase (72℃)에서 double strand로 존재할 것이므로, 이 때 형광을 측정하면 단편의 양과 비례하는 signal을 얻을 수 있다.시료를 serial dilution하여 real-time PCR을 수행하면 위와 같은 결과를 얻을 수 있다. 이 과정의 특징은 serial dilution을 한 시료가 특정 세기의 signal (threshold)을 나타내기 위해 필요한 증폭 cycle의 수가 산술적으로 증가한다는 점이다. 이미 알고 있는 양의 시료에 대해 반응을 수행하여 standard curve를 작성하고, 미지의 양을 가지는 시료의 경우 Ct를 standard curve에 대입하여 초기량을 추정한다.2) TaqMan probe법TaqMan probe는 probe의 한 끝에는 reporter fluorescent dye를 붙이고 다른 한 끝에는 quencher dye를 붙여, PCR이 진행될 때 5‘ 끝의 reporter fluorescent dye가 떨어지면서 내는 고유의 형광을 정량하는 방식이다. TaqMan probe는 annealing step에서 template DNA에 특이적으로 hybridize하지만 probe상에 quencher에 의해 형광발색이 억제된다. Extension 반응시 Taq DNA polymerase가 갖는 5’→ 3’exonuclease 활성으로 template에 hybridize한 TaqMan probe가 분해되어 형광색소가 probe에서 유리되면서 quencher에 의한 억제가 해제 되어 형광을 나타낸다.3) Molecular beaconMolecular beacon은 specific fluorescent probe로서의 기능이 잘 알려져 있지만 real-time quantitative PCR에서도 유용하다. 이 probe는 특이한 hairpin (stem-and-loof)모양으로, 가운데 loof 부분은 target에 특이적인 염기서열이고(약 10～40 bases), 양끝은 각 4～7base의 상보적 염기서열로 stem을 형성한다. 5‘ 에는 reporter fluorescent dye가 붙어 있고, 3’ 에는 universal quencher가 붙어 있어, target에 붙어 있지 않은 경우에는 구조적으로 reporter dye가 형광을 내지 못하고 어두운 상태를 유지한다. 반면, PCR 진행에 따라 증가하는 특정 산물에 molecular beacon probe가 붙게 되면 구조가 풀리면서 quencher의 영향권에서 벗어난 reporter dye가 발산하는 형광을 측정하는 방법이다.4) Hybrydization probe이 방법은 target sequence내의 서로 인접한 2개의 probe를 사용한다. 이 경우 한 probe의 3‘ 끝에는 donor fluor가 붙어 있고 다른 probe의 5’ 끝에 acceptor flour가 붙어 있어 서로 인접해야만 fluoresonance energy transfer가 일어나서, donor의 emission light가 acceptor의 excitation light로 작용할 수 있다(Fig. 14). 즉, 근접한 donor fluor에서 전달된 에너지에 의해 acceptor fluor는 형광을 발하게 되며, 그 양은 PCR 산물에 붙은 probe의 양에 비례한다.5. Primer 설계Real time PCR 실험의 첫 번째 단계는 목적유전자를 검출할 수 있는 primer (및probe)의 선택이다. 전용 소프트웨어를 이용하여 직접 설계 할 수 있고 설계가 끝난 것을 구입해서 사용 할 수 있다. Primer 설계는 Real time PCR을 성공시키기 위한 가장 중요한 요소로 PCR 증폭효율이 나쁜 primer로는 고감도 검출이 불가능하고 또 primer dimer등 비특이적 증폭이 발생하기 쉬운 primer로는 정확한 정량이 어렵다. Primer 설계 전용 소프트웨어를 사용하여 다음과 같은 조건을 만족하는 primer를 설계하는 것이 중요하다.

의/약학| 2019.07.09| 9페이지| 3,000원| 조회(410)

분자유전학, Real-time PCR, 증폭산물, qPCR

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인유두종바이러스

Human Papilloma Virus (HPV)1 Cervical Cancer - 전세계 여성에서 2 번째로 빈번히 발생하는 여성암 - 매년 50 만 명이 감염되고 , 27 만 여명이 사망 . - 인구 10 만 명당 발병률 7.4 건 Cervical cancer Cervical cancer 의 진행과정 정상세포 이형성증 (ASCUS, LSIL, HSIL) 자궁경부 상피내암 (0 기 ) 침윤성 자궁경부암- 인유두종바이러스 (HPV) 의 감염 - 호르몬 분비 이상 - 성병 , ADIS 등에 의한 질병 - 경구피임약의 장기복용 - 무분별한 성관계 , 흡연 , 다산 자궁경부암 검사의 종류 세포학적 검사 분자 진단 검사 기타 검사 종 류 PAP Smear LBC PAP Test Immunohistochemical Test DNA chip/ PCR Line probe Assay/Hybrid Capture/ DNA sequencing 질 확대경 검사 CT/MRI/ 자궁초음파검사 자궁원추절제검사 비 고 Screening 검사 자궁경부 조기검진에 사용 자궁경부암의 발생 가능성 예측 가능 . LBC 검사 + HPV DNA 검사 시 95% 의 민감도를 보이며 이는 ASCCP(FDA) 의 권고사항 확진 검사 자궁경부암 의 원인- 8 kb circular DNA virus 로 Papovaviridae family 에 속함 - E6/E7 의한 p53 억제 - 자궁경부암 환자의 95% 이상에서 발견 - HPV 에 감염된 경우 자궁경부암 발생률이 10 배 이상 증가 - High risk 과 low risk 로 구분 High risk genotype : 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68,73,82 Low risk genotype : 6,11,34,40,42,43,44,54,61,70,72,81 2 Human Papilloma Virus ( HPV)HPV type 별 자궁경부암 의 발생률 HPV 16, 18 type 이 발생률의 70% 이상 차지검사법 Hybrid capture II HPV DNA Chip (DNA Microarray) Real-time PCR 방법 PCR 을 하지 않고 면역분석 방법으로 DNA 를 분석 DNA 증폭과 교잡반응 후 laser scanner 로 genotyping 특이적 probe 를 이용한 target DNA 증폭 장점 PCR 증폭과정 없이 검사 가능 HPV 감염에 대한 정량화 가능 HPV genotyping 가능 높은 보험 수가 높은 민감도 HPV 정성 , 정량적 검출 가능 단점 - Genotyping 불가 - RNA probe 사용으로 낮은 안정성 낮은 재현성 Signal 검출을 위한 장비 필요 - 표준화된 data 부재 낮은 보험 수가 2 HPV 검사 방법 및 종류Hybrid capture IIHPV DNA chip (or PNA chip)Nylon Membrane 위에 단일 가닥의 probe 를 고정시키고 증폭된 PCR product 와 교잡반응으로 검출하고자 하는 target 을 확인 하는 방법 . Reverse Blot Hybridization Assay (REBA)ISD TM C HPV 35 Genotyping kit 35 종의 HPV type 에 대한 genotyping 가능 . HPV Multiplex PCRReal-time PCRLiquid Beads Microassay의료기술명 보험수가 Hybrid Capture Assay 법 나 -593-3 / C5960006 49,730 디엔에이 마이크로어레이법 [Microarray Test] 나 -595-2 / C5956006 51,940 피엔에이 마이크로어레이법 [PNA Microarray Test] 나 -595-2 / C6030006 51,940 비드마이크로어레이법 [Liquid Bead Microarray Test] 나 -595-2 / C6031006 51,940 중합효소연쇄반응 - 제한효소절편 질량다형법 [PCR-RFMP Test] 나 -595-2 / C6094006 51,940 인베이더법 [Invader Technology] 나 -595-2 / C6032006 49,730 실시간중합효소연쇄반응 [Real-time RCR with probe hybridization] 나 -595-2 / C6033006 49,730{nameOfApplication=Show}

의/약학| 2015.04.24| 15페이지| 5,000원| 조회(359)

Virus, HPV, 인유두종바이러스, Human Papilloma

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성병검사

STI PCR 검사1. STI (Sexually Transmitted Infection) :- 성매개 감염병으로 성 접촉을 통해 감염 되는 감염병.- 지정 법정 감염병 (TP의 경우 3군 법정감염병)2. STI 발생 현황- 2013년 9863건 성병 발생 보고 (전년 대비 7.1%증가, 표본감시기관 신고)- 세균성 감염은 줄고 바이러스성 감염이 증가하는 추세.3. STI의 종류 및 증상1) 종류2) 증상- 무증상, 배뇨통, 요도 분비물, 요도 가려움증, 화농성 분비물, 요통, 하복부 통증 등3) 검사 가능한 검체 종류- 소변, 자궁경부 swab, 조직, 전립선 맛사지액.........4. STI 검사 방법1) Multiplex PCR 검사- 한 번의 검사로 성 매개감염 원인균 12종 동시 검출 가능 (6종 보험 가능).(CT, NG, MG, MH, UU TV, TP, UP, GV, HSV2, CA, HSV1) 동시 검출 가능- PCR 과정 이후 전기영동으로 확인된 band를 판독2) Real-Time Multiplex PCR 검사- 성 매개 감염원인균 6종에 대하여 동기 검출 가능 (CT, NG, MG, MH, UU, TV).- PCR 결과에 대하여 실시간으로 결과 확인 가능.5. 보험 적용보험 항목보험 수가하부요로생식기 및 성 매개 감염 원인균 검사[다중 중합효소연쇄반응법, Multiplex PCR]나-595-5라 / C601400655,640 (747.89)하부요로생식기 및 성 매개 감염 원인균 검사[실시간 다중 중합효소연쇄반응법,

의/약학| 2015.04.21| 4페이지| 2,000원| 조회(151)

STI검사, STI분자진단 검사

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성매개감겸균(STI)

STI???1일차적으로 사람과 사람 사이에서 성적인 접촉을 통해 전파되는 질환. 세균성, 바이러스성, 기생충성 감염병으로 구분 - 세균성 감염병: 매독 (Treponema), 임질 (NG), 클라미디아 (CT), 연성하감 (HD). - 바이러스성 감염병: 단순 포진 (HSV I II), 인유두종바이러스 (HPV), HIV - 기생충/진균성 감염병: Tricomonas, Candida. 증상이 없더라도 전염력을 가지고 있는 경우가 있으며, 이러한 잠재적인 질병을 가진 경우에도 성매개 감염병에 포함. 성적인 접촉 이외에도 일부의 질환에서는 수혈이나 정맥 주사 바늘을 공동으로 사용함으로써 전파될 가능성.성 매개감염의 위험인자2STI 발생 현황2012년 10,000건이 보고되어 2011년(9,337건)대비 7.1% 증가. 세균성 5,887건(58.9%), 바이러스성 4,113건(41.1%)으로 세균성은 감소 바이러스성 감염은 증가 추세. 연성하감은 보고 건수 없음.출처: 2013 성매개감염병 관리 지침 – 질병관리본부 -2012년 성매개 감염병 신고 현황성병에 걸린 남성과 성관계를 한 여성의 감염확률 80%성병에 걸린 여성과 성관계를 한 남성의 감염확률 20%한 가지 이상의 성병에 감염되는 경우 30~50%신고 체계표본감시기관 - 보건소 - 시.도 - 질병관리 본부 감염병 감시과질병관리본부시.도 보건위생(정책)과시. 군. 구 보건소표본감시 기관 (의료기관)보 고보 고보 고자료 환류자료 환류자료 환류질병관리본부 홈페이지 건강과 질병시.도 분석 자료보건소 분석 자료Treponema pallidum (TP) Mycoplasma genitalium (MG) Neisseria gonorrhea (NG) Ureaplasma pavium (UP) Mycoplasma hominis (MH) Ureaplasma urealyticum (UU)A typeGardnerella vaginalis (GV) Chlamydia trachomatis (CT) Trichomatis vaginalis (TV) HSV 2 type (HSV2) Candida albicans (CA) HSV 1 type (HSV1)B typeSTI 종류12종 Multiplex PCR1매 독 [syphilis ]정의 : Treponema pallidum에 의해 신체 전반에 걸친 감염 증상이 나타나는 염증성 질환 원인: - 성적 접촉에 의해 전파 - 매독으로 생성된 피부궤양에 직접 접촉 - 매독에 감염된 산모에 의해 태아 감염 (선천성 매독) 분 류 : - 선천성 매독 - 후천성 매독 조기 매독, 후기 매독1기 매독: 평균 28일 잠복기, 단단하고 통증이 없는 궤양 2기 매독: 두통, 고열 등의 피부발진 증상, 경성하감 발생 후 약 3~6주 이후 증세를 보임. 잠복매독: 2기 매독 증상이 모두 없어진 시기, 혈액 검사에서 매독 양성으로 확인되나 CSF 검사에서 음성으로 확인. 수개월~일생 동안 진행.3기 매독: 감염 후 3년이 지난 시기. 신 혈관 매독, 신경 매독, 고무종의 특징적 병변 확인진 단/검사: - 선별검사: 비매독균 검사 (VDRL), RPR. - 확진검사: 매독형광항체 흡수검사 (FTA-ABS), 매독균 적혈구 응집검사 (TPHA) - PCR 검사. 치 료: - 1기, 2기, 초기잠복 매독: penicillin 주사 1회 처방 - 후기잠복 매독: 주 1회 penicillin 주사 (3주 처방) - 신경매독: 수용성 penicillin 정맥주사 약 14일 처방2임 질정의 : 성관계를 통해 임균 (Neisseria gonorrhea)에 감염되어 발생하는 남성과 여성의 비뇨생식기에 염증을 유발하는 감염증. 원 인: Neisseria gonorrhea (NG), 성적 접촉을 통해 전파. 증 상: - 남성: 잠복기 2~7일 정도, 급성 요도염, 부 고환염, 전립선염. - 여성: 잠복기 약 10일 , 무증상, 자궁경부염, 각뇨, 불임. 진 단: Gram-staining, Strain culture, PCR. 치 료: - Quinolone계열, azithromycin이나 doxycycline 을 투여 - 치료할 경우 수 시간내에 감염성이 사라짐.정의 : 임질균을 제외한 다른 균에 의해 생긴 요도염을 의미. 주요 원인균: Chlamydia, Ureaplasma, Mycoplasma, Staphylococcus, Streptococcus, E. coli, Diptheria, Mycobacteria, Tricomonas, Candia등. 원인: - 성관계에 의한 감염, 요로 감염, 세균성 전립선염, 요도 협착, 진성 포경, 요도내 도관 삽입 등의 비성적인 경로. 증 상: - 1주~1개월의 잠복기 - 남성: 요도 불편감과 가려움증, 배뇨시 통증과 빨갛고 점액성의 요도 분비물. - 여성: 배뇨시 통증이나 화끈거리는 느낌, 질 분비물 증가, 하복부 통증이나 성관계시 통증 비정상적인 질출혈, 무 증상.3비임균성 요도염합병증 : - 남 자: 불임, 결막염, 피부 질환 - 여 자: 골반염, 자궁외임신, 불임, 화농성 자궁경부염, 자연유산 - 신생아: 결막염, 폐렴. 진단: - 요도분비물이나 소변에서 염증의 확인이 가능. - 남성: 클라미디아, 여자: 클라미디아, 임균 배양검사 필요. - Gram-staining, 소변검사, PCR 등. 치 료: - 통계상 가장 흔한 균에 대한 치료를 먼저 시도 - 임균, 비임균성 요도염을 같이 치료4클라미디아 (Genital chlamydial infection)정의 /원인:Chlamydia trachomatis 에 감염되어 성접촉에 의해 직접 발생. 증 상: - 7~14일 이상의 잠복기 - 임균과 유사한 증상 - 여성의 경우 무증상이 많음. 합병증: - 남성: 부 고환염, 전립선염, 불임. - 여성: 자궁 외 임신, 만성 골반통, 난관염 - 신생아: 신생아 폐렴, 결막염 등 진 단: - 임상적 판단이 중요 - Strain culture, PCR, 분비물에서 NG가 발견이되지 않는 경우 치 료: - Tetracycline, doxycycline 투여 - 임산부: erythromycin 투여5단순 포진 (herpes simplex virus Infection)정의 : Herpes simplex virus에 감염되어 나타나는 바이러스성 질병 원인: 피부의 표피와 진피 부위에서 증식한 후 주변의 신경 세포 속으로 침투하여 잠복 상태로 존재. 분 류 : 1형, 2형으로 분류. 증 상: - 수포가 포도송이 처럼 무리를 지어 발생. - 1형 : 피부에 물집이 생기는 것이 특징, 입 주위에 단순 포진 발생. - 2형 : 성병으로 분류, 외부 성기에 물집, 발열, 근육통, 피로감 발생. 치 료: - 항바이러스제 투여6칸디다 질염(Candida vaginitis)정의 : Candida에 의해 신체의 일부 또는 여러 부위가 감염되어 발생하는 감염 질환 감염 부위에 따라 다양한 증상 및 경과를 나타남. 원인: - 가장 흔한 원인균은 Candida albicans로 85~90%를 차지. - 그 외 C. glabrata, C. tropicalis도 증상을 나타낼 수 있음. -당뇨병, 항생제 사용, 에스트로겐이 증가되는 상황(에스트로겐 함량이 높은 경구 피임약 사용, 임신, 에스트로겐 사용), 면역력 약화, 유전적 소인 증 상: - 흰 치즈 조각 형태의 질 분비물, 외음부 가려움증, 성교통, 배뇨통 등이 있음 - 진찰 소견으로는 질 분비물, 외음부 및 질의 홍반, 부종등이 확인 됨.진 단/ 검사 :치 료 : - Azole 제제 사용 국소제제 : 대표적인 방법으로 Clotrimazole 500mg 질정 1회 용법. 경구제제 : Fluconazole 150mg 1회 용법. 경 과: - 2~3일 내에 증상이 해소. - 약 5% 정도에서 재발성 칸디다 질염이 발생. 예방법: - 꽉 끼는 옷 착용 및 합성원단 의복 착용을 피하고 외음부를 너무 습하지 않게 유지. -당뇨병을 앓고 있는 여성이라면 혈당 조절 필요.7후천성 면역 결핍증 (AIDS)정의 : Human immunodeficiency virus (HIV)에 의해 감염되어 면역체계의 파괴로 보통 사람에게서는 볼 수 없는 희귀한 각종 감염증이 발생하고, 이것이 전신에 퍼지는 질환. 감염 원인 : HIV 감염인과의 성관계, 오염된 주사바늘 사용, 수혈 등 증 상: - 잠복기 3~6주, 급성 HIV 증후군 유발 (발열, 인후통, 두통, 관절통, 구토, 피부 발진등) - 급성 HIV 증후군 이후 무증상 (4년 ~ 10년 이상) - 면역력저하로 인한 희귀질병에 대하 감염, 악성 종양 증가로 인한 사망 진 단: - 혈액검사 (HIV 항체 , 항원 검출) - Western blot , PCR 치 료: - 항 HIV 약제 투여 - 주기적인 HIV 수, 면역세포 수 측정 - 투여되는 약제에 따른 식이 요법그 외 성 매개감염병8곤지름 (condyloma) : Human papilloma virus (HPV)에 의해 감염되어 성기, 항문 주위 사마귀가 관찰 자궁경부암 (uterine cervical cancer) 성 접촉에 의한 HPV 감염이 주된 원인. 자궁경부암 환자의 99.7%이상에서 HR HPV감염이 발견. 연성하감 (Chancroid) : - Hemophilus ducreyi에 의해 감염되어 성기 궤양 발생. - HIV 감염의 주요 보조인자로 알려져 있음. 사면발이 : - Phthirus pubis의 기생 원인 - 사람의 털에 살면서 하루에 4~5회 흡혈. 간염 : hepatitis virus A, B, C type의 감염에 의해 생기는 간세포의 염증.{nameOfApplication=Show}

의/약학| 2014.07.26| 26페이지| 3,500원| 조회(249)

성병, STD, STI, 성매개감염병

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Real-time PCR의 개념

Real Time PCR(주)바이오니아 진단영업2팀하 헌 수1. PCR의 개요TV뉴스나 많은 범죄 다큐멘터리, 그리고 요즘 많은 인기를 누리고 있는 미국 드라마(일명 미드)를 보면 우리의 과학적 사실이 많이 반영되고 있는 다는 것을 알 수가 있는데, 이런 많은 과학적 사실 중에서도 PCR기술 등이 많이 사용되고 있는 것을 알 수가 있다. 예를 들어 한 살인사건에서 범인을 잡아내기 위해 살인 현장에 있던 혈액이나, 머리카락, 그리고 심지어 칫솔의 치석 등을 채취해 그것을 PCR과정을 통해 DNA를 분석 해 냄으로써 범인을 잡거나 하는 것을 우리는 방송 매체 등을 통해서 일상 생활에서 많이 접하고 있고, 친자의 확인이나 유전을 밝히는 데에서 이러한 과학적 방법들이 적용이 되고 있다.중합 효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)이라고 일컫는 PCR은 DNA의 원하는 부분을 복제·증폭시키는 분자생물학적인 기술로, DNA가닥의 열변성(denaturation step), primer와의 결합(annealing step), polymerase에 의한 DNA 합성신장(extension step)을 반복하여 실시함으로써 in vitro에서 DNA를 증폭하는 방법을 일컫는다. 이러한 PCR의 과정은 총 4단계로 나뉘게 되는데, 4단계의 과정들을 한 개의 cycle로 하여 여러 cycles을 반복하게 된다.- PCR의 과정Step1. : primer, dNTP, 내열성 DNA polymerase를 함유하는 반응액 중에, 목적으로 하는 두 가닥 DNA단편을 열변성 한다. denaturation단계로 적절한 energy에 의해서 double strand가 손상 없이 각각의single strand로 풀어지게 된다.Step2. : annealing 단계로 각각 풀어진 single strand에 primer가 상보적인 sequense를 찾아서 결합하게 된다.Step3. : extension로 Taq polymerase가 primer의 3’말단의 free OH기를 시작점으로해서 단일가닥 template의 상보적인 dNTP를 가져와서 붙여 나가며 사슬 신장을하게 된다.Step4. : 증폭 산물로써의 두 가닥 DNA를 재 열변성 하여 한 가닥 DNA를 형성한다.(Step 1으로 돌아가 반족 수행 하게됨).이러한 과정을 통해 진행되는 PCR 위에서 언급 하였던 것과 마찬가지로 단계의 과정들을 한 개의 cycle로 하여 여러 cycles을 반복하게 된다.2. Real-Time PCR의 개념현재 PCR 기술의 최첨단은 real-time PCR이다. 기존의 PCR (conventional PCR) 의 단면적인 특성을 보완하여, PCR의 동역학을 고려하여 정량적인 측면을 강화한 실험방법이다. 유전자 단편이 polymerase에 의해 증폭되는 과정을 형광 색소를 이용하여 실시간으로 확인함으로써 정량적인 분석을 가능하게 한 것이 real-time PCR이다. Real-time PCR를 하기 위해서는 thermal cycler와 분광형광광도계가 일체화된 real-time PCR 전용장치가 필요하다. Thermal cycler로 DNA를 증폭시키면서 분광형광광도계로 그 증폭산물을 측정해 나간다. 고속으로 PCR 반응이 되도록 연구된 것과 96 well plate 단위로 반응할 수 있는 것 등 다양한 특성을 갖춘 real-time PCR 장비들이 판매되고 있다. PCR 증폭산물의 증가를 실시간으로 확인 할 수 있는 real-time PCR은 기존의 PCR법에 비해서 다음과 같은 장점을 갖고 있다.① DNA와 RNA의 정확한 정량이 가능하다.② 전기영동이 필요 없어 신속하고 간편하게 해석 할 수 있으며, 오염의 위험성이 적다.3. Real-Time PCR에 의한 정량분석의 원리Real-time PCR에서는 PCR 증폭산물을 실시간으로 모니터링하여 증폭이 지수적으로 일어나는 영역에서 정량하기 때문에 기존 PCR과 달리 PCR의 증폭속도이론을 기초로 정확한 정량이 가능하다. PCR에서는 1 cycle마다 DNA가 지수적으로 증폭하다가 plateau에 도달한다. 이 증폭의 모습을 실시간으로 모니터링한 그림이 증폭곡선이다. 아래의 모식도는 DNA 농도(실제의 증폭산물량)를 청색으로 나타내고 그것을 형광으로 검출한 signal 강도를 적색으로 나타내었다. PCR 증폭산물량이 형광으로 검출가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 signal이 상승하다가 plateau에 도달 한다.초기 DNA량이 많을수록 증폭산물량이 검출 가능한양에 달하는 cycle 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 real-time PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 threshold를 설정하면 threshold와 증폭곡선이 교차하는 지점: Ct값 (Threshold Cycle)이 산출된다.Ct값과 초기 template량간에 직선적인 관계가 있어 아래 그림과 같은 검량선을 만들 수 있다. 미지의 시료에 대해서도 표준시료와 마찬가지로 Ct값을 산출하여 이 검량선과 대조하면 초기 template량을 구할 수 있다.4. 검출방법Real-time PCR에서는 PCR 증폭산물을 형광을 통해 검출한다. 검출방법은 크게 interchelating법과 형광표식 probe를 이용하는 2가지 방법이 있다. Interchelating법은 double strand DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별로 probe를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있는 장점이 있는 반면 검출 특이성은 그다지 높지않다. 형광표식 probe를 이용하는 방법은 비용은 많이 들지만 검출 특이성이 높아 비슷한 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다. 검출방법은 실험 목적에 따라서 선택한다.1) Interchelating법(SYBR Green I)SYBR green I은 double strand DNA에 specific-binding하는 물질로서, binding했을 때 특이적으로 형광 색소의 성질을 나타낸다. 증폭된 단편은 extension phase (72℃)에서 double strand로 존재할 것이므로, 이 때 형광을 측정하면 단편의 양과 비례하는 signal을 얻을 수 있다.시료를 serial dilution하여 real-time PCR을 수행하면 위와 같은 결과를 얻을 수 있다. 이 과정의 특징은 serial dilution을 한 시료가 특정 세기의 signal (threshold)을 나타내기 위해 필요한 증폭 cycle의 수가 산술적으로 증가한다는 점이다. 이미 알고 있는 양의 시료에 대해 반응을 수행하여 standard curve를 작성하고, 미지의 양을 가지는 시료의 경우 Ct를 standard curve에 대입하여 초기량을 추정한다.2) TaqMan probe법TaqMan probe는 probe의 한 끝에는 reporter fluorescent dye를 붙이고 다른 한 끝에는 quencher dye를 붙여, PCR이 진행될 때 5‘ 끝의 reporter fluorescent dye가 떨어지면서 내는 고유의 형광을 정량하는 방식이다. TaqMan probe는 annealing step에서 template DNA에 특이적으로 hybridize하지만 probe상에 quencher에 의해 형광발색이 억제된다. Extension 반응시 Taq DNA polymerase가 갖는 5’→ 3’exonuclease 활성으로 template에 hybridize한 TaqMan probe가 분해되어 형광색소가 probe에서 유리되면서 quencher에 의한 억제가 해제 되어 형광을 나타낸다.3) Molecular beaconMolecular beacon은 specific fluorescent probe로서의 기능이 잘 알려져 있지만 real-time quantitative PCR에서도 유용하다. 이 probe는 특이한 hairpin (stem-and-loof)모양으로, 가운데 loof 부분은 target에 특이적인 염기서열이고(약 10～40 bases), 양끝은 각 4～7base의 상보적 염기서열로 stem을 형성한다. 5‘ 에는 reporter fluorescent dye가 붙어 있고, 3’ 에는 universal quencher가 붙어 있어, target에 붙어 있지 않은 경우에는 구조적으로 reporter dye가 형광을 내지 못하고 어두운 상태를 유지한다. 반면, PCR 진행에 따라 증가하는 특정 산물에 molecular beacon probe가 붙게 되면 구조가 풀리면서 quencher의 영향권에서 벗어난 reporter dye가 발산하는 형광을 측정하는 방법이다.4) Hybrydization probe이 방법은 target sequence내의 서로 인접한 2개의 probe를 사용한다. 이 경우 한 probe의 3‘ 끝에는 donor fluor가 붙어 있고 다른 probe의 5’ 끝에 acceptor flour가 붙어 있어 서로 인접해야만 fluoresonance energy transfer가 일어나서, donor의 emission light가 acceptor의 excitation light로 작용할 수 있다(Fig. 14). 즉, 근접한 donor fluor에서 전달된 에너지에 의해 acceptor fluor는 형광을 발하게 되며, 그 양은 PCR 산물에 붙은 probe의 양에 비례한다.5. Primer 설계Real time PCR 실험의 첫 번째 단계는 목적유전자를 검출할 수 있는 primer (및probe)의 선택이다. 전용 소프트웨어를 이용하여 직접 설계 할 수 있고 설계가 끝난 것을 구입해서 사용 할 수 있다. Primer 설계는 Real time PCR을 성공시키기 위한 가장 중요한 요소로 PCR 증폭효율이 나쁜 primer로는 고감도 검출이 불가능하고 또 primer dimer등 비특이적 증폭이 발생하기 쉬운 primer로는 정확한 정량이 어렵다. Primer 설계 전용 소프트웨어를 사용하여 다음과 같은 조건을 만족하는 primer를 설계하는 것이 중요하다.

자연과학| 2011.12.20| 9페이지| 3,000원| 조회(616)

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