Chapter 5. The Death Receptor Family and the Extrinsic PathwayⅠ. Introduction1. Death Receptor -cell surface의 cytokine rec.(TNF/NGF receptor superfamily)로 ligand와 결합하여 apoptosis를 trigger함 - type1 transmembrane protein - C-terminal intracellular tail(death domain) - N-terminal extracellular ligand binding domain(one to five cysteine rich repeats) - 종류 구조(Fig.1)2. Death ligand - TNF family of protein(LTα) - typeⅡ transmembrane protein(N-term : intracellular, C-term : extracellular) - Death ligand는 metalloproteases의 cleavage에 의해 released 됨 3. signal transduction - death ligand와 Rec와의 interaction에 의해 개시 -- recruitment of adapter mol.-- DISC 형성Ⅱ. FAS(CD95/APO-1) Fas ligand(FASL/CD95L)1. Fas 1) 구성 - glycosylated cell-surface protein - 325-335의 amino acids residues - 45-52kDa - 유전자 위치(human - chromosome 10 long arm, mouse - 19) 2) thymus, heart, kidney, mature lymphocyte, virus-transformed lymphocyte에 풍부하게 존재 3) Rec.의 조절은 생리학적으로 필수 적이다 - 다양한 mechanisms에 의하여 tight하게 regulation됨 - Golgi networkgative FADD6. physiology pathophysiology1) Cell death proliferation의 balance가 중요 2) 이상시 질병발생 - lpr(lymphoproliferation)과 gld(generalized lyphoproliferation disease)의 열성 mutation은 CD4- CD8- T lymphocyte가 축적되어 autoimmune를 일으킨다 - Fas/FasL 손상시 : CD4- CD8- T lymphocyte가 축적 3) ALPS(autoimmune lyphoproliferation syndrome) - 이환자는 대부분 children, - Fas gene의 heterozygous mutation에 의함(normal과 함께 DN-form이 발현되어 발생) - immune reaction의 downregulation(develop lymphoadenopathy 등등), autoimmune diseases(hemolytic anemia 등등)를 야기 4) downregulation or loss of Fas - 각종 tumor 발생 - cytotoxic T lymphocyte NK cell의 공격으로 부터 survive함 5) overexpression of Fas FasL - liver failure → fulminant hepatitis(전격성 간염) 유발(liver copper의 축적) - AIDS에서도 나타난다.Ⅲ. TNF-R1 TNF-α1. TNF-R1 1) 2종류 특징 - TNF- R1(p55, CD120a), TNF-R2(p75, CD120b) - type 1 transmembrane protein - extracellular : amino terminus, disulfide rich - transmembrane - helix - cytoplasmic tail (only TNF- R1만 DD존재) 2) ligand 3종류 - mTNF-α(membrane bound TNF-α) = 거리 depepatitis 환자와 사망에 직접적인 관계가 있다 4) knockout animal study에서 TNF/TNF-R1 systeme은 immune inflammatory에 중요함 5) several human immune diseases는 dysregulation of the TNF/TNF-R1 systeme을 보인다. 6) overproduction of TNF는 several autoimmune condition과 연결되어 있다.Ⅳ. TRAIL Receptor TRAIL1. TRAIL Receptor(TNF-related apoptosis-inducing ligand) 1) the new member of the TNF family 2) five different cognate Rec. - TRAIL-R1 - TRAIL-R2 - TRAIL-R3 - TRAIL-R4 - osteoprotegerin Rec.Death Rec.Decoy Rec.서로 경쟁함 Healthy tissues에서는 decoy Rec.가 많이 발현된다(OPG-R)2. TRAILThe TNF family의 다른 members DNA databases에서 sequence의 homology screening를 통해 발견(1995) FasL과 높은 homology를 가지나 Fas와 결합 하지는 않음 Type2 transmembrane protein, metalloprotases에 의해soluble한 form으로 됨3. physiology pathophysiologyPhysiological role of TRAIL – tumor suppressor. Liver NK cells에 의한 anti-metastatic function Endogenously produced interferon(IFN)-g를 regulation (IFN-g ; NK cell-mediated anti-tumor immunity) 따라서 cancer therapy의 후보 물질로서 중요함기타 death recptorsⅤ. Dea 정지, inner membrane 과 across에 large pore가 opening, mitochondria permeability transition. 2 apoptosis - PTP ( mitochondria permeability transition pore) : multiprotein complex로서 outer와 inner membrane사이에 contact되어있다. 그리고 matrix로부터 cytosol로 연결되어있는데 VDAC, ANT, CyclophilinD, creatine kinase, Cytosolic hexokinase들을 포함하고 있다.Apoptosis signaling pathwayDeath receptor pathway : ligand bind activate pathway Mitochondria pathway : Bcl-2 protein에 의해 control, activation되면 --- pro apoptotic protein들이 mitochondria outer membrane로 permeabilize. ---- trigger the apoptotic protein (cytochromeC)Structure and channel forming activity of the Bcl-2 protein proteinsBoth pro or anti-death protein들은 artificial lipid membrane에서 channel forming activity를 가지고 있다. Anti- apoptotic protein은 오직 낮은 PH에서 activity를 나타내고 pro-apoptotic protein은 neutral PH에서 activity를 가지고 PH가 낮아지면 activity는 증가하게 된다.Activation of the pro-apoptotic multidomain Bcl-2 proteinsNormal cell에서 Bax는 monomer로 cytosol에 위치하다가 apoptotic stimuli가 오면 그것의 protein에 의해 trigger된 PTP의 opening. 결과로 matrix의 swelling과 outer membrane의 rupture가 일어난다. A,B model은 specific한 channel formation으로 specific protein의 release가 일어나고 C,D는 control되지 않아 unspecific한 protein을 release한다.2. Bax-VDAC channel Bax와 Bak은 VDAC와 incorporation하여 liposome으로부터 cytochromeC를 release할수 있다. 역으로 또한 Bax oligomer는 홀로 cytochromeC conduct channel을 형성할수도 있다. 이와같은 다른 생각은 Bax monomer는 channel forming activity를 가지지 못하기 때문이고 아마도 VDAC는 mitochondria의 receptor protein의 기능을 할것이다. 3. The permeability transition pore PTP는 두개의 mitochondria membrane를 연결하고 있고 outer membrane에 VDAC가 그리고 inner에는 ANT, matrix에는 cyclosphilinD.형성. Calcium ion에 의한 pore opening . 반대로 ANT ligand bongkrekate, cyclosporin A interaction with cypD, Mg2+, ADP and ATP, block the pore. PTP inhibitor : cypA.Activities of mitochondrial proteins released1. Cytochrome C Inner mitochondria membrane의 outer surface에 attached하여 electron transport chain에 기능을 한다. Loosely attached to the lipid, primary cardiolipin, also bound hydrophobicw}
RNA interference현재 우리는 genomics 시대를 지나 postgenomics 또는 functionomics라 불리는 시대에 살고 있다. 따라서 이제는 DNA level의 연구보다는 protein function을 밝히는 일이 보다 우선시 되고 있다.인간에게는 약 3만개의 유전자가 존재하지만, 각 세포에서는 그 중 일부만이 발현된다. 그리고 그 gene가 발현되어 alternative spliccing of primary RNAs, 또는 protease, glycosylation, phosphorylation등의 여러 가지 다른 posttranscriptional and posttranslatinal modification에 의해 최소 10만개 이상의 다른 proteins이 존재 할 것이라 추정된다. 질병과 관련하여 어떤 protein의 function을 알기 위해서는 그 protein이 어디에서 언제, 또 어느 정도로 발현되는지를 알고 그를 기반으로 그것의 존재를 없애거나 기능을 없애는 방법을 이용하고 그 방법이 적용된 생명체에 나타는 phenotype을 봄으로써 그 function을 알수 있다. 이러한 연구는 antisense oligomer, aptamer, intraner, 등을 이용하여 gene의 기능을 disruption시키는 방법, knock out model을 이용하는 방법들이 있었다. 본 report에서는 이런 protein의 기능을 disruption시키는 새롭고 획기적인 방법인 RNA interference에 대해 설명하고자 한다.생명체의 유전정보를 전달하는 물질은 DNA로 알려져 있다. 그러나 일부 바이러스, 즉 like the retrovirus HIV는 RNA를 매개로 유전 정보를 전달한다. 따라서 생 명체는 이러한 바이러스에 의한 감염에 대비하여야한다. RNAi는 이런 외래 RNA들의 침입에 대한 방어 기작으로 C. elegans에서 처음 보고 되었다. RNAi는 21-23nt의 dsRNA(siRNA)에 의해서 상보적인 염기서열을 갖는 mRNA가 선택적으로 분해 되는 현상을 말한다. 이 결과 gene의 silencing이 이루어지고, 이를 통해 genome의 sequence만으로는 알수 없는 cellular level의 gene function 및 그 gene에 의해 합성되는 protein의 function을 알 수 있게 된다.- 과거에 사용되어진 gene silencing주로 anti-sense RNA를 이용 - 어떤 target mRNA와 complementary RNA를 이용한 상보적 결합에 의하여 gene의 expression을 block하는 방법- 여러 가지 문제점 야기a. 주입 RNA의 stabilityb. uptake efficiency 및 방법c. RNA의 3차 구조에 의한 binding capacity 등...- 따라서 이런 문제점을 해결하기 위해 chimeric oligomer(DNA:RNA:RNaseH)나 여러 가지 modification이 이루어진 anti-sense RNA를 사용하고 있어나 그 역시 gene silencing 에 어려움이 많이 존재한다.- RNAi의 mechanism1. Dicer - RISC dependent mechanism (human, drosophila)a. long ds RNA에 ds RNA specific RNase인 Dicer가 21-23nt small interfering RNA(siRNA)로 cleavage하게 되고 이들은 3′ overhang된 form을 형성한다.b. Dicer의 PAZ (Drosophila Piwi/Argonature/Zwille famidomain)domain과 Ago2가 결합하여 siRNA의 unwinding가 일어남c. RICS(RNA induced silencing complex)가 recruitment가 일어남d. activation된 RICS가 target mRNA를 인식하고, 그 상보적 sequence에 결합하여 mRNA를 cleavage 시킨다.* RISC - 약 500kDa의 complex로 PAS domain을 가지고 있으며, eIF2C1&eIF2C2와 높은 homologs를 가지고 있다.2. Dicer - RdRp(RNA dependent RNA polymerase) dependent mechanism(C. elegangs) ->C.elegans에서 RdRp 의 mutation시 RNAi에 의한 gene silencing이 block 되었다.a. 어떤 target mRNA의 특정 exon의 dsRNA를 주입한다b. Dicer에 의해 dsRNA 절단 - siRNA형성c. 이를 primer로 RdRp가 target mRNA의 cRNA를 합성한다.d. Dicer에 의해 cRNA가 절단됨 - siRNA형성e. 많은 양의 siRNA가 만들어 지며, 다른 exon의 siRNA가 만들어 진다.f. 결과적으로 강한 silencing이 이루어지며, 1개의 gene에 의해 합성되는 다른 protein까지 block가능 -->이는 2n으로 존재하는 대립 유전자의 1개의 gene에 해당하는 dsRNA를 넣었을때 2개의 alleles들이 모두 silencing되어 알게 되었다. 그러나 mammals에서는 RdRp가 발견되지 않고 있다.- Dicer1. RNaseⅢ family members로 dsRNA specific nucleases로 human, Drosophila, C. elegangs 등 대부분 발견됨.2. dsRNA를 일정한 크기로 자른다3. N-terminal에 Helicase domain , 중간에 PAZ domain, C-terminal쪽으로 RNaseIII, DSRM domain이 자리하고 있다. Viral attack후에 double-strand RNA를 siRNA로 만든다.4. Helicase domain : Dicer의 substrate인 double strand RNA를 구조적으로 재배치 시키기 위해 필요한 domain.5. PAZ domain: Drosophila Piwi/Argonature/Zwille family- 기능은 잘 알려져 있지 않으나 없으면 RNAi가 inhibition 됨6. DSRM : double strand RNA binding motif.- posttranscriptional gene silencing in plantsRNAi 현상이 가장먼저 발견된 생물체로 virus에 대한 식물 자체의 immune defense system과 밀접한 관련을 가지고 있다. 두종류의 transgene에 의해 gene silencing가능첫째, single transgene copy 들의 high level transcription을 통해 도입된 gene의 homozygous 또는 강력한 promoter 가 사용 되었을 경우 RNAi를 시작한다.둘째, PTGS유도가 가능한 transgene의 배열을 sense DNA의 inverted repeat로 배열하는 것으로 이 RNA는 hairpin구조를 형성하기 때문에 dsRNA와 유사한 구조를 통해 RNAi유도가 가능하다.- RNAi in mammals and humansRNAi의 작용기작은 아직 완전하게 해명되지는 않았으나 초파리 추출액을 사용한 in vitro 실험으로 RNAi과 정에서 생겨난 21-23nt의 siRNA가 중요하게 작용한다는 것을 밝혔다. 그리고 이 발견은 척추동물 유래의 배양세포에 RNAi의 응용을 가능하게 하였다. 즉 Hela등의 human cell에서 21nt의 siRNA를 투여하면 RNAi가 일어난다고 보고 되어 있다. long strand dsRNA를 포유류 세포에 투여하였을 경우 RNAi가 일어나지 않고 비특이적인 장애를 나타내었는데 이는 dsRNA 의존적 단백질 인산화로 단백질합성계가 저해 받기 때문이다. (PKR phosphorylation과 EIF2a의 inactivation) siRNA가 포유류의 세포에서도 RNAi를 일어킨다는 사실은 functionomics 시대에 유용하게 사용될 것이다.mammalian cell 안에서 RNAi현상을 일으키기 위해서는 무엇보다도 siRNA의 안정성이중요하다. 이러한 문제점은 inverted repeat siRNA 로 RNA expressing 되는 plasmid 를 사용함으로써 가능하게 되었다. 그리고 cell 안으로 RNA를 도입하는 장소나 형태 또한 다양하게 설정함으로써 보다 효과적인 RNAi를 가능하게 했다. 이러한 방법에는long ds RNA application , siRNA insertion, siRNA expression vector, long hairpin RNA expression vector 등의 4가지 route 를 통해 RNAi 를 적용하게된다. 이 방법들은 각각의 gene silencing 목적에 맞도록 고안된 것으로 서로 단점들을 가지고있지만 그러한 단점들은 특정 gene 에 해당하는 경우도 있기 때문에 어느 것을 가장 적당한 방법이라고 설정할 수는 없다.
Caspase1. apoptosis란?1) programmed cell death2) development 동안 cell number을 regulation 과 homeostatic cell turn-over 에 중요한 역 할3) 정상적인 재생계 세포가 스스로 프로그램에 의해 자살할 때 나타나는 죽음 방식.4) necrosis와는 달리 세포가 축소하고 핵이 응축함으로써 DNA는 규칙적으로 절단됩니다.5) necrosis가 장시간에 걸쳐 무질서하게 일어나는 데 반해 apoptosis는 단시간에 질서있게 일어납니다.ex)* 발생 과정이나 몸의 형성 및 유지에 중요* 사람 손의 발생* 소장과 위의 상피 세포도 apoptosis에 의해 새로운 세포로 대체2. apoptosis의 특징membrane blebingcell shrinkageprotien fragmentationchromatin condensationDNA degradationrapid engulfment of corpses by neighboring cells3. Discovery of the caspase1) C. elegans의 유전학적인 연구를 통해, 아폽토시스에 관여하는 14개의 유전자가 밝힘(Ellis et al., 1991)2) Ced-3, Ced-4, Ced-9- Ced-3, Ced-4 ; 세포죽음을 유도 < Ced-3 active site ; QACXG(그루타민-알라닌-시스테인-아미노산-그라이 신)라는 5개의 보존된 아미노산 서열이 존재>- Ced-9 ; 죽음을 억제3) Interleukin-1-beta-converting enzyme(ICE or caspase-1)- 인간에서의 Ced-3 (Ced-3와 높은 homology)- aspartate-specific protase- pro-IL-1-beta를 mature form으로 전환4. The capases: agents of cellular demolition1) What are caspases ?1>11 caspases have been identified in humans; about two-thirds of these have been suggested to function in apoptosis.2>caspase는 inactive한 pro-enzymes (30-50 kDa)으로 상태로 존재하다가 activation되어 작용한다. caspase pro-enzymes은 N-terminal prodomain, p20 (large subunit), p10 (small subunit)으로 이루어져 있다. (fig. 1)3>각 caspase는 protein-protein interaction module(=death adaptor module)을 가진다. 이들 두 domain간의 sequence는 매우 다르지만 6개의 antiparallel alpha-helices를 이루는 3차원적인 구조는 매우 비슷하다.caspase-8, -10 : DED (death-effector domain)caspase-2, -9 : CARD (Caspase activation and recruitment domain)4>activated caspase의 정확한 형태는 잘 알려져 있지 않으나 caspase-1과 caspase-3는 두개의 heterodimer가 결합하여 tetradimer가 형태가 된다.5. activation of caspase1>caspase cascade strategy : caspase-3, -6, and -72>induced proximity : caspase-8. 수용체에 의하여 서로 가깝게 접근하여 procaspase-8의 intrinsic portease activity에 의하여 서로를 절단한다.3>association with a regulatory subunit : caspase-9은 Apaf-1 및 cytochrome c와 결합하여 apoptosome이라고 불리는 holoenzyme을 형성함으로써 활성화된다.1) 세포의 내외로부터 유도되는 apoptosis세포의 밖으로부터 세포중에서다른 세포로부터의 signal 분자 유전자의 장해(자외선 , 항암제 등 ) 나제시 유전 프로그램↓ ↓signal 분자의 수용 cyt-c 의 유출이나 Bcl -2패밀리의 해리↓ ↓R ec. complex의 다량체화 Apaf－1의 다량체화↓ ↓caspase 8 caspase 9↓ ↓하위 caspase(－3등 ) 의 활성화↓세포 성분의 파괴2) Mt. 경로 (p.7 fig. 2참고)3) Ligation of death receptor1>CD95를 통한 signaling 과정* CD95L trimer가 세개의 CD95와 결합* CD95의 death domain (DD) 의 clustering* clustered된 CD95의 DD에 FADD(Fas-associated death domain)가 결합* FADD의 death effector domain (DED)에 caspase-8의 DED가 결합* caspase-8의 oligomerization은 self-cleavage를 통하여 스스로를 activation시킴* activated caspase-8이 downstream effector caspases를 활성화시킴Caspase substrates (DXXD)* Table 1 and 2* inactivation of inhibitors of apoptosis : apoptosis에 특징적인 DNA ladder를 만드는데 관여하는 효소는 CAD (caspase-activated DNase)인데 ICAD라고 불리는 inhibitory subunit가 붙어 있어 비활성화되어 있다가 caspase-3에 의하여 ICAD가 cleavage되면 CAD가 활성화되어DNA를일정한 간격으로 절단한다.* disassembly of cell structures : 핵막 아래의 단단한 구조인 nuclear lamina를 caspase가 절단하여 chromatine condensation에 기여한다.chapter 2. Bcl-2 family protein1. Introduction1) apoptosis는 2가지 major pathway가 있다. (Rec. & Mt. pathway)2) Bcl-2는 Mt. pathway의 중요한 regulator3) Bcl-2는 anti-, pro-apoptosis member양쪽 모두 존재-life 와 death의 균형을 조절함Regulation of Bcl-2 family protein1) Regulation of expression* Bcl-2 family protein들은 the balance of life & death에 중요함-따라서 엄격하게 조절 되어야함* Anti death and pro death molecule are expressed constitutively in cells-death stimuli의 해서만 expressionex) nutritional factor의 궁핍 -->expression of pro-apoptotic moleculeDNA damage --> expression of Noxa & PUMA2) Regulation of through alternative splicing* alternative splicing을 통해 Bcl-2 family는 상반된 기능의 spliced form을 얻음ex) Bcl-xL vs. Bcl-xSMcl-1L vs. Mcl-1s* tissue & signal specific mechanism3) Regulation of post-translational modifications
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