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균생장

담당교수님 : 채 희 정 교수님날짜 : 2001.09.학번 : 98762020학과 : 식품가공학과이름 : 김재철실험제목 : 배양배지 준비 및 접종Flask 배양에서의 protease 생산실험목적 : 이번 실험은 NB배지를 이용하여 복합배지를 만들어 효소의 생성능을 확인하는 실험으로 효소의 생성능이 확인되지 않은 미생물인 경우 통 상 고체배지에서 유안을 통한 정성분석이 실시된다. 보통 casein 의 분해력을 비교함으로써 단백질 분해력이 우수한 균주를 선발한다. skim milk 또는 casein이 첨가된 적당한 배지(nutrient agar 배지)에 서 균주의 생육과 세포의 분비 효소에 의한 단백질의 분해를 육안으로 확인한다.실험원리배지미생물이나 동식물의 조직을 배양하기 위해 배양체가 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 하여 고화 시키거나 그 밖의 목적을 위한 물질을 가한 것을 배지라하며 다른 말로 배양기라고도 한다.생물은 생존, 발육에 필요한 물을 비롯하여 영양물질로서 다량요소, 미량 요소 등을 요구한다. 그 중 개체 상으로 얻어지는 것을 제외하고는 모두 무기 또는 유기화합물로서 배양액에서 공급해주어야 한다. 독립영양, 종속영양 등 영양형식에 따라 필요로 하는 영양원은 여러 가지인데 보통은 탄소원, 질소원, 무기염류, 발육인자 등으로 나누어서 생각한다.특히 발육인자와 관련하여 생물체 내에서 추출한 비교적 복잡한 조성을 가진 것을 주체로 한 것을 천연배지라 하며 세균은 육즙, 혈청 등 곰팡이는 맥아 엑스 등이 흔히 사용된다. 이에 비하여 무기염류 또는 맥아 엑스 등이 아닌 탄소원, 질소원을 가한 조성이 명확한 경우를 합성배지라 한다. 대량 배양에는 액체배지가 적절하고 주(株)의 보존이나 분리에는 한천 ·젤라틴 등을 가한 고형배지를 사용한다. 많은 종류의 세균을 포함하는 재료로부터 목적균을 추출하기 위한 배지를 선택배지라고 한다.배지는 완전히 멸균한 후에 목적균을 심지 않으면 잡균이 증식될 염려가 있기 때문에 배지를 보존하기 위해서는 반드시 멸균이 필요하다.배지의 배지와 같다. 그러나 배양과정은 큰 차이가 있는 데, 그 것은 진탕기 위에서 계속 교반을 해 주어야 하는 점이다. 이렇게 해야하 는 이유는 조직이 액체 속에 정지된 상태로 있으면 산소공급이 안되어 질 식하게 되므로 공기를 액체 속에 유입시켜서 조직이 이용하도록 하고, 동 시에 여기서 나온 유해 가스를 용기외의 공기로 배출시켜야 하기 때문이 다. 용기의 입구는 배지의 오염을 막기 위해서 마개를 하지만 약간의 공 기 유통은 가능하므로 이곳을 통하여 외부와 가스교환이 이루어진다. 배 지가 계속 움직이므로 정지상태에서 보다 가스교환은 더욱 잘 된다. 일반 적으로 세포배양이나 미세조직을 집단으로 배양하여 이들로부터 분화를 억제시키려고 할 때는 액체 배양을 이용한다.2 고체배지 : 평판배지, 사면배지 및 고층배지가 있는데, 이들은 모두 미생물의 순수분 리와 보존용으로 많이 쓰인다. 액체배지에 한천을 0.5∼20％ 또는 gelatindmt을 15∼20％ 첨가하여 고화시킨 것이다.고체배지는 배지의 기본형태이고 가장 널리 사용되므로 배지라고 하면 대 개는 이것을 의미한다. 영양분과 생장조절제 이외에 응고제를 첨가하여 반고체 상태로 만든 것이다. 기내번식에서 절편의 배양이나 캘러스를 형 성시키고 이로부터 식물체를 분화시키는 등의 일은 모두 고체배지를 사용 한다. 초기의 분화를 촉진시키기 위해서 액체배지에 배양하던 것도 일단 분화가 완성되면 고체배지로 옮겨 성장시킨다. 배지를 응고시키는 재료로 한천을 많이 사용한다. 흔히 사용되는 한천의 농도는 0.8%이고 이 정도에 서 배지는 적당히 굳어져서 조직을 그 위에 놓았을 때 움직이지도 않고 배지로부터 양분과 수분을 흡수할 수 있다.3 반고체배지 : 운동성 실험과 미생물의 보존목적에 이용되고 있다.배지의 고형화에 쓰이는 물질로는 한천(agar), 젤라틴(gelatin), 실리카겔 (silica gel), 계란알부민(egg albumin), 감자 및 혈청 등이 있다.이 중에서 한천은 배지의 성분변화에 영향을 주지 않을 뿐만 아니라 미생.⑫ Vibrio 균속을 위한 배지- TCBS Agar선택성이 강한 Vibrio는 황색의 집락, 장염 Vibrio는 녹색 집락⑬ Amino산 분해 시험배지- MIO- SIM medium(sulfide indole motility medium)⑭ 탄소원으로써 유기산염의 이용 배지- Simmons Citrate 배지구연산염의 이용배지. 양성사면에 강한 청색을 나타내고 균이 발육한다. Sodium Citrate을 탄소원으로 이용할 수 있는 균이 자라므로 배지는 알칼리성으로 변화한 다. 음성균의 발육이 없고 녹색⑮ 확인 배지(Differntial medium: 동시에 수종의 성상검사가 가능한 배지)- Kligler Iron Agar(KIA)유당이 분해되면 배지 전체가 황변되고 glucose만 분해될 때에는 고층부만 황변되 고 gas 생성시에는 고층부에 구열이 생기며 기포가 형성된다. H2S 생성시에는 고 층부가 검게 변함.- Lysine Iron Agar대부분의 Salmonella arizona가 H2S와 decarboxylase양성 Proteus가 deaminase 양 성이다. H2S 양성은 고층부가 흑색으로 된다.- SIM 배지H2S 형성시 천자부위를 중심으로 흑색으로 변한다. 운동성 양성은 배지 전체가 혼탁된다. Indole 형성은 배지상에 Kovac's 시약 첨가로 적색의 ring이 형성된다.- Triple Sugar Iron Agar(TSI)그람음성 장내 병원성 세균의 동정에 쓰여지는 배지�� 균체외 효소(Extracellualr enzyme) 검사용 배지- DNA 분해시험용 배지DNase 양성균은 균의 집락 주위가 장미색으로 진한 pink색이고, 음성은 blue색이 다.- Gelatin 배지조성: Gelatin+Broth�� 운동성 검사용 배지 (motility test medium)- Motility Medium균을 needle로 중앙에 천자하여 배지 전체가 혼탁하면 운동성 양성, 천자선만 혼탁 하면 운동성 음성이다.- MIO Medium�� 당분해 관련미생물의 생장은 관찰되지 않는다. 이 시기는 접종균의 상태나 배지의 성장에 따라 다르다. 접종균이 새로운 환경에 적응하는 시기로 성 장에 필요한 효소나 세포 구성성분의 합성이 완비된 상태가 아니므로 이들의 재 합성이 이 루어 질 때까지 걸리는 시기이다.2 대수증식기세포의 수가 2의 지수적으로 증가하는 시기로, 미생물세포의 증식이 활발해진다. 이시기의 미생물의 생장률은 배지의 성분, 구비된 조건, 미생물 종류에 따라 달라진다.3 정지기미생물 증식의 결과 영양분이 고갈되고 대사산물이 노폐물로 축적되는 시기로 신생되는 세 포의 수와 사멸되는 세포의 수가 균형을 이루어, 생존 미생물의 수에는 별 변동이 없는 시 기 이다.4 사멸기생장정지기를 지나면 사멸하는 세포수가 보다 증가하여 생존 미생물의 수가 첨차로 줄어드 는 시기가 사멸기이다. 미생물 종류에 따라 사멸기의 기간이 다르다. 일반적으로 사멸된 균이 용해되기 까지는 상당한 기간이 걸리므로 사멸기 동안 생균수는 급격히 떨어지나 현 탁도는 서서히 떨어짐을 볼 수 있다.5 생장과 영양분의 농도영양분의 농도는 미생물의 총 생장뿐만 아니라 생장속도 에도 영향을 준다. 일정한 영양분 의 농도의 범위안에서 생장속도와 총 생장은 영양분의 농도에 비례한다. 그러나 최대에 다 달아 일정농도 이상을 넘어서게 되면 생장속도는 일정하게 유지되고 총 생장 수확량만 달 라진다.저농도의 영양분에서는 필요한 만큼의 세포물질의 합성이 일어나지 못한 결과, 생장수확량 이 적음을 이해할수 있다. 저농도의 영양분에서 생장수확량이 적음은 영양분의 부족으로 필요한 만큼의 세포물질의 합성이 일어나지 못한 결과로 이해된다. 저농도의 영양분에서 생장속도가 느림은 세포의 원활한 대사 합성에 요구되는 영양분의 양에 비해 세포막을 통 과하는 영양분의 양이 적기 때문인 것 같다. 다시 말하면 영양분 투과에 필요한 세포막의 운반체 부위가 완전 가동되기에는 영양분의 양이 미흡하여 생장속도가 느린 것 같다. 그러 나 영양분의 농도가 어느 한계를 넘어서면 세포의 대사능력은 것이다.- protease -Protease는 peptide 결합을 가수분해하는 효소로서, 단백질분자의 배부결합을 불규칙적으로 절단하는 endopeptidase와 peptide 사슬의 끝에서부터 아미노산을 한 분자씩 유리시키는 exopeptidase로 나눌 수 있다. 단백질의 펩티드 결합을 가수분해하는 효소이다. 두종류의 프로테아제의 존재가 확인되었는데, 그중 하나는 혈중의 플라스민과 동일한 것으로 생각된다. 최적 pH는 6.5∼9부근이며, 알칼리성에서 작용하는 알칼리성 프로테아제이다. 최적온도는 37 부근이다. 트립신과 유사한 작용을 나타내지만, 가열시에는 칼슘게 의하여 안정되지 않는 점이 다르다.단백질을 분해하는 효소는 여러가지가 있다. protease 라 불리는 단백질을 크게 두 부류로 나누면proteinse-펴타이드 결합의 가수 분해촉매.큰 분자의 단백질에 작용하여 폴리펴타이드를 생 성peptidase -작은 분자의 펴타이드에 작용하여 아미노산을 생성으로 분류할 수 있다.효소 활성을 측정하는 방법3가지의 방법이 있으며 Folin 시약에 의한 분광분석법에 대해 요약해 보면효소액을 가하지 인고 casein 과 완충액만 들은 것을 38도씨 60 분간 처리한 것에 0.5㎖ 을 섞고 즉시 TCA 3㎖ 를 첨가 하여 침전을 여과하고 그 여과액에 대하여 같은 방법으로 phenol 시약에 의한 발색조작을 실시한다 이 대조액을 비색계의 0 점 조절을 하고 파장 660㎚ 에 있어서의 시험액의 정색의 흡광도를 측정한다.효소역가가 크면 미반응 casein 의 양이 적다. 따라서 아미노산의 양이 증가하여 효소여가를 알 수 있는 것이다.Protease의 분류미생물의 단백질효소 가운데 균체 밖으로 분비되는 효소를 endopeptidase, 균체내에서만 존재하고 밖으로 분비되지 않는것이 expopeptidase 이다.1) 활성 중심의 구조에의한 분류serine proteinaseThiol proteinase금속 protease산성 proteinase2)acid proteinase끓인다.

자연과학| 2001.10.09| 17페이지| 1,000원| 조회(724)

단백질, 당, 환원당, 균생장

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