고체배양에서 미생물 도포 및 군락체 관찰목적고체 평판배지에서 획선 배양법을 이용해서 검체 중에 들어 있는 세균을 순수 분리 배양하고 계대배양하여 집락의 모양 및 특징을 익힌다.이론자연상태에서 많은 미생물들은 서로 혼합된 상태로 존재하는 경우가 많으므로 특정한 균을 순수한 상태로 얻기 위해서는 초기배양에서 각각의 균으로 떨어진 군락체(colony)를 만들어야 한다. 떨어진 하나의 군락체는 모두 동일한 성질을 가지고 있는 것으로 본다. 우리는 이런 목적으로 하는 배양을 분리배양(isolation, differential cultuer)이라하고 그중 다른균에 의하여 오염되지 않도록 하는 배양을 순수배양(pure cultuer)이라한다. 미생물의 특성이나 생화학적 성질을 연구하기 위해서는 순수분리배양이 필수적이다. 미생물의 순수배양에 가장 많이 사용하는 방법은 평판획선 배양법(streak plate method)과 혼합분주 배양법(pour plate methoh)이 있는데 본 실습에서는 평판획선 배양법을 익힌다.평판획선 배양법은 loop를 이용하여 평판배지의 표면에 획선 접종하는 방법으로 비교적 간편하고 빠르게 분리할 수 있는 방접이 있다.세균 집락의 관찰은 집락의 형태, 즉 집락의 표면, 가장자리, 고도 및 집락의 질, 색소생성능, 크기, 냄새등을 종합하여 균속들의 특성을 관찰하고 예비동정을 하게 되는 아주 중요한 과정이다.순수배양법의 종류① 획선배양사면재지에 배양하기 위한 기술로 화염멸균후 식은 백금이에 균을 따서 사면아래쪽 응고수에 접촉시키고 한 선을 긋고 지그재그로 그어 도말하고 배양한다.② 천자배양법고층한턴에 배양하는 경우, 백금선 끝에 균을 따서 배지 중앙에서 수직으로 천자한다.③ 액체배양법액체배지에서 배양할 때에는 관벽을 이용하여 소량의 균을 배지중에 넣는다. 표면배양의 경우는 균막을 액면에 띄우게 된다.재료1. 균주 (고체배지에서 18∼24시간 배양된 균주)2. Loop (백금이)3. Wax pencil4. Alcohol lamp5. 평판배지 (plate culture)※배지의 제조배지란 적당한 영양성분을 혼합해서 미생물을 생존시키고 지속적으로 증식시키기 위해서 인공적으로 증식환경이 만들어진 상태를 말한다.세균의 배양에 필요한 배지는 배양하고자 하는 미생물의 종류에 따라 가장 적합한 것을 선택하여 사용하여야 한다. 따라서 미생물의 종류와 배지의 구성성분에 따라 배지 제조법이 달라질 수 있다. 또한 배지는 단순히 비생물의 배양에만 쓰이는 것이 아니라 세균집락의 형태와 특성, 생화학적 특성, 당분해 성질, 유전적 특성, 미생물의 대사 등의 검사로 세균을 동절하고 미생물의 연구 등에 이용되기 때문에 배지의 선택, 구성성분, 제조방법에 따라 미생물 실험의 성패가 결정된다.실험방법1. 세균을 접종할 때 평판(plate)은 냉장고에서 꺼내 실온이 된 후에 사용한다.2. 멸균을 위해 실험테이블을 알코올로 닦고, 가운데에 알콜렘프를 켜놓는다.2. Loop를 화염멸균하여 공기 중에 식힌다.3. 배양된 균주를 1Loop 취한다.(평판에 배양된 균주를 채균시는 군락체 한 개에서 미량만 취한다.)4. 그림 B와 같이 1번지역에 획선 배양한다.5. 평판을 90°돌린 후 1번 구획과 약간 중첩이 되도록 3번 구획에 획선 배양한다.6. 다시 평판을 90°로 돌린 후 3번 구획과 약간 중첩이 되도록 4번 구획에 획선 배양한 다음 뚜껑을 덮어 엎어 놓는다.8. Loop는 화염멸균하여 rack에 꽃아둔다.9. 평판 뒷면에 균주명과 필요한 기록(이름, 날짜, 시간)을 한 후 37℃배양기에서 18∼24시간 배양한다. (배양시 항산 평판을 뒤집어 배양한다.)10. 단일군락체 형성을 관찰한다.미생물의 멸균속도 측정실험 목적미생물을 항온조에 넣고 시간이 지남에 따라 멸균되는 속도를 측정하는데 목적이 있다.이론멸균의 정의일반적으로 미생물 생장 억제는 미생물의 선장의 제한, 저해(inhibition), 또는 멸균(sterilization)에 의해 미생물을 파괴함으로써 일어나고, 성장 배지로부터 모든 살아 있는 미생물을 죽이거나 제거함으로써 일어나는 것이다.멸균속도 분석살아있는 균의 수(N)는 시간(t)이 지나면서 감소하는데 그 속도는 다음의 1차식을 따른다고 가정한다.{ dN} over {dt } = -kN이를 적분해서 변형하면,INT { dN} over {N } = -k INT dt,ln { N} over {N0 } = -kt,N = N0 { e}^{-kt }단, N0는 초기에 살아있는 세포수멸균의 분류미생물 실험실에서 배지 장비 및 유리기구 등에는 습윤멸균법, 유리기구, 그속기구 등과 같이 열에는 강하나 젖어서는 곤란한 것들은 건열멸균법, 열에 약하고 젖어서도 곤란한 것들은 광선조사법 또는 기체 며륜법, 그외 기체나 열에 약한 물질의 영액 점성이 낮은 연고류나 기름류는 여과법등이 이용되고 있다.재료1. 균주 (액체배지에서 18∼24시간 배양된 균주)2. micro pipet3. lead weait (플라스크를 물속에 잠기게 하기 위한 무게를 줌)4. 알콜램프5. 평판배지6. 삼각플라스크7. hockey stick (glass)8. semi-log 용지실험 방법① 미리 배양된 균을 제공받는다. (50ml 삼각플라스크)② 그 배양액에서 1ml를 취하여 109배로 희석하여 세포농도를 평판배지를 이용하여 측정한다.③ 배양액을 항온조에서 10분, 30분, 60분 멸균하여 세포농도를 평판배지를 이용하여 측정한다. (10분 멸균한 것은 배, 30분 멸균한 것은 배, 60분 멸균한 것은 배로 희석하여 측정한다.)④ 이를 배양기에 넣고 24시간 지난후 ccolony의 개수를 파악한다.세포생장에 미치는 pH 영향목적미생물 생장에 미치는 요소는 여러 가지가 있다. 그 중 애체배양에서 미생물 생장에 미치는 pH 영향을 측정한다.이론주위환경 조건에 따른 세균의 증식성은 매우 다양하며 여러 가지 영양소 즉, 매우 단순한 무기질에서부처 복잡한 유기질까지 이용하여 증식한다. 또한 세균 종류에 따라 온도, 산소의 유무, 산도(pH)등에 대한 적응력이 다양하다. 그러므로 세균 종류에 따라 배지의 구성성분 배양온도 산도(pH), 산소, 삼투압과 같은 물리 화학적인 조선이 잘 맞추어 주어야 세균이 증식한다. 미생물이 생육하기 위한 환경조건에서 특히 pH가 크게 작용한다. 대부분의 미생물은 중성에서 잘 자란다. 미생물의 종류에 따라 그의 생육최저 pH가 다른 것은 각 미생물이 갖는 효소의 최적 pH가 각각 다르기 때문이다.
