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Gram염색 평가B괜찮아요

그람염색1) 원칙그람염색은 세균의 형태, 크기, 배열, 그람염색상에 따라 세균을 분류하는데 가장 흔히 이용하는 염색 방법으로서 병인균의 신속한 예비 보고와 검체 질 평가에도 유용하게 사용된다. 그람염색은 1884년 Christian Gram이 최초로 개발한 이후 현재는 1921년 Hucker에 의해 시약의 안정성과 균종 감별이 개선된 방법이 사용되고 있다. 또한 혐기성 세균은 Hucker 변법으로 염색하면 쉽게 탈색되고 약하게 염색되므로 Kopeloff 변법을 사용할 수 있으며 Legionella spp., Campylobacter spp., Bacteroides spp., Fusobacterium spp., Brucella spp. 등과 같이 그람염색에 약하게 염색되는 그람음성 세균에 대하여 safranin 대신 carbol-fuchsin 또는 basic -fuchsin으로 대조염색하는 변법이 있다 (표1).표 1. 그람염색 종류{염색순서Hucker 방법Carbol-fuchsin 방법Kopeloff 방법시약시간시약시간시약시간1.염색제Crystal violet30초Crystal violet30초alkalinecrystal violet2-3분2.매염제Gram iodine30초Gram iodine30초Kopeloff iodine≥2분3.탈색제Acetone-alcohol≤5초95% ethanol≤30초Acetone-alcohol을3:7로 섞은 시약도포후즉시 세척4.대조염색Safranin 또는0.1-0.2% basicfuchsin30초Carbol-fuchsin또는 0.8% basicfuchsin≥1분Kopeloff의safranin10-30초세균은 세포벽 성분과 구조에 의해 그람 음성과 양성으로 분류되는데 그람양성세균은 peptidoglycan 층이 두껍고 teichoic acid의 양이 많기 때문에 탈색제인 알코올에 의해 영향을 받지 않아 보라색을 유지하지만 그람음성세균의 세포벽은 단일 peptidoglycan 층이 비대칭 리포다당질-인지질 이중막과 단백질이 섞어있는든다. 염색 시약의 저장 용액은 나사마개가 달린 갈색병에 보관하고 사용액 (working solution)을 플라스틱 병에 넣어 사용할 때는 2주마다 새로 갈아주어야 한다. 제조 시약은 순도가 높은 시약 등급 제품을 사용해야 한다.(1) Hucker 변법1 Crystal violetA. Crystal violet 저장용액Crystal violet(90-95%) 40gEthanol 400mlB. Ammonium oxalate 저장용액 (1%)Ammonium oxalate 16g증류수 1,600ml유리그릇에서 잘 섞은 다음 실온에서 보관하면 A와 B용액은 1년동안 사용할 수 있다. Ethanol은가연성 물질이므로 조심해서 다루어야 한다.C. Crystal violet 사용액Crystal violet 저장 용액 40mlAmmonium oxalate 저장 용액 (1%) 160ml유리그릇에 Crystal violet 저장 용액을 여과지로 완전히 여과시킨 후 ammonium oxalate 저장 용액을 여과시킨 다음 두 저장 용액의 유효기간 중 최근 날짜를 기록하여 병에 붙인다.2 Gram iodineA. Lugol iodine 저장 용액Iodine crystals 25gPotassium iodide 50g증류수 500ml갈색병에 넣고 용해될 때까지 잘 섞은 후 실온에 보관한다. 또는 iodine과 potassium iodide를 유발에 넣고 증류수 3-4 mL씩 넣으면서 갈은 후 완전히 녹은 뒤에 남은 증류수로 헹구어서 갈색병에 넣는다. 제조한 날로부터 6개월간 사용할 수 있다.B. Sodium bicarbonate (NaHCO3)Sodium bicarbonate (NaHCO3) 50g증류수 1000ml유리그릇에서 잘 섞은 다음 실온에서 보관하면 1년 동안 사용할 수 있다.C. Gram iodine 사용액Lugol iodine 저장 용액 60mlSodium bicarbonate (NaHCO3) 5% 60ml증류수 220ml갈색병에서 잘 섞은 후 실온에 보관한다. 6개월간.2g증류수 100ml갈색병에 basic fuchsin을 넣은 후 천천히 증류수를 넣은 다음 완전히 녹을 때까지 잘 섞는다. 실온에 보관하면 1년간 사용할 수 있다.(2) Carbol-fuchsin 대조염색Hucker 변법과 유사하나 탈색 방법과 대조염색 방법이 다르다. 탈색제는 95% ethanol을 사용하며 대조염색 시약은 carbol-fuchsin 또는 0.8% basic fuchsin을 사용한다.1 Carbol-fuchsin 대조염색액A. 용액 ABasic fuchsin 0.3gEthanol, 95% 10mlBasic fuchsin과 ethanol을 갈색병에 넣고 용해시킨다.B. 용액 BPhenol 결정 녹인 것 5ml증류수 95ml플라스크에 증류수를 넣고 phenol 결정 녹인 용액을 첨가한다. 용액 A에 용액 B를 넣은 후 실온에 보관하면 1년간 사용할 수 있다.2 0.8% basic fuchsin 대조염색액Basic fuchsin 0.8g증류수 100mlBasic fuchsin을 갈색병에 넣고 basic fuchsin이 완전히 용해되도록 증류수를 조금씩 첨가하면서 잘 섞는다. 실온에 보관하면 1년간 사용할 수 있다.(3) 혐기성 세균을 위한 Kopeloff 변법1 Alkaline crystal violetA. 용액 ACrystal violet (90-95%) 10g증류수 1,000ml유리그릇에서 잘 섞은 다음 실온에서 보관하면 1년 동안 사용할 수 있다.B. 용액 B: Sodium bicarbonate (NaHCO3)Sodium bicarbonate(NaHCO3) 50g증류수 1,000ml2 Kopeloff iodineSodium hydroxide (NaOH) 4g증류수 25mlIodine crystal 20gPotassium iodide 1g증류수 975mlNaOH를 25 mL의 증류수로 녹여 갈색병에 넣고 iodine crystal과 potassium iodide를 첨가한 다음 잘 섞은 후 975 mL 증류수를 조금씩 첨가하면서 잘 섞는다.3 과가 부정확할 때는 원인을 찾아내어 해결해야한다. 그람양성세균이 흐리게 염색되거나 그람음성간균에 crystal violet가 묻어 있을 때 또는 도말 표본의 가장자리에만 염색이 됐을 때는 검체의 도말 제작, 염색 시약 및 염색 과정에 문제가 있을 때 발생한다.다음은 질이 나쁜 염색결과의 흔한 원인들이다.1 재생 슬라이드를 깨끗이 닦지 않고 사용하거나 새 슬라이드에 묻어 있는 기름기를 제거하지 않고 염색을 시행했을 때2 검체를 너무 두껍게 도말했을 때3 슬라이드를 과열하여 고정했을 때4 염색 과정 중에 세척을 오래하거나 강하게 했을 때(4) 그람염색의 결과 보고를 다시 확인하는 체계를 구축하여 그람염색 판독의 정확성을 유지한다.1 책임자 또는 부서장은 매일 그람염색 표본을 추출한 후 결과를 확인하는 작업을 시행하여 검사자 교육의 필요성을 결정하거나 임상적 연관성에 대한 조언을 주는데 도움을 줄 수 있다.2 최종 배양 결과와 그람염색 결과를 비교한다. 그람염색에서 관찰된 균 형태는 배양에서도 분리 되어야 하며 그람염색에서 보고되지 않은 균종이 분리되면 염색과 배양 결과를 다시 확인해야 한다. 그러나 그람염색에서 관찰되지 않아도 배양에서는 분리될 수 있다.3 참고가 되는 표준 슬라이드는 직원의 교육과 결과 비교에 매우 중요하다.4) 도말(1) 도말 표본 제작의 기본적인 원칙좋은 도말 표본은 균종이 조밀하여 쉽게 관찰할 수 있으며 균종의 배열형태를 확인할 수 있을 정도의 단일막 두께로 제작해야 한다. 깨끗한 새 슬라이드 [(25 X 75 mm (1 X 3 inch)]를 알코올이 담져진 용기에 보관한 후 사용 전에 꺼내어 공기 중에 말리거나 가열한 다음 사용하면 가장 좋은 결과를 얻을 수 있다. 슬라이드 한쪽 끝이 반투명 유리로 제작된 것은 작업번호의 기입과 조작에 편리하다. 도말 표본 제작을 위하여 검체를 다룰 때에는 라텍스 장갑과 일반적인 주의사항에 맞는 보호장비를 착용해야 한다.(2) 임상 검체별 도말 표본 제작1 면봉A. 세포 성분과 균배열 형태가 파괴되지 않도되므로 보다 신속한 결과를 얻을 수 있는 장점이 있다.B. 원심분리법피펫으로 침전물이 0.5 mL 정도 남게 상청액을 제거한 후 상청액은 멸균 관에 담고 침전물은 진탕하거나 Pasteur 피펫으로 빨기와 뿜기를 몇 번하여 섞은 다음 Pasteur 피펫으로 침전물 한 방울을 슬라이드 위에 떨어뜨린 후 공기 중에서 말린다. 주의할 점은 침전물을 펼쳐서 도말 하면 안되며 세균 관찰을 쉽게 하기 위해 검체 농도를 농축하려면 처음 위치에 침전물 한 방울을 다시 떨어뜨려 겹치게 한다.4 요요 검체는 원심분리하지 않고 잘 섞은 후 Pasteur 피펫으로 한 방울을 슬라이드에 떨어뜨린 다음 공기 중에서 말리며 펼쳐서 도말하면 안된다.5 마른 검체 또는 양이 적은 검체멸균 식염수 0.5 mL로 검체를 유화 시킨 후 Pasteur 피펫으로 한 방울을 슬라이드에 떨어뜨린 다음 피펫 끝으로 검체를 펼쳐 면이 고른 얇은 도말을 만든다.6 생검과 조직터치 도말로 표본을 만들거나 조직을 균질화 시킨 후 표본을 만들 수 있다. 도말 제작 전에 조직을 균질화하면 종종 세포의 특징적인 모양과 배열형태를 관찰할 수 없다. 터치 도말 표본은 검체를 페트리 접시 위에 놓고 수술용 칼로 조직을 잘게 썲은 후 조각난 검체를 집게로 잡아 슬라이드 위에 문지른다. 조직의 균질화 후에 얻은 검체는 피펫으로 한 방울을 취하여 슬라이드에 떨어뜨린 다음 슬라이드의 1/4정도 넓이로 펼친다.(3) 액체배지로 도말 표본을 제작하는 방법액체배양배지의 도말은 한 개의 슬라이드에 여러 배지를 도말하면 염색과정 중에 한쪽이 다른 쪽으로 씻겨 내려갈 수 있으므로 한 개의 슬라이드에 한 개의 도말 표본을 만드는 것이 좋다. 도말 방법은 Past-eur 피펫으로 배지 한두 방울을 슬라이드에 떨어뜨린 후 얇게 펼친다. 혈액 배양용 배지에 부착된 통기바늘을 이용하면 조작 과정 중에 발생할 수 있는 오염 가능성을 줄일 수 있다.(4) 고체배지의 집락으로 도말 표본을 제작하는 방법증류수는 세포벽이 약한 균종의 형태를 변형시킬 수 있으

자연과학| 2001.04.29| 7페이지| 1,000원| 조회(1,959)

그람염색, 그람, gram

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