1. 실험원리그람염색은 세균의 형태, 크기, 배열, 그람염색상에 따라 세균을 분류하는데 가장 흔히 이용하는 염색 방법으로서 병인균의 신속한 예비 보고와 검체 질 평가에도 유용하게 사용된다. 그람염색은 1884년 Christian Gram이 최초로 개발한 이후 현재는 1921년 Hucker에 의해 시약의 안정성과 균종 감별이 개선된 방법이 사용되고 있다.세균은 세포벽 성분과 구조에 의해 그람 음성과 양성으로 분류되는데 그람양성세균은 peptidoglycan 층이 두껍기 때문에 탈색제인 알코올에 의해 영향을 받지 않아 보라색을 유지하지만 그람음성세균의 세포벽은 단일 peptidoglycan 층이 비대칭 리포다당질-인지질 이중막과 단백질이 섞어있는 외막 아래에 붙어있기 때문에 외막이 알코올에 의해 손상을 받으면 crystal violet-iodine 복합체가 떨어진 후 대조염색 시약으로 교체된다. 그러나 그람염색 결과는 균주의 배양 기간, 배지 성분, 배양 환경, 염색 방법, 항균제 사용, 억제인자 등에 의해 영향을 받을 수 있다는 점을 항상 고려해야 한다. 그람염색 도말 표본은 각종 임상 검체, 액체배지 또는 평판배지에서 분리된 집락으로 만들 수 있으며 비선택배지에서 24시간 미만 배양된 집락이나 신선한 검체가 가장 좋은 결과를 나타낸다. 세균의 형태 관찰에 액체배지 도말 표본이 필요한 경우도 있다. 매염제인 iodine은 crystal violet를 세포벽에 결합시키는 역할을 한다.Gram positive(G+) bacteria: 포도상구균, 연쇄상구균, 결핵균, 유산균 파상풍균 등Gram negative(G-) bacteria: 대장균, 살모넬라, 페스트균, 이질균 등시약그람염색 시약은 상품화된 것을 사용하거나 검사실에서 만들어 쓸 수 있다.염색 시약의 저장 용액은 나사마개가 달린 갈색병에 보관하고 사용액 (working solution)을 플라스틱 병에 넣어 사용할 때는 2주마다 새로 갈아주어야 한다. 제조 시약은 순도가 높은 시약 등급 제품을 사용해야 한다sium iodide는 부식성이 있으므로 흡인과 피부접촉을 피해야 하며 실수로 마시는 일이 없어야 한다.탈색제탈색제는 종류에 따라 95% ethanol의 탈색 속도가 가장 느리고 acetone이 가장 빠르며 95%ethanol과 acetone을 1:1의 비율로 혼합한 용액이 일관성 있는 결과를 주므로 가장 흔히 사용한다. 95% ethanol은 학생이나 비숙련자의 교육용으로 적합하며 acetone은 재현성이 낮으므로 숙련자만 사용이 가능하다. Ethanol과 acetone 모두 가연성 물질이므로 화기가 없는 상태에서 두 용액을 혼합해야 한다.대조염색SafraninSafranin O 5.0gEthanol, 95% 220ml유리그릇에서 잘 섞은 후 실온에서 보관하면 1년 동안 사용할 수 있다.?그람 염색법의 한계① 실험 방법상의 오류처음 세포를 고정할 때 지나치게 강한 열처리를 하거나, 알코올로 탈색하는 것을 지나치게 오래하거나, 세척을 너무 강하게 하면 그람 양성균도 CV-I 복합체(크리스탈 바이올렛 또는 메틸바이올렛-요오드 복합)를 상실하여 그람 음성처럼 보일 수 있다.② 세포의 상태24시간 이상 배양된 세균 세포, 즉 대수기가 아니라 정상기나 사멸기의 상태에 있는 오래된 세균은 그람양성균이 음성균처럼 염색될 수 있다. 이 염색법은 기술이 미숙하면 그릇되게 판정하기 쉬우므로 숙련될 때까지 많은 연습이 필요하다. 또 어린 배양균은 염색성이 좋으나 노쇠기 배양균은 염색성이 좋지 않아 gram 양성균이 음성균같이 보일 때가 많으므로 주의하여야 한다.③ 세균 자체의 특성그람 양성균도 CV-I 복합체를 세포 내에 가두는 능력에 차이가 있어 쉽게 잃어버리는 그람 양성균은 음성균처럼 염색될 수 있다. 따라서 실험 수행과 결과분석을 신중하게 하여야한다.2.실험재료crystal violet 염색용액, Lugol's 용액(요오드 용액), 95% ethanol, 사프라닌 염색액, 증류수, 스포이드, slide glass, cover glass, 접종 루프, 여과지, 알콜램프, 현h를 열고 루프를 사용하여 한 개의 colony를 살짝 찍어서 깨끗한 slide glass에 E.coli를 묻힌다. 루프를 내려놓기 전에 불꽃으로 달구어준다.마르는 동안 다른 slide glass에 위와 같은 방법으로 다른 균들을 옮긴다. 다 마르면 slide glass를 알콜램프의 불꽃 위에서 불꽃 중심을 2～3번 통과시키면서 열고정시킨다. bacteria위에 crystal violet 몇 방울을 떨어뜨린다. 1분 후 물로 가볍게 세척한다. Lugol's 용액을 몇 방울 떨어뜨린다. 1분 후 물로 가볍게 세척한다.95% ethanol로 10～20초 동안 탈색시킨다. 그런 다음 물로 세척한다. 30초 동안 사프라닌으로 염색한 후 다량의 물로 남아있는 염색물질을 제거한다. 여과지로 가볍게 찍어낸 다음 공기 중에 말린다. 현미경으로 관찰한다.4.실험결과5.고찰Bacillus subtilis: B. subtilis는 흔히 '고초균'이라고도 하며 주로 토양 속에서 서식하며 Bacillus속에 속하는 균으로서 그람 양성(Gram positive)의 아포 형성 균이다. 호기성이며, 주모성 편모를 가지고 운동을 한다. 아포는 난원형이며, 중앙에 위치한다. 또한 한국인에게는 청국장의 발효 미생물로서 관계가 깊을 뿐만 아니라 여러 미생물 제제로서도 이용되고 있다. 또한 유전공학에서 재 조합 DNA기술의 플라스미드(Plasmid)로서의 이용으로 매우 중요하게 사용되고 있다. 이는 플라스미드(Plasmid)는 유전 조작된 미생물 공정의 핵심 구성요소이기 때문이다. Bacillus는 이러한 플라스미드(Plasmid)에 사용되는 숙주(Host)로서 E. coli와 더불어 가장 많이 사용되는 균주이다.Escherichia coli:대장균이라고도 한다. 항원구조에 의해 구별하면, O항원에서 1～136, K항원에서 1～78, H항원에서 1～40으로 분류된다. 대장균은 장 속에서는 병원성을 나타내지 않는 것이 보통이지만, 장 이외의 부위에 들어가면 방광염 ?신우염 ?복막염 ?패혈증 등을 일이 둥글고 길이 2～4μm, 나비 0.4～0.7μm의 간균으로 편모를 가지고 있어 운동성이 있다. 포자를 만들지 않으며, 그람음성균이다. 형태학적으로 적리균(赤痢菌)과 구별하기 어렵지만, 생물학적으로 대장균은 젖당 및 포도당을 분해하여 산과 가스를 생성시키고 우유를 응고시켜 인돌(indole)을 만든다. 또한, 대장균의 존재 여부는 분변에 의한 오염 유무가 지표가 되며, 수질검사 등에 종종 응용되는 수단으로 위생학상 중요하다.crystal violet 염색용액: 보라색의 색소 중에서 순수한 결정으로 최초로 얻어진 것이다. 디메틸아닐린과 포스겐을 염화아연을 촉매로 하여 축합하여 얻는다. 견뢰한 염료는 아니지만 빛깔이 선명하고 값이 싸므로 명주 ?양모 등의 염색 외에 색연필 ?잉크 등의 착색에 사용된다. 또는 pH1.5 부근에서 산형(酸形)의 녹색으로부터 염기형의 청색으로 변하므로 산염기의 지시약으로 사용Lugol's 용액: 요오드팅크 등 의약품의 제조에 사용되며, 분석화학에서 표준시약으로 중요하다. 승화하기 쉬우므로 밀폐용기에 저장한다. 극약이므로 주의해야 한다. 여기서는 염색물질과 복합체를 이룬다.ethanol:각종 알코올 음료 속에 함유되어 있어 주정(酒精)이라고도 하고, 또 에틸알코올이라고도 한다. 보통 알코올이라고 하면 이 에탄올을 가리킨다. 술의 성분으로서 예전부터 알려져 있었으나, 술이 취하는 원인이 에탄올에 있다는 것을 안 것은 15세기 이후의 일이다. 조성(組成)은 처음에 라부아지에나 N.T.소슈르 등에 의해 측정되고, 게이뤼삭이나 J.B.뒤마 등에 의해서 확정되었다. 알코올이라는 이름은 원래 눈썹에 칠하는 흑색 안료(顔料)를 가리키는 아라비아어(語)였는데, 이것의 미소분말을 만드는 데 승화법을 사용한 데서 술을 증류하여 가연성 엑스를 만드는 것으로 전화(轉化)하고, 이것이 다시 증류물을 가리키는 말이 되었다. 알코올이라는 말이 에탄올을 가리키게 되고, 다시 알코올 전반을 가리키게 된 것은 19세기 이후의 일이다. 에탄올을 복용하면 대뇌(大腦)의 모양을 지지하고 내부의 높은 삼투압을 유지시켜 주는데 필수적이다. peptidoglycan은 사람 세포에는 없고 세균에만 있으므로 항균제의 좋은 공격 목표가 된다. 분비물에 있는 lysozyme도 peptidoglycan을 공격한다. 또한 그람 양성세균과 음성세균 사이에 구조가 다르므로 그람 염색을 이용한 세균의 분류에 이용되기도 한다.그람양성 세균에서는 peptidoglycan 층이 매우 두껍다(×100). 일부의 그람 양성균은 세포벽을 관통하면서 외부에 노출되는 teichoic acid가 있다. teichoic acid는 그람 양성 세균에서 항원성을 나타내고 특이 항체를 만들어낸다. 생리적인 구실은 불확실하다. 그람 음성 세균에서는 peptidoglycan 층이 한 층이나 많아야 2층으로얇다. peptidoglycan의 바깥에 lipoprotein, phospholipid, lipopolysaccharide로 이루어진 층을 가진다. 그리고 세포벽의인지질 층과 세포막의 인지질층 사이에 'periplasmic space'라는 공간이 있는데, 여기에 b-lactamase가 있다. lipopolysaccharide는 septic shock의 원인인 endotoxin으로, lipid A, core polysaccharide, outer polysaccharide로 이루어진다. 이중 lipid A가 독성을 나타낸다. outer polysaccharide는 3～5개의 당이 반복되는 구조를 가진 것으로, 세균에 따라 독특하여 동정하는데 이용하는 항원으로 쓰인다(somatic or "O" antigen). porin은 영양 물질이 투과되는 곳이다. 항균제도이곳을 통하여 들어가는 것이있다. 그래서 porin의 크기가 변하든지 아니면 porin이 없어져서 항균제에 내성을 보이는 경우가 있다. 그람 염색의 탈색 과정에서 그람음성 세균은 세포벽의 지질함량이 높기 때문에 처음 염색한 crystalviolet이 탈색되고 후염색인 safranin이나 carbol fuschin에 의해없다.
![[미생물] Gram stainig and negative staining](https://image4.happycampus.com/Production/thumbnail/2004/05/30/data2864618-0001.jpg)
