1. 실험 주제: 화장품제조2. 실험 목적: 스테아르산을 이용하여 화장용 크림(vanishing cream)을 만들고 화장크림의 성질을 안다.3. 이론 및 원리(1)이론1) 화장품화장품은 화학 물질을 혼합한 것이어서 콜로이드상의 것이 많으며, 유화가용화, 색 재료 및 분체의 분산, 분체로의 향료의 흡착과 인간의 체내와 외계와의 계면에 이르는 피부면, 그 피부 면에 대한 화장품의 부착성이나 탈착작용 등은 계면화학에 기초가 된다.화장품의 대부분은 분산액이고, 이와 같은 분산계의 화학은 콜로이드 화학이다. 화장품 원료로는 밀납, 유지 등이 그 유도체가 점유비율이 크므로, 대부분의 화장품에서 기재나 원료로 사용하며, 계면활성제, 색 재료, 생약 추출물 향료가 점유하는 위치도 중요하다. 계면활성제는 유화, 가용화, 침투, 젖음, 분산, 세정의 작용 이외에 보습, 살균, 윤활, 대전 방지, 유연, 기포, 소포의 역할도 갖는다.2) 베니싱 크림(Vanishing Cream)유성분이 적게 들어 있는 크림 화장품으로, 피부에 바르면 거의 피부 속에 흡수되어 배니시(vanish:사라지다)라는 명칭이 붙었다. 물과 스테아르산(酸)에 알칼리를 넣어 유화시키고 글리세롤 등의 습윤제를 첨가하여 만든다. 지성피부에 주로 사용한다.(2)원리1)가용화 현상녹아 있는 용질을 가용화제라고 한다. 계면활성제는 가용화제로 알려져 있는데, 계면활성제가 임계 미셀 농도 이상일 때는 물 속에서 거의 녹지 않는 유용성 염료(油溶性染料)도 상당한 용해도를 나타내며, 가용화량은 활성제 농도에 비례한다. 이 경우 유용성 염료는 활성제 미셀의 내부 또는 표면의 소수성(疎水性) 부분에 흡수된다. 가용화제는 저분자 활성제뿐만 아니라 수용성 고분자에서도 작용을 하는 것이 많다. 고분자 전해질인 폴리소프(polysoap)는 용액 속에서 용매 분자와의 상호작용이나 하전기의 이온화도·분포 상태에 따라 그 형태가 규정되지만, 소수기 부분이 모여서 소수성의 영역을 형성하고, 그 곳에 소수성 화합물을 둘러싸면서 가용화를 이룬다.폴리비닐알코올·폴리메타크릴산·폴리에틸렌이민·폴리스티렌술폰산 등 합성 고분자, 혈청알부민·β-락토글로불린·DNA·인슐린 등 생체 고분자의 가용화력도 알려져 있다. 방향족 술폰산·방향족 카르복시산·페놀류·알코올류·피롤리돈류·요소류를 다량으로 첨가하여 물에 잘 녹지 않는 물질의 용해도를 증가시키는 현상을 하이드로트로피라고 한다. 난용성 물질이 계면활성제의 미셀 중에 용해된 것이 있고, 화장수는 이 기술을 응용시킨 것이다. 유용성 비타민이나 호르몬 등을 가용화하여 수용성으로 바꾸거나 페놀류 등 살균제와 혼용하여 효과를 증가시키는 방법, 에멀션 중합을 촉진하는 방법 등 공업적으로 널리 응용하고 있다.2)계면활성제표면활성제라고도 한다. 비누는 그 대표적인 것으로, 비눗물의 표면장력은 물에 비하여 훨씬 작다. 이것은 비누가 물의 표면에 모여 표면을 되도록 넓게 하려고 하기 때문인 것으로 알려져 있다. 비누가 물의 표면에 잘 모이는 성질은, 비누의 분자(예를 들면, 스테아르산나트륨) 속에 긴 사슬 모양의 알킬기(基)와 같은 친유성(親油性)의 기와 카르복시기와 같은 친수성의 기가 들어 있어, 친유성의 기는 물의 반발을 받아 표면으로 가기 때문에 생긴다.보통 1분자 속에 친유기와 친수기가 함께 들어 있는 양쪽 친매성(親媒性)인 물질은 계면활성제가 될 수 있다. 계면활성제 중 수용액에서 이온화하여 활성제의 주체가 음이온이 되는 것을 음이온 계면활성제라고 하는데, 비누·알킬벤젠술폰산염 등이 이에 속한다. 또, 이온화하여 양이온이 되는 것을 양이온 계면활성제라 하는데, 고급아민할로겐화물·제사암모늄염·알킬피리디늄염 등이 이에 속한다. 또한 양쪽이 다 되는 것을 양쪽성 계면활성제라고 하는데, 여기에는 아미노산 등이 속한다.한편, 전리하지 않는 것을 비(非)이온 계면활성제라 하여 구별하기도 하는데, 여기에는 폴리에틸렌글리콜류 등이 속한다. 계면활성제는 일반적으로 세척력·에멀션화력·분산력·삼투력·기포력(起泡力) 등을 지니고 있어, 각기 그 특성에 따라 세척제·섬유처리제·에멀션화제·부유선광제(浮遊選鑛劑)·시멘트용 기포제·윤활유 첨가제·살균제·도료분산제(塗料分散劑) 등으로 널리 이용되고 있다.3) 유화(emulsification)액체 중에서 다른 액체가 분산이 있는 것에서, 이러한 용액을 유탁액(emulsion)이라하고, 수중유형(oil in water, O/W)과 유중수형(water in oil, W/O)이 있다. 에멀젼이 O/W형과 같이 이용한 계면활성제의 친유기와 친수기의 크기와 구조의 평형 (hydrophile-lipophile-balance, HLB), 온도, 그리고 첨가순서 등의 영향을 받고, 이용된 계면활성제의 HLB 가치가 낮은 때는 W/O형, 높은 때는 O/W형이 된다.4) 젖음 현상고체면을 어떤 액체가 적시면, 액체 자신의 응집에 이겨서 고체 표면으로 퍼지는 현상이고, 고체의 미립자가 액체로의 분산된 소위 현탁을 하기 위 해 중요하다.
1. 실험 주제: 세포배양2. 실험 목적: 세포 배양의 배경과 원리를 습득하고, 조작할 수 있다.3. 이론 및 원리(1)배양의 정의배양이란 생물체(주로 미생물 및 발생중인 동식물의 배)나 생물체의 일부(기관 ·조직 ·세포 등)를 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 일을 말한다.배양은 사용구조에 따라 기관 배양(organ culture), 조직 배양(tissue culture), 세포 배양(cell culture)으로 나뉘며, 세포 종류에 따라 초대 배양(primary culture), 세포주 배양(cell line culture) 등이 있다.?세포배양(cell culture)의 정의생물체의 조직으로부터 분리된 세포를 배양하는 것으로 식물에서는 캘러스 일부를 액체배양하거나 동식물의 종양 세포를 배양하는 일이 흔하다. 세포배양으로 얻은 세포군이 경우에 따라서는 1개의 개체로 생장하기도 한다.?캘러스 (callus)식물체에 상처가 났을 때 생기는 조직으로 유상조직(癒傷組織)·유합조직·칼루스라고도 한다.(2)배양세포1)배양 세포의 정의동식물의 조직에서 떼어 내 인공적인 조건에서 배양한 세포2)배양 세포의 종류①정상 세포° 개체로부터 떨어져 나온 정상 구조와 기능을 가진 수명이 한정된 세포° 분열 횟수가 증가함에 따라 노화, 세포의 성질이 시간 경과에 따라 변화해 간다.° 대량 배양→동결 스톡→세포 해동→ 일정한 계대 배양 →실험에 제공° 유한증식(limited proliferation) : 사람 태아세포라도 50대가 한정②불멸화 세포(immortalized cells)° 세포를 어떤 조건하에 배양하면 정상세포로 무한증식할 수 있는 능력을 지니는데이를 불멸화세포라 한다.° 세포수립주(cell line)이라 한다③형질전환 세포(transformed cell)° 불멸화 세포에 발암물질 또는 방사선 등을 작용시키면 형태가 암세포와 같이 변화되어 나타나기도 한다(3)세포 성장 및 증식①지체기/ 유도기 (Lag Phase)미생물을 처음 새로운 배양액에 접종하면 세포하지 않는 초기를 지체기(lag phase)라 한다. 세포분열이 즉각적으로 일어나지는 않지만 이 시기 동안 세포에서는 새로운 구성성분이 합성된다. 새로운 배지에 접종된 세포는 대개 ATP, 필수적인 보조인자, 리보좀 등이 부족하기 때문에 생장을 시작하려면 이러한 성분을 합성해야만 한다. 또한 새로운 배지에 다른 영양물질을 사용하는 데 필요한 새로운 효소가 없다면 이를 합성해야 한다. 따라서 지체기가 생기게 되는 것이다.°접종균이 새로운 환경에 적응하는 시기°성장에 필요한 효소나 세포 구성성분의 합성이 완비되지 않은 상태→재합성이 이루어 질 때까지 걸리는 시기°대사가 왕성한 균은 유도기가 짧으며, 노후된 균일수록 유도기가 길다.②증식기/ 로그 대수기 (Log Phase), 대수증식기 (exponential phase)대수기(exponential phase, log phase) 동안 미생물은 종의 유전적인 특성, 배지의 조성 및 생장 조건 아래에서 분열할 수 있는 최고의 속도로 성장하고 분열한다. 대수기 동안 생장속도는 일정하게 나타나서 일정한 간격으로 숫자가 두 배로 증가한다. 모든 세포가 동시에 분열하는 것이 아니기 때문에 생장곡선은 비연속적으로 증가하지 않고 부드러운 곡선을 그리며 증가한다.°세포의 수가 2의 지수적으로 증가하는 시기°미생물 세포의 증식이 활발°미생물의 생장률: 배지의 성분, 구비된 조건, 미생물의 종류에 따라 달라진다.③안정기/ 정지기 (stationary phase)미생물 집단의 생장이 멈추면 생장곡선은 수평선을 이룬다. 이런 정지기(stationary phase)에서 미생물의 총 생균수는 일정하다. 이는 세포분열과 세포의 사멸이 평형을 이루거나 또는 집단의 세포가 대사적인 활성을 유지한 채로 단순히 분열을 멈추는 경우에 나타난다.°영양분의 고갈, 대사산물의 축적 시기°신생되는 세포의 수 =사멸되는 세포의 수°생존 미생물의 수 :변동 없는 시기④사멸기(death phase)영양분의 고갈, 독성 노폐물의 축적과 같은 불리한 환경의 변화가 일 phase)에 이른다. 미생물 집단의 사멸은 대수기의 생장과 마찬가지로 대수적으로, 매 시간 일정한 부분이 사멸한다. 이런 현상은 생균수를 측정해야 잘 알 수 있는데, 세포가 죽은 다음에도 파괴되지 않는다면 생균수의 감소를 알 수 없기 때문에 판단하기가 쉽지않다. 따라서 이러한 경우에는 새로운 배양액에 옮겨서 키워서 생균수가 감소의 여부를 판단할 수 있다.°사멸 세포수의 증가 → 생존 미생물의 수 감소시기°미생물의 종류에 따라 사멸기의 기간이 다르다(4) 세포 배양의 필요조건①무균상태배양액중에는 다량의 영양물질이 포함되어 있으므로 미생물이 혼임되면 배양하려고 하는 세포보다 분열시간이 짧기때문에 빠른 속도로 증식하게 된다. 그결과, 배양액 중의 영양 물질질의 소비대사에 의한 pH의 저하, 또는 배양세포에 유해한 물질의 생산에 의해 목적했던 세포는 사멸한다. 그러므로 사용하는 배양액, 기구류, 조작장소 및 첨가물질등은 전부 무균상태이어야 한다.*Cleanbench:무균조작을 위한 작업대②온도세포에는 적정온도가 있으며 유래한 종에 따라 다르다. 일반적으로 적정온도보다 높은 경우에는 급속히 사멸해버리지만 낮은 온도에서는 사멸하지 않는 경우가 많다.③pH대부분의 세포는 pH7.2 - 7.4에서 가장 잘 증식한다 세포에따라 정도의 차이는 있으나 pH6.8-7.6사이라면 성장가능하다.pH6.6이하 또는 7.8이상일 경우에는 24시간 이내에 사멸한다.*CO2 incubator동물 세포 배양 기간 동안 배양 배지 내 pH는 일반적으로 액상 배지의 한 성분인 NaHCO3와 CO2 기체와의 평형에 의해 배지의 pH가 일정하게 조절④삼투압포유동물세포의 적정 삼투압은 약 7.6기압이다. 세포는 의외로 삼투압의 변화에 강한데 10%전후의 변화로는 거의 영향을 받지 않는다. 또 서서히 삼투압을 변화시키는 경우에는 더 큰 변화에도 크게 영향을 받지 않는다. 흔히 사용되는 배양액의 삼투압은 식염 및 포도당으로 조절되어있다.⑤영양원탄수화물, 아미노산, 비타민, 펩타이드 및 단백질은 필수영양스도 불가결한성분이다. 세포에 따라서는 어떤 종류의 호르몬 또는 보효소를 필요로하거나 nucleoside의 첨가에의해 증식성이 높아지는 것도 있다.세포의 종류나 연구의 목적에 따라 이들 각 성분을 적당히 배합한 여러가지 배양액이 개발되어있다. 최근에는 화학적으로 조성이 판명되어있는 합성배지가 많이 사용된다.그러나 합성배지만으로 세포를 증식시키는 것은 일반적으로 어려우며 각종 혈청을 비롯한 생물 유래 용액을 첨가하는 수가 많다. 그중에서도 혈청이 가장 중요한 첨가물이며 사람, 소, 말 원숭이, 닭 등의 혈청이 사용된다.⑥배양용기부유상태에서 증식하는 세포는 별도로 치더라도 많은 종류의 세포들은 배양용기의 벽면에 부착하지 않으면 잘 자라지 않는다. 그러므로 벽면에의 세포부착성이 뛰어난 배양용기를 사용할 필요가 있다.(5)세포 수 계산법(cell counting)?Hemacytometer를 이용하여 세포수 세기hemacytometer 내에 있는 모눈에서 구분되는 9개의 영역 중 아래 그림과 같은 5곳을 택하여 세포의 수를 counter를 이용하여 센다. Hemacytometer에는 이런 모눈이 2개가 있으므로 총 10곳의 세포수를 세게 된다.눈금의 테두리에 동물세포가 걸려있는 경우에 세포수를 세는 방법이 몇 가지 가 있는데, 흔히 사용되는 방법으로 눈금의 테두리에 ㄴ자나 ㄱ자 모양을 그려서 ㄴ자나 ㄱ자에 들어가는 세포만 세는 것이다. 눈금의 테두리 4곳에 있는 세포를 모두 세면 세포를 두 번 세는 경우가 생기는데, 이를 예방하기 위해 눈금의 테두리 4곳 중 일정하게 2곳 선택하여 ㄴ자(왼쪽과 아래)나 ㄱ자(위와 오른쪽)를 그리면서 세포수를 센다.X × 2 ÷ 4 = YX : 세어진 세포의 총 숫자Y : 최종 계산된 튜브안의 세포 농도× 2 : Trypan-blue로 염색, 희석÷ 4 : hemacytometer 4부분의 평균계산된 Y×104 cell/ml 이 tube안 세포의 농도ex) hemacytometer 네 부분에서 전부 150개가 관찰 되었다면,150 × 2 75 ×104 cells/ml.이중 한 개의 well에 2000개의 세포를 분주하고 싶다면, 다음과 같이 계산,세포와 DMEM(+)가 포함된 sol'n을 계산된 Z 만큼 culture dish에 넣어 주면 됨.(6)계대배양 (subculture)1)계대배양의 정의세포 증식을 위해 새로운 배양접시에 옮겨 세포의 대(代)를 계속 이어서 배양하는 방법으로, 이것은 제한된 배양접시 내에서 세포가 증식을 멈추게 되므로 이것을 막고 세포가 증식할 수 있게끔 새로운 공간을 제공하는 것이다.2)계대배양의 종류①부유세포혈구와 같은 일부 세포들은 배지 중에 지속적으로 부유 상태로 증식하며, 필요에 따라서 부착 세포이더라도 기계적으로 부유 상태를 유지하며 증식시킬 수 있다. 부유 세포 배양은 세균과 유사하게 계대 배양을 한다. 즉, 탈착 과정(trypsin처리 등)을 필요로 하지 않으며 전체적으로 부착보다 시간이 더 적게 소요된다. 세포를 유지하기 위해서는 주로 배양 세포를 희석시킴으로서, 또는 계대 배양없이 단순히 배지의 양을 증가시킴으로써 지속적으로 배양할 수 있다. 부유 배양에서는 배양액의 희석을 지속적으로 하여 세포 농도가 항상 일정하도록 유지할 수 있다면 세포 증식의 steady state에 도달할 수 있는데 이 steady state의 달성은 부착 세포 배양에서는 쉽게 이루어 질 수 없는 특징이다.°부유세포 : 배지 중에 부유한 상태로 증식하는 세포(예, 혈구 세포)°증식 특징 : 1×106 cell/㎖ 밀도가 되면 증식 정지증식정지 원인 : 영양성분 고갈, 젖산 분비로 pH 저하°계대 : 세포현탁액을 신선한 배지에서 희석하여 접종②부착세포대부분의 고형 조직 유래의 세포는 단층으로 부착하여 증식한다. 이러한 세포는 대부분 약한 음전하를 띤 유리 용기에 부착하여 증식하며 적당한 전하를 띄도록 처리된 polystyrene과 같은 플라스틱 용기에 부착하여 증식하기도 한다.°담체에 접착하여 증식하는 세포°혈청 첨가배지 PBS 처리 -+무혈청배지 PBS 처리(-)--+ → t
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