〈형질 전환 동물〉형질전환 동물(Transgenic mouse)을 개발하기 위한 방법으로, mouse 수정란(embryo pronucleus)의 웅성 전핵에 DNA를 주입하는 기술로써, 제작한 DNA를 동물에 발현 시켜 형질전환을 야기시키는 방법이다.1. 실험동물수정란 공여 및 대리모를 위한 동물로는 생명공학 연구소에서 사육중인 마우스로서, 각 4-6주 령의 것을 실험에 사용한다. 사육조건은 SPF(Specific Pathogen Free)이며, 조명은 12시간씩 dark/light cycle이다. 사료는 무제한 급여하며, 물도 무제한으로 급여한다.2. 수정란의 준비다배란 유기를 위하여 PMSG(Prenant Mares Serum Gonadotropin ; Serotropin, Japan)와 HCG (Human Chorionic Gonadotropin : Sigma, USA)를 48시간 간격으로 각각 5 IU씩 교잡종 자성생쥐의 복강 내에 주사한 다음, 동일계통의 웅성생쥐와 1:2로 합사시켜 자연교미를 유도한다. 다음날 아침, 질전의 유무를 확인하여 질전이 있는 개체만을 골라서 경추탈구법 (cervical dislocaton method)으로 도살한 다음 난관을 절취한다. 절취된 난관의 팽대부를 주사바늘로 터트려 난구세포괴(cumulus cell mass)를 회수하며, 회수된 난구세포괴를 300 unit/ml의 hyaluronidase (Sigma, USA) 용액에 2-3분 처리한 후 15,000 rpm으로 약 3분간 원심처리함으로 핵막의 관찰을 용이하게 한다.3. 외래유전자의 준비미세 주입할 DNA에 사용되는 시료 및 기구는 모두 멸균하여 사용한다. 재조합 DNA를 제한 효소로 절단하여 linear형태로 만든 다음, 0.7-1% agarose gel에서 전기영동을 실시한 후 필요로 하는 DNA 절편을 electroelution 방법으로 회수한다. 회수된 DNA를 1/2 volume의 phenol과 1/2 volume의 CIAA로 섞어주고 30초간 vortex 해준 후, 12,000 rpm에서 3분간 원심 분리한 다음, DNA가 용해되어 있는 상층액을 회수한다. 이러한 phenol 추출법을 3회 실시 후 에탄올로 DNA를 침전시켜 순수한 DNA를 회수한다. 이때 회수된 DNA가 2-10㎍ 정도가 되면 미세주입 실험에 충분한 양이 된다. 순수 분리한 DNA를 농도가 2-4ng/㎕가 되도록 미세주입용 용액 (10mM Tris·HCl, 0.1mM EDTA, pH 7.4)으로 조정한 다음, DNA용액을 각각의 1.5ml eppendorf tube에 50㎕씩 분주하여 -20℃에 저장해 두고 사용한다.4. 재조합 유전자의 미세 주입외래 유전자의 미세주입은 미세조작기(micromanipulator : Leitz, Germany)를 이용하여 수정란의 웅성 전핵에 주입하였는데, 이때 핵막의 용이한 관찰과 실험의 편리함을 도모하기 위하여 DIC system을 갖춘 도립현미경 하에서 실험을 수행한다. 외래유전자가 핵 내에 주입되는지의 여부는 웅성전핵의 팽창(swelling)으로 확인한다.5. 대리모의 준비자연적인 상태에서 발정기(estrus cycle)를 나타내는 ICR 계통의 자성생쥐를 수정란 채취 하루전에 교미를 시키는데, 이때 사용되는 웅성생쥐는 정관수술을 실시한 생쥐이며, 적어도 3일 이상 교미를 하지 않은 상태의 수놈을 사용하여 1:2로 교미를 시키며, 다음 날 아침 자성 생쥐의 질전의 유무(vaginal smear)를 확인하여 교미가 이루어진(pluged) 자성 생쥐를 대리모로 사용한다.6. 수정란 이식외래유전자가 주입된 수정란들은 CO2 배양기 내에서 2세포기(2cell)까지 배양한 후 건강한 상태의 수정란을 선별하여 이식한다. 먼저 마취제(Avertin)를 생쥐 체중의 10g당 0.5mg의 양으로 복강내에 주사(IP)하여 전신 마취를 실시한다. 이때, 마취가 확실히 이루어지지 않았을 경우에는 0.1cc를 더 투여하는데, 대리모의 상태를 철저히 고려한 후 사용하여야 한다. 마취가 확실히 이루어지고 난 뒤, 가친의 배측 정중선을 약 1cm정도 절개하고 난소, 난관을 들어내어 각각의 난관에 수정란을 이식한 후 난관의 팽대부가 약간 부풀러 오른 것을 확인한다. 그 후 복강내에 난관과 난소를 다치지 않게 잘 넣고 근육층과 표피를 봉합한다.7. 산자의 유전자형 확인대리모에서 태어난 산자의 외래유전자 발현여부는 삽입된 외래유전자에서 만든 PCR primer를 이용하여 실시한다. 산자의 꼬리를 약 0.5cm 정도 잘라내어 proteinase K 가 함유된 lysis buffer를 이용하여 genomic DNA를 추출하여 PCR을 실시하여 외래 유전자의 germline transmission 여부를 판별한다.★돌리VS보람/돌리영국 태생의 복제양/체세포 이용 첫 성공◎보람/한국 태생의 젖소/‘모유같은 우유’생산1998년 1월 1일영국에 「돌리」가 있다면 한국엔 「보람」이 있다.돌리는 영국 연구팀이 탄생시킨 복제 양. 보람이는 우리나라에서 만든 모유 생산 젖소다.돌리와 보람이의 차이는 무엇일까. 돌리는 과학적으로 불가능하다고 여겼던 일을 가능케 한 것이라면, 보람이는 실용적인 연구에서 국내 수준이 결코 뒤떨어지지 않음을 보여줬다.지금까지 과학자들은 어떤 개체의 체세포를 가지고 하나의 동물을 만들 수 없다고 여겨왔다. 이는 세포분화의 과정을 반대로 돌리는 것일 뿐더러, 수많은 과학자들이 도전했다가 실패한 일이기 때문. 영국 연구팀은 체세포의 핵을 뽑아낸 다음 그 자리에 탈핵 난세포를 치환, 원래의 양과 완전히 똑같은 복제양을 만들었다. 완전 복제는 수천명의 과학자들이 수십만번 실험을 해도 성공하지 못해 불가능한 일로 여겨졌었다. 영국팀은 2백20여 차례의 실험 끝에 성공함으로써 성공률은 0.2%에 머물렀다. 보람이는 여자의 유방조직에서 모유에만 있는 락토페린 유전자를 뽑아, 이를 젖소의 염색체에다 이식해서 모유같은 우유를 만들어내도록 만든 젖소다. 모유의 중요성분인 락토페린이 젖소에서도 나오도록 만드는데 성공한 것. 보람이를 탄생시킨 생명공학연구소의 이경광 박사는 『이 기술은 워낙 연구기간이 오래걸리고 비용도 많이 필요할 뿐더러 대규모 목장이 있어야 하는 등의 제약이 따른다』고 밝혔다.생명공학 연구소◎모유성분 (락토페린)을 생산하는 보람이◎연구개발내용 :항균, 항바이러스 및 면역증강 효과가 뛰어난 인체락토페린 유전자를 젖소의 수정란에 미세주입하여 우유중에서 사람락토페린을 대량 생산할 수 있는 형질전환 젖소 개발◎기술특성:인체에 유용한 고가의약품 및 식품첨가제를 젖소의 우유에서 대량생산할 수 있는 새로운 생산 시스템(Animal Bioreactor System)개발.고가의약품(항암제, 혈전용해제등)생산원가의 획기적 절감(기존방식 보다 약 1,000배)
![[생명공학] 형질전환동물](https://image4.happycampus.com/Production/thumbnail/2004/06/07/data2871221-0001.jpg)
