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siRNA (A Powerful Reverse Genetic Tool)

siRNA (Small Interfering RNA)- A Powerful Reverse Genetic Tool -? siRNA란: siRNA는 이중가닥의 RNA(double-stranded RNA)가 Dicer에 의해 절단되어 생성되는 21-25nt 크기의 작은 RNA조각으로 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 단백질 발현을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 이들의 존재는 1998년 미국 카네기 연구소의 Andrew Fire와 Massachusetts 의과대학의 Craig Mello 연구팀의 실험을 통해 처음 확인되었는데, 외부의 이중 가닥의 RNA를 선충에게 주입했을 때 상보적인 세포 내부의 mRNA와 서열 특이적으로 결합해 유전자 침묵(gene silencing)을 유도하는 기능을 확인했고, 이를 계기로 이런 현상을 RNA interference(RNAi)라고 부른다.■ RNAi MechanismRNAi 과정은 크게 dicer enzyme에 의해 long dsRNA를 siRNA(short interfering RNA)로 자르는 과정과 이 잘려진 siRNA가 RISC(RNA-induced silencing complex)와 결합한 후 cell 내의 상보적인 mRNA에 결합하는 과정으로 이루어진다. 이때 siRNA에 의해 mRNA는 절단되어 그 특정유전자의 발현이 감소되게 된다. 이러한 siRNA는 다음과 같은 방법으로 생성할 수 있다.? In vitro transcription and dicing of ds RNA? Synthetic siRNA? Vectors carrying as RNAi cassette■ Dicer긴 ds RNA를 siRNA로 만들기 위해서는 RNaseIII 형의 Dicer 효소가 꼭 필요하다. 지금까지 dsRNA를 잘라서 siRNA를 만드는데 주로 Dicer나 RNase III가 사용되어 왔다. RNase III의 경우 dsRNA를 12~15mer로 잘라주고, Dicer의 경우 21~23mer로 잘라준다. . (Dicer 구조RNA의 세포 내로의 도입이미 만들어진 siRNA를 세포 내로 도입하기 위해서는 transfection의 방법이 중요하다. 기존에 만들어진 transfection reagent는 주로 plasmid 를 대상으로 고안된 것이 많으므로, 주의를 기울여 선택하는 것이 중요하고, 또한 cell 상태등에 대해서도 민감 하므로 최적 조건을 파악하여 세포 내로 도입하는 것이 중요하다. 미리 만들어진 siRNA를 사용 시 위에서 언급했던 delivery상의 문제가 생길 가능성과 지속적으로 발현 될 수 없는 단점이 있어 in-vivo 에서 siRNA를 발현 할 수 있는 vector를 제작 하는 방법을 이용하는 경우가 증가 하고 있다. 일반 적인 vector뿐 아니라 virus에 기초한 vector들로 있으며 현재 많은 연구가 진행 중이다.3. 유전자 억제정도의 분석.Northern, RT-PCR, Western 등의 방법으로 목적하는 유전자의 억제 정도를 측장 할 수 있고, 또한 report gene 을 사용하여 측정 할 수도 있다.?. siRNA의 응용 분야 in mammalian gene analysis1. Studying gene functionDNA array 기술, 2-D protein display 기술 등을 비롯해 유전자들의 발현 패턴을 대량으로 분석할 수 있는 다양한 기술들의 개발은 특정 phenotype과 관련된 유전자 (differentially expressed genes)들에 대한 대량의 data base를 양산 하게 되었다. 이렇게 쏟아져 나오는 유전자들의 기능이 관련 phenotype과 연관성이 있는지의 여부를 가장 빠르고 간편하게 조사할 수 있는 방법이 siRNA를 이용하는 것이다. 기존의 antisense, ribozyme, transgenic animal, 및 knock-out mouse 기술들의 한계 및 단점들을 상당부분 해결할 수 있는 기술로 siRNA가 각광을 받고 있는 것이다. 이 분야에서는 암을 비롯한 여러 질병들의 유발원인과 관련된 유 terms of efficacy and safety) drug target이 될 수 있는 지를 조사하는 gene validation study가 신약개발 단계에서 매우 중요한 위치를 차지하게 된다. 바로 이러한 drug target을 발굴하기 위한 gene validation study에 가장 이상적인 기술이 RNAi 기술이라 평가되고 있으며, 실제 많은 연구자들이 siRNA를 이용하여 배양세포 및 동물모델에서 target validation을 수행하고 있다.3. Modeling tumor behavior in animals앞서 간단히 언급했듯이 많은 질병 중에서 암은 사회경제적으로 미치는 파급효과가 매우 클 뿐 아니라, 질환의 발생부터 말기 암까지 진행되는 과정 (initiation, promotion, progression, angiogenesis, invasion, metastasis, etc.)이 매우 복잡하고 수 많은 유전자가 관련되어 있기 때문에 단일 질환 중 가장 많은 연구자와 연구비가 투여 되고 있는 분야이다. siRNA는 이러한 암 연구에 중요한 이정표를 세울 수 있는 기술적 기반을 제공할 수 있다고 평가되고 있는데, 수 많은 암 관련 유전자들이 tumor behavior에 어떻게 관여하고 있는지 규명하는데 siRNA가 이용될 수 있다.4. Developing RNAi therapeutics감염성 바이러스에 의해 발현되는 viral RNAs, 과발현되는 질환 유발 유전자의 mRNAs, 돌연변이에 의해 질환을 유발하는 유전자의 mRNAs 등, 여러 종류의 RNA들이 질환의 치료를 위해 표적이 될 수 있는 target RNA로 선정될 수 있다. 이들 target RNA를 degradation 시킬 수 있는 siRNA들은 새로운 형태의 drug으로 연구되고 있는데, 에이즈, 간염과 같은 바이러스성 질환, 광우병 유발성 prion RNA, 다양한 암 유전자, 그리고 자가면역질환을 비롯한 여러 가지 유전질환을 야기하는 유전자들이 현재 siRNA를 이용시켜 AIDS Virus를 제거하는 유전자 치료가 가능하다. 예를 들면 AIDS Virus(HIV)의 LTR promoter의 전사가 개시된 RNA내에 존재하는 특정 서열(TAR)에 AIDS Virus 유래의 Tat 단백질이 결합하면, 그것보다 하류 전사를 활성화 하는 것이 알려져 있다. 즉 AIDS 감염으로 TAR 서열의 하류 유전자 발현이 유도되게 된다. 이 부분에 MazF 유전자를 도입하고 실제로 AIDS Virus가 감염하면, 바이러스 증식 시 Tat에 의해서 MazF 유전자가 발현되어 AIDS 감염 세포에만 사멸이 유도되게 된다. 즉 바이러스는 생육이 억제되는 것이 아니라 소멸하게 된다. 실험 모델로, AIDS Virus(HIV)의 LTR promoter와 RNAi 효소MazF를 가진 plasmid와 HIV의 Tat 유전자를 넣은 다른 plasmid 를 함께 도입했을 경우에만 세포가 사멸 되었다. 즉, Tat 단백질의 발현으로 RNAi 효소 MazF가 발현한 것이라고 생각할 수 있다. 향후 RNAi 효소 유전자, HIV의 LTR promoter, HIV의 Tat 단백질에 대한 연구가 이루어지면, AIDS 유전자 치료와 예방이 가능하게 될 것이다.2. 목적 단백질만 발현시키는 시스템 개발(SPP 시스템)ACA를 인식 서열로 하는 RNAi 효소인 MazF를 세포내에서 발현시키면, 거의 모든 세포 유래의 mRNA에 있는 ACA의 서열은 파괴되어 신규 단백질 합성은 억제된다. 그러나, 발현시키고 싶은목적 단백질의 유전자 중 ACA 서열을 코드 하는 아미노산의 종류를 유지한 채 ACA와는 다른 염기 서열을 인공적으로 치환하면 이 인공 유전자만이 RNAi 효소 MazF의 절단 작용을 받지 않고, 목적 단백질을 발현시킬 수 있다. 이 발현계를 이용하여 단백질을 표식 하면 목적 단백질만 표식 되어 별도의 정제 과정없이 NMR로 구조 해석이 가능하다. 또 당사에서 개발한 cold shock vector와 조합하면, 미량 발현하는 항원 단백질 등의 분리와 백신 개발에 마(trojan horse) 치료법(therapy)으로 암 세포(cancer cells)를 정복할 수 있다는 논문을 발표하였다. Jennifer MacDiarmid 박사와 Himanshu Brahmbhatt 박사는 2001년에 EnGenelC Pty Ltd5) 라는 벤처기업을 창업했는데 이들은 그간 암과 싸울 수 있는 치료법을 개발해왔다. 이 요법은 박테리아에서 추출된 나노 세포를 먼저 침투시켜(using a bacterially-derived nano cell to penetrate) 암 세포를 무장해제 시킨(disarm the cancer cell) 뒤 두 번째 나노세포가 화학요법 약물을 암 세포에 투여해 암세포를 죽이는(a second nano cell kills it with chemotherapy drugs) 방식이다. 이들의 연구 내용은 2009년 6월 28일자 Nature Biotechnology 지 온라인판(AOP)에 "Sequential treatment of drug-resistant tumors with targeted minicells containing siRNA or a cytotoxic drug(siRNA 또는 암세포를 죽이는 약을 가진 표적화된 미니세포를 이용해 약물-저항 종양을 연차적으로 치료하는 방법)"(MacDiarmid et al., 2009)라는 논문으로 발표되었다.트로이 목마 요법(therapy)은 특히 약물 등의 화학요법(chemotherapy)을 이용해 암 세포들만 직접 표적하는(directly target cancer cells) 잠재성(the potential)을 갖고 있어 주목된다. 현재의 치료법들은 화학요법 약물이 암 환자에게 투여되면 암 세포와 건강한 세포를(both cancer and healthy cells) 모두 공격한다. 제니퍼 맥다이어미드 박사와 하이먼슈 브럼햇 박사는 지난 2년간 트로이 목마 요법으로 인간의 암세포를 가진 쥐들(mice with human cancer cells)을 100% 살려내는 같다.

자연과학| 2010.01.07| 7페이지| 1,000원| 조회(596)

유전공학, RNAi, siRNA, micro RNA, Small Interf..

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Micro RNA에 대한 요약 정리와 최신 동향! 평가A+최고예요

- Micro RNA,세포 속에 숨어 있는 작은 policeman -1. 정의- Micro RNA (miRNA)는 21-25 nucleotide(nt)의 single-stranded RNA 분자로서 진핵생물의 유전자 발현을 제어하는 새로운 유전 조절 물질이다.2. siRNAs(small interfering RNAs)와 Micro RNA- siRNA는 이중가닥의 RNA(double-stranded RNA)가 Dicer에 의해 절단되어 생성되는 21-25nt 크기의 작은 RNA조각으로 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 단백질 발현을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 이들의 존재는 1998년 미국 카네기 연구소의 Andrew Fire와 Massachusetts 의과대학의 Craig Mello 연구팀의 실험을 통해 처음 확인되었는데, 외부의 이중 가닥의 RNA를 선충에게 주입했을 때 상보적인 세포 내부의 mRNA와 서열 특이적으로 결합해 유전자 침묵(gene silencing)을 유도하는 기능을 확인했고, 이를 계기로 이런 현상을 RNA interference(RNAi)라고 부른다.siRNA에 의해 그에 상보적인 염기서열을 갖는 mRNA 분해가 유발되는지 혹은 번역 억제가 유도되는지 여부는, 해당하는 21-25 nt RNA와 mRNA간의 상보성 정도에 따라 결정된다. 즉, 100% 상보적인 경우는 mRNA분해를, 약 80-90% 상보적인 경우는 번역 억제를 일으킨다.RNAi와 Micro RNA에 의한 번역 억제는 사실상 매우 유사한 기작을 통해 이루어진다. 이는 고등진핵세포에서 빠르고 효율적인 gene knockdown을 가능하게 함으로써, 기능 유전체학에 중요한 기술적 돌파구를 마련하였다. 따라서 Micro RNA에 대한 연구는 효율적인 RNAi기술을 개발하는 데에도 중요한 기반지식을 제공할 것이다.3. 생성 과정 및 작용 MechanismMicro RNA의 생성은 두 단계의 프로세싱으로 이루어진다.? 최초의 microRNA 전사체(primary miR다. 모든 세포에서 microRNA가 만들어지고 있고, 유난히 microRNA 발현이 적은 단계는 embrio 초기 단계, embrio stem cell이다. 그리고 분화가 진행되면서 특정 조직에 특정 유전자 발현을 조절하는 방법으로 microRNA pull들이 늘어나기 시작한다. 어떤 조직에는 microRNA가 많고 어떤 조직에는 적은지 절대량을 가지고 비교한 실험은 없어서 분명히 얘기하기는 어렵지만 모든 세포에서 나름대로 microRNA pull들이 다 있는 것 같다. microRNA 조성은 조직마다 다르다."- Micro RNA가 특정 유전자, 특정pathway를 조절하나?"식물에서는 microRNA가 transcription factor들을 조절해서 분화에 관여하는 것이 많이 발견됐다. 동물의 경우 당 대사, 지질 대사, 발달과정에서 세포분화 등 거의 모든 대사에 관여하고 있다. microRNA는 굉장히 다양한 역할을 하는 것 같다. 초기에는 특정 microRNA가 소수의 특정 조절 유전자만 조절함으로써 특정 pathway를 조절한다고 생각했는데 실제로 최근 연구에 따르면 한 microRNA가 수백 개의 서로 다른 mRNA를 조절하고 각각이 secondary effect를 가지기 때문에 각각 microRNA가 굉장히 많은 대사를 조절하고 있는 것이다. 여러 microRNA가 하나의 유전자를 조절하기도 하기 때문에 일대일 대응이 아니라 다대 다대응의 아주 복잡한 네트워크가 만들어진다.microRNA에 의한 조절은 기존의 transcription factor들에 의한 on-off 방식의 조절이 아니라 미세조정에 의한 global gene regulation 방식이다. 비유를 하자면 microRNA pull은 일종의 체(sieve)같은 역할을 한다. Transcription을 통해서 만들어진 mRAN가 위로 부어졌을 때 조절되어야 하는 mRNA들을 걸러내는 것과 같다. microRNA는 전체 유전자 발현 패턴을 조절하는 중요한 기작이다."- Micro RNAiRNA는 그 역 보체와 짝을 이루어 쌍가닥 머리핀 루프(hairpin loop)를 형성하는데 이를 pri-miRNA(primary miRNA)라 한다.○ 동물에서는 핵에 있는 Drosha 효소가 머리핀의 밑은 잘라 pre-miRNA 를 만든다. 이 pre-miRNA는 운반체 단백질 Exportin 5에 의하여 핵에 서 세포질로 능동적으로 운반된다. 그러면 Dicer 효소가 머리핀 밑에서 20~25 뉴클레오티드를 잘라 성숙한 miRNA를 방출한다.○ 동물 miRNA는 대개 3‘UTR(3’-untranslated regions)에 있는 부위와 상 보성 염기서열을 갖지만 식물 miRNA는 mRNA의 부호화된 부위 안에 있는 부위와 상보성 염기서열을 갖는다. 이로 인한 miRNA와 mRNA 의 결합이 단백질로의 번역을 억제하는 것이다. 그러므로 miRNA는 내재적(endogenous) 안티센스 조절인자의 역할을 하는 것이다.○ miRNA는 유전자발현을 조절하는 작은 비 코드 RNA인데, 최근에 이들이 암 발생 및 진행에 관여한다는 것이 알려지고 있다. 이들의 발현 목록은 사람의 악성종양의 분류, 진단 및 예후에 이용될 수 있다.miRNA의 소실이나 증폭이 여러 종류의 암에서 일어나고, miRNA 발현의 변경된 양상이 세포주기와 생존과정에 영향을 줄 수 있다.○ 항암 치료제로서의 miRNA 역할 가능성을 이해하기 위해서는 암세포에서 널리 일어나는 miRNA의 조절곤란의 결과가 무엇인지를 알아야한다. 20여 년 전에 알려진 점 돌연변이에 의한 RAS 유전자의 활성화는 어떤 종양에서는 초기 사건임을 의미할 수 있다.- 폐 종양세포에서는 정상세포보다 RAS 단백질이 현저하게 많은 반면, let-7 발현은 거꾸로 종양세포에서 감소된다. 이러한 관계로 인하여 let-7 miRNA족에 의한 RAS의 직접조절 기작을 알게 되었다. 외인성 let-7을 폐에 전달하면 악성 전 환부로부터 폐종양 형성을 예방하거나, RAS 돌연변이에 의하여 활성화된 종양을 수축시킨다.○ miRNA는 세NA 연구는 의학적, 산업적인 측면에서 중요성을 갖는다. micro RNA의 대사 또는 기능의 결함으로 인해 발생하는 질병의 연구나 micro RNA의 조작을 통한 유전자발현의 조절은 향후 신약개발을 위한 기반기술을 제공할 것으로 보인다.≪서울대 김빛내리 교수와의 인터뷰 내용≫□ RNAi의 연구 동향과 응용 가능성- "RNAi는 크게 기초연구와 응용으로 나눌 수 있다. 기초연구 자체가 재미있는 이유는 기존에 알려져 있지 않은 RNA gene regulation이라는 새로운 패러다임을 세운 연구들이기 때문이다. 그리고 RNA들이 체내에서 여러 가지 발생이나 바이러스 조절, 암과 관련 있어 의학과 기초생물학 등 여러 분야에서 관심을 끌고 있다. 산업적으로 응용가능성이 높은 것은 microRNA가 체내 중요한 역할을 하기 때문에 이것들이 잘못 조절되었을 경우 바로 질병으로 이어지는 경우가 많기 때문이다. micro RNA가 deregulation된 것을 다시 교정해서 질병치료를 하겠다는 목적으로 의약에서 접근하고 있다.그리고 또 다른 접근으로는 micro RNA pathway를 이용해서 RNA interference(RNA 간섭)에 실제로 응용하는 것이다. RNAi를 기능유전체학 연구에서 활용하거나 RNA 자체를 신약으로 활용하는 연구들을 하고 있다. 기초와 응용 양쪽분야에서 동시에 활발하게 연구가 이뤄지고 있다."7. Micro RNA 관련 뉴스 기사■ Micro RNA 생성 메커니즘 첫 규명 (2009/11/27)충북대 이수재 교수 사이언스誌 발표"암 예방 등 응용연구 기틀 마련"(서울=연합뉴스) 김영섭 기자 = 국내 연구진이 모든 생명현상에 깊이 관여하는 마이크로RNA의 생성을 조절하는 메커니즘을 세계 최초로 규명했다.충북대 약학대학 이수재 교수팀은 핵에서 만들어진 마이크로RNA 전구체(前驅體ㆍpre-miRNA)를 비롯해 이 전구체를 핵에서 세포질로 수송하는 Exp-5 단백질, 그 수송조절을 맡고 있는 Ran 단백질 등 3가지 생체거대분자 복합체의 입체구조를 제가 생겨 마이크로RNA의 양이 변화한다면 암과 같은 질병이 발생할 수 있다고 연구진은 전했다.그동안 마이크로RNA 전구체가 핵에서 세포질로 수송되는 과정에 수송단백질(Exp-5)과 수송조절단백질(Ran) 복합체가 관련돼 있다는 것은 알려져 있었다.하지만, 이 단백질 복합체가 핵 내에 존재하는 많은 종류의 RNA 중에서 어떻게 마이크로RNA 전구체를 특이하게 인식하는지에 대해서는 알려진 바가 없었다.이 교수팀은 인간 유래의 Exp-5 단백질과 Ran 단백질을 대장균에서 대량으로 배양하고 정제과정을 거쳐 Exp-5과 Ran 및 마이크로RNA 전구체, 3가지 물질의 연약한 복합체를 순수 분리하는데 성공했다.연구진은 Exp-5와 Ran 복합체는 야구미트의 형태를 갖고 있어서 미트의 내부에 핵 내에서 분해되기 쉬운 마이크로RNA 전구체를 미트 깊숙이 집어넣어 보호함으로써 핵 내에 존재하는 RNA 분해효소에 의해 마이크로RNA 전구체가 분해되지 않고 안전하게 세포질로 수송시킬 수 있음을 밝혀냈다.또한 Exp-5와 Ran 복합체가 마이크로RNA 전구체의 시작 부분과 끝부분의 말단구조를 구별함에 있어서도 RNA구조의 특성상 시작 부분의 말단부위를 인식하는 것이 불가능함을 입체구조를 통해 이해할 수 있었다고 연구진은 설명했다.이번 연구결과를 바탕으로 핵-세포질 수송과정에서 각각의 마이크로RNA 전구체를 제어하는 방법을 개발한다면, 암과 바이러스 감염 및 유전적질환 등 마이크로RNA가 관련된 여러 질환의 치료제 개발에 응용될 수 있을 것으로 기대된다.■ 서울대 생명과학부 김빛내리 교수 인터뷰 (2009/11/27)□ 생명현상 조절하는 RNA 규명서울대 생명과학부 김빛내리(36)교수는 생명과학 최고 권위지인 ‘셀(Cell)’ 2일자에 단백질과 함께 생명현상의 주요 조절물질로 부각되고 있는 ‘마이크로RNA(microRNA)’의 생성과정을 새롭게 밝힌 연구논문을 발표했다.마이크로RNA는 DNA의 유전정보를 복사해 단백질을 합성하는 일반 RNA보다 크기가 작은 RNA로, DNA나 R혀냈다.

자연과학| 2010.01.07| 9페이지| 1,000원| 조회(2,376)

유전공학, 유전물질, MICRO, RNAi, siRNA, micro RNA, 김..

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노벨 생리의학상 & 화학상 요약 정리 (2000-2009년)

노벨 생리학 의학상2000아비드 칼슨폴 그린가드에릭 캔들스웨덴미국미국뇌세포의 상호신호전달 원리를 밝혀 뇌의 기능을 이해하고 신호변환이상이 신경 및 정신질환을 유발하는 원인 발견1950년대 말 도파민(dopamine)이라는 신경전달물질을 발견해 '뇌의 신경전달물질과 시냅스(synapse)에 관한 연구'의 초석을 마련했으며 이 연구로 폴 그린가드, 에릭 캔들과 노벨 생리학·의학상(2000)을 공동 수상했다.도파민이 뇌에서 중요한 역할을 하는 신경전달물질이라는 사실을 칼슨이 밝혀내기 전까지만 하더라도 도파민은 단지 노르아드레날린(부신분비호르몬)이라는 신경전달물질의 전(前)물질로 여겨졌다. 그는 뇌의 특정 부분에 노르아드레날린보다 많은 양의 도파민이 집중적으로 분포하고 있음을 알아냈고 이로부터 도파민이 노르아드레날린의 전물질이 아니라 독자적인 신경전달물질이라는 결론에 도달했다. 이어 도파민이 인간의 운동기능을 조절하는 아주 중요한 화학물질이라는 사실도 밝혀냈다.도파민은 운동능력을 제어하는 신경돌기 덩어리인 뇌의 기저핵(基底核) 부위에 분포하는 신경전달물질로서, 주로 신경에 가해지는 충격의 전달을 억제하는 신호를 기저핵에 보내는 역할을 한다. 그는 이러한 역할을 하는 도파민이 부족할 경우 운동기능을 조절하지 못하는 파킨슨병에 걸리게 된다는 사실을 발견했다. 그의 연구 결과 도파민의 전물질인 레보도파(levodopa : 일명 L-dopa)라는 치료제가 개발되었는데, 이는 파킨슨병의 원인을 치료하는 가장 효과적인 치료제로 지금까지 널리 사용되고 있다.그는 뇌에서 도파민이 수행하는 역할을 보다 명확하게 밝혀낸 연구 결과들을 잇달아 발표했다. 파킨슨병 치료제를 개발한 것 외에도 정신분열증 치료제들의 작용 원리를 계속 연구해 이 치료제들이 도파민 수용체를 차단함으로써 시냅스의 전달 체계에 영향을 미친다는 사실을 발견했다. 이 발견은 현대인에게 흔한 질병인 우울증의 치료에도 커다란 영향을 미쳤다. 1960년대 후반 그는 강력한 혈관수축을 일으키는 신경전달물질인 세로토닌의 생성을 생한 부위는 정상 조직과 물의 함량이 달라진다. 따라서 MRI를 통해 근육, 뼈, 뇌, 척수 등의 물의 함량을 조사하면 신체 내부를 들여다볼 수 있다. MRI에 장착된 고감도 자기센서는 신체의 조직의 물이 만드는 미약한 자기장을 감지한다. 이를 내부 코일로 증폭시켜 위치와 세기를 등고선처럼 나타낸다. 컴퓨터를 이용해 이 등고선처럼 표시된 것을 영상화한다.X선을 이용한 ‘단층영상’(CT)이나 인체에 흡수된 방사능 동위원소가 붕괴되는 현상을 측정하는 ‘핵의학영상’은 인체 위험성 때문에 반복 촬영으로 방사선 피폭이 허용량을 초과할 때는 진단의 유용성에 따라 전문가가 결정하는 문제가 따른다. 반면 MRI는 자석에서 나오는 자기장을 이용해 검사로 인한 통증이나 부작용, 유해성이 없다는 장점이 있다.더 나아가 CT는 횡단면만 촬영이 가능하지만 MRI는 종?횡단면을 모두 찍을 수 있어 뇌질환이나 허리뼈, 근육, 연골, 인대, 혈관처럼 수분이 많은 곳을 선명하게 찍어낼 수 있다. 실제로 MRI는 의대 해부학 시간에 돋보기로 관찰하던 귀 안의 세반고리관이나 달팽이관(2~3mm)도 살펴볼 수 있다.2004리처드 액설린다 B. 벅미국미국후각수용체와 후각 메커니즘 발견- 2004 노벨 생리 의학상 - 냄새 기억하는 후각 수용체와 후각 시스템의 조직 발견스웨덴 카롤린스카연구소(Karolinska Institutet) 노벨상 선정위원회는 2004년 10월 4일 인간의 후각계통에 대해 연구한 공로로 미국의 Richard Axel(58)과 Linda B. Buck(57)을 올해 노벨 생리 의학상 수상자로 선정, 발표했다. 노벨상 위원회는 두 과학자가 어떻게 사람들이 라일락 꽃의 향기를 맡을 수 있고, 몇 년 후 이 향기를 다시 기억할 수 있는지를 설명함으로써 인간의 감각 중 가장 오랫동안 수수께끼로 남아 있던 후각의 비밀을 밝혀냈다고 선정이유를 밝혔다. 일련의 선구적인 연구를 통해 인체 후각계통의 작동 메커니즘을 규명한 Richard Axel과 Linda B. Buck은 각각 뉴욕 컬럼비 측두엽에 전해지면서 냄새를 감지한다는 사실을 전기화학적 작용으로 설명했다. 또 이들은 후각 수용체가 콧속에 1000개나 존재하며 각각의 수용체에는 G단백이란 물질이 있어 냄새 맡는 기능을 활성화한다는 사실도 규명해 냈다. 이 후각 수용체에는 개별 유전자가 관여해 두세 가지의 냄새를 맡게 되며 이들의 조합을 통해 인간은 1만 가지의 서로 다른 냄새를 식별해 낼 수 있다는 것이다. 인체게놈 사업으로 밝혀낸 인체 유전자는 모두 대략 3만 여 개이다. 냄새에 관여하는 유전자가 1000개임을 감안할 때 냄새를 맡기 위해 3%의 유전자가 동원되는 셈이다. 사람의 코 점막에는 1000여 개의 후각 유전자가 존재하며, 각각의 유전자는 1대1로 후각 수용체로 발현(發顯)된다. 1개의 후각 수용체가 담당하는 냄새 분자는 약 2~3개며, 1000여 개 수용체의 조합에 따라 사람은 1만개 정도의 냄새(또는 냄새 분자)를 구별할 수 있게 된다.우리가 흔히 맛을 느끼는 미각 작용은 실제 대부분 후각에 의해 만들어진다. 커피 향을 맡아 커피 맛을 느끼는 것과 같은 이치다. 그리고 후각은 가스, 쉰 음식 등의 냄새를 감지해 위험으로부터 보호하는 중요한 기능을 한다. 그러나 후각은 이제까지 인체 오감 중 과학적 규명이 가장 미흡했던 감각 기관이었다.시각이나 청각과 달리 후각을 잃은 환자는 현재까지 어떤 방법으로도 치료가 불가능하다. 서울아산병원 이비인후과 장용주 교수는 “엑설과 벅이 후각의 메커니즘을 밝혀냈지만 아직 임상적으로 활용되지는 않고 있다”며 “그러나 상실된 후각을 복원시킬 수 있다는 가능성을 제시했다는 점에서 의의가 있다”고 말했다. 이들의 후각 생리 연구결과는 외상, 축농증, 종양 등으로 냄새를 못 맡고 사는 후맹증 치료는 물론 후각신경을 통한 본능과 감정의 조절 및 인간보다 몇 백배 예민한 인공코의 개발 등에 응용될 것으로 전망된다.2005배리 J. 마셜J. 로빈 워런오스트레일리아오스트레일리아위염·위궤양의 원인균인 헬리코박터 파일로리균 발견 및 발병 메커니즘 규명위궤양이 박있는 방법을 찾아냈다. 연구소는 「이 기술은 생의약 분야 기초 연구에서 새로운 치료법 개발에 이르기까지 모든 분야에서 적용되고 있다」며 「배아 발생에서의 다양한 유전자들과 성인의 생리기능, 노화, 질병 등에 관한 지식을 넓히는데 기여했다」고 밝혔다.2008뤽 몽타니에프랑수아즈 바레시누시미국프랑스인체면역결핍바이러스(HIV)를 발견한 공로하랄트 추어 하우젠독일자궁 경부암의 발병과 관련된 인간유두종바이러스(HPV)의 발견한 공로프랑스의 바레시누시, 몽타니에 박사는 에이즈 바이러스(HIV)를 최초 발견한 공로를, 독일의 하우젠 박사(72)는 자궁경부암 발병에 있어 인유두종바이러스의 역할을 처음 규명한 공로를 인정받아 노벨 의학.생리학상이라는 영예를 거머쥐었다.바레시누시 박사는 여성 과학자로 1970년대 초반 프랑스 파스퇴르 연구소에 합류, 바이러스 및 레트로바이러스(자신의 유전암호를 숙주의 DNA에다 복사하는 바이러스)에 대한 연구 끝에 1983년 에이즈 바이러스인 HIV를 뤽 몽타니에 박사 등과 함께 최초로 발견했다. 바레시누시 박사는 현재 HIV를 통제하는 과정에서 생체 고유의 방어기전과 바이러스의 모체(母體)에서 자녀로의 전이 과정에 대해 연구 중이다. 그녀는 연구뿐 아니라 후학양성과 왕성한 대외활동으로도 유명하다. 250여 개의 국제회의에 참석하며 수많은 젊은 연구자들을 지도했으며,파스퇴르연구소뿐 아니라 세계보건기구(WHO), 유엔에이즈기구(UNAIDS) 등에도 활발히 참가하고 있다.몽타니에 역시 바레시누시 박사와 마찬가지로 평생을 바이러스 연구에 바친 학자로 파스퇴르 연구소 재직시 1983년 바레-시누시 박사 등과 함께 HIV를 최초로 발견했다. 그는 이 밖에도 에이즈 바이러스에 대한 수많은 중요한 연구업적을 세웠다. 특히 어떻게 바이러스가 숙주 세포들의 유전정보를 변형시키는가에 대한 이해를 심화시켰다는 평가를 받고 있다. '인터페론'이라는 인체 바이러스 방어체계에 대한 그의 연구는 바이러스 질환 치료의 새로운 길을 열었다는 평가를 받는다. 몽타니에 박사는 의 직접적인 연관관계를 증명했다.블랙번에 의해 발견되고 그라이더와 조스택이 질병 매카니즘에 희망을 주고 잠재적인 새로운 치료요법의 발전에 자극이 되는 그 세포를 이해하기 위한 새로운 중요성을 가미했다. Elizabeth H. Blackburn(엘리자베스 블랙번) 은 미국과 호주 시민으로 1948년 호주 타즈매니아, 호바트에서 태어났다. 멜번 대학에서 학부생활을 마친 뒤 영국의 캠브리지 대학에서 1975년에 박사학위를 받았고 미국 예일대학에서 박사과정 이후 연구원을 거쳐 버클리 대학에서 교직을 맞았다. 그후 1990년 이후로 샌프란시스코의 캘리포니아 대학에서 생물학과 생리학 교수를 맡고 있다.Carol W. Greider(캐롤 그러이더) 는 미국 시민으로 1961년 미국 샌디에고에서 태어났다. 버클리와 산타 바바라 안에 캘리포니아 대학에서 공부했으며 그녀의 지도주임인 블랙번에게 1987년에 박사를 획득했다. 박사과정 이후 연구를 콜드스프링 하버 연구소에서 마친 후에 1997년에 존스홉킨스 대학에 생물학과 유전자학 교수로 임용됐다.Jack W. Szostak(잭 조스택)은 현재 미국 시민으로 1952년 런던에서 태어나 캐나다에서 자랐다. McGill 대학에서 공부했고 코낼 대학에서 1977년에 박사를 취득했다. 1979년 이후로 하버드 의대에서 공부하며 현재 보스톤의 Massachusetts General Hospital에서 유전학 교수로 역임하고 있다. 또한 하워드 휴 의학 대학에 속해있다.노벨 화학상2000앨런 J. 히거앨런 G. 맥더미드시라카와 히데키[白川英樹]미국미국일본전도성 플라스틱 개발이 세 사람은 1977년, 플라스틱도 금속처럼 전기 전도가 가능하다는 것을 증명하는 전도성 고분자(합성수지)를 개발해 플라스틱은 전기가 통하지 않는다는 종래의 상식을 뒤엎는 혁명적인 성과를 이루어낸다. 플라스틱의 분자구조를 변형하여 전도체로 사용할 수 있게 한 공로로 맥더미드, 히거, 시라카와 히데키는 2000년 노벨화학상을 공동으로 수상했다. 금속처럼 전기가 통하면서도 .

자연과학| 2010.01.07| 12페이지| 1,000원| 조회(1,080)

노벨상, 생명과학, 세포생물학, 화학상, 생리의학상

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DNA Purification from agarose gel -결과 Report !!

DNA Purification from agarose gel-결과 Report-◈ 실험 방법① GB를 gel 무게 대비, 3배의 양을 넣고 55℃에서 25~30분 동안 방치시킨다. (2분마다 vortexing 을 한다.)☞ 만약 gel을 0.1g 넣었다면, GB는 0.3ml 넣는다.② sample을 컬럼에 옮긴 후, 20분 이상 방치시킨다.☞ gel 속의 DNA가 중력에 의하여 컬럼의 membrane에 많이 달라붙을 수 있도록 20분 이상 방치③ 20분 후, 컬럼을 spin down 시킨다. 이 과정을 4~5회 반복한다. 침전액을 버린다.☞ gel 속의 모든 DNA를 용출시키기 위한 방법 즉, 흡광도 측정시 정확한 값을 위해 ③의 과정을 4~5회 반복④ NW buffer 를 750 ?넣고 spin down 시킨 후, 침전액을 버린다.☞ NW buffer (알코올 성분이며, DNA에는 별로 좋지 않다)는 일명 washing buffer 혹은 wash soution으로 불순물을 씻어내는 역할을 한다.⑤ 12,000 RPM, 5분간 원심으로 membrane을 말린다.⑥ EB buffer 30 ?를 넣고, 12,000RPM 2분간 원심으로 membrane에 붙은 DNA를 용출한다.☞ EB buffer는 일명 Elution Buffer로, membrane에서 DNA를 떨어뜨리는 역할을 한다.⑦ DNA전용 cuvette를 이용하여, 흡광도(260, 280, 320nm)를 측정한다.◈ 실험 결과- 1조 -Column을 이용한 DNA extractionRatio0.018/0.009 = 2.0Concentration0.018 * 60 * 50 = 54※ Ratio 구하는 방법 :※ Concentration 구하는 방법 : 260nm * 희석 배수(dilution factor) * 50 (factor(상수값))1조2조3조4조260nm0.0180.0410.0240.054280nm0.0090.0230.0090.036320nm0.0060.0080.0040.028Ratio2.01.782.61.5Concentration54 (실험값)36 (기계값)123 (실험값)100 (기계값)72 (실험값)60 (기계값)162 (실험값)78 (기계값)◈ 결과 분석 및 토의▶ 1조의 Ratio의 값은 2.0으로 유일하게 pure한 DNA의 기준(1.8~2.0)에 부합되는 것을 알 수 있다. 반면 concentration값은 제일 낮은 것을 알 수 있는데, 이것은 전기영동 결과를 보면 알 수 있다. 1~4조의 band중 1조의 band값이 가장 얇은 것으로 보아 DNA함량 또한 낮은 것을 알 수 있고 이것은 DNA concentration의 결과 값에도 영향을 주게 된다는 것을 알 수 있다.▶ 2조의 Ratio 값 역시 1.78로 pure한 DNA의 기준에 거의 부합되는 것을 알 수 있으며 DNA concentration은 100(기계값)으로 가장 높은 수치를 기록하고 있다. 이것은 전기영동 결과를 보면 알 수 있다. 2조의 band가 가장 두껍게 형성되었다. 이것은 다량의 DNA를 함량하고 있다는 사실을 입증해 준다. 결국 DNA concentration이 높게 나온 것이다.▶ 3조의 경우는 Ratio 값이 2.6으로 상당히 높게 나왔다. 280nm에서의 흡광도는 낮지만 260nm에서의 흡광도는 상대적으로 상상을 초월한다. 결국 2.6이라는 Ratio 값을 형성하게 되었고, 이것은 RNA 즉, DNA와 같이 260nm에서 흡광도가 높은 물질이 많이 섞여 있다는 것을 말해준다.▶ 4조의 경우는 Ratio 값이 1.5로 다른 조에 비하여 상당히 낮은 값을 기록하였다. 이 수치를 통해, 280nm일 때의 흡광도가 높다는 것을 알 수 있다. 즉 protein과 같이 280nm에서 빛을 잘 흡수하는 물질이 많다는 것으로 판명되어 진다. 또한 320nm일 때의 흡광도를 살펴보면, 3조의 값이 제일 낮은 반면 4조의 값은 유난히 큰 것을 확인할 수 있다. 이 수치를 통하여, 320nm의 범위에서 빛을 흡수하는 액체 물질들이 많다는 것을 알 수 있다. 결국 4조가 불순물이 가장 많이 섞였다는 것을 알 수 있다. 이것은, 320nm에서의 흡광도가 낮게 나와야 순수하게 나왔다는 과학적 이론에 근거한다.■ Ratio 값 < 1.8: Ratio값은 다음과 같은 식으로 정의된다.이 식에서 280nm의 값이 높아진다면 Ratio의 값은 점점 낮아지게 된다. DNA같은 경우, 260nm에서 흡광도가 가장 높은 반면, protein이나 carbohydrate는 280nm에서 흡광도가 가장 높다. DNA에는 히스톤 단백질처럼 DNA를 감싸고 있는 단백질이 존재한다. 물론 실험과정 중에 단백질을 제거하지만 완전히 제거할 수는 없다. 결국 Ratio의 값이 낮아진다는 의미는 protein과 carbohydrate 같은 불순물이 많다는 것을 의미하며, 동시에 DNA sample의 순수도가 낮다고 말할 수 있다.

자연과학| 2009.06.24| 4페이지| 1,000원| 조회(749)

DNA, Agarose gel, DNA purification, gel, aga..

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Gene cloning 실험 (오류의 원인)

Gene Cloning- 결과 Report -■ 오류의 원인: 재조합 DNA 분자를 구성하는 과정에서 그 최종 산물에 어떤 다른 DNA 분자가 존재하지 않을 정도로 순수하기는 힘든 일이다. Ligation 혼합물은 원하는 재조합 분자뿐만 아니라 다음과 같은 분자들을 소수 포함할 수 있다.1. Ligation 되지 않은 vector 분자2. Ligation 되지 않은 DNA 단편3. 삽입되는 새로운 DNA 없이 재원형화된 Vector 분자 (‘self-ligation 된’ vector)4. 잘못 삽입된 DNA 단편을 가진 재조합 DNA 분자ligation 되지 않은 분자는 박테리아 세포로 도입되어도 아주 예외적인 상황에서만 복제되기 때문에 거의 문제가 되지 않는다. 숙주효소가 이러한 DNA 단편을 절단하기 때문이다. 반면에, self-ligation 된 벡터 분자와 잘못된 재조합 플라스미드는 원하는 분자만큼 효과적으로 복제될 것이다. 그렇지만, 하나의 세포가 하나 이상의 DNA 분자를 취하는 것은 거의 일어나지 않는 일이기 때문에 원하는 분자의 정제는 클로닝을 통해서 이루어질 수 있다.각 세포는 단 하나의 DNA 분자를 취하고 하나의 세포에서 유래된 콜로니를 생성하기 때문에 결과적으로 클론은 동일한 DNA 분자만을 포함하는 세포로 이루어져 있다. 물론 다른 콜로니는 다른 분자를 포함하고 있다. 즉, 어떤 것은 원하는 재조합 DNA 분자를 포함하고, 어떤 것은 다른 재조합 분자를, 어떤 것은 self-ligation 된 벡터를 포함하고 있다. 그러므로 유전자 클로닝에서는 단순히 재조합 DNA를 세포에 도입하는 것보다 원하는 재조합 DNA를 포함하는 colony를 선택하는 것이 더 중요한 문제가 된다.≪ 세부 내용 ≫▶ CIP 처리의 오류: 제한효소 처리로 linear한 형태인 vector는 본래의 원형인 형태를 가지려는 성향, 즉 self-ligation이 되려는 성향이 상당히 강하다. closed되어 있는 vector에 insert DNA 삽입은 아무소용 없게 된다. 이것은 제한효소를 처리한 vector에 alkaline phosphatase(CIP)로 5’-phosphate를 제거함으로써 self-ligation 을 방지할 수 있다. 하지만 CIP 처리에도 불구하고 self-ligation이 일어나게 되어 우리가 원하는 gene cloning의 효율을 떨어뜨릴 수 있다.< alkaline phosphatase, Calf intestinal(CIP) >▶ Moral ration의 오류: ligation시 insert DNA 와 vector 비율을 적절히 맞추어야 좀 더 효율적인 결과를 얻을 수 있다. 이러한 과정을 보통 ‘Moral ration’이라 부르는데 쉽게 말해 insert DNA 와 vector의 ‘개수’를 맞추는 것이다. 여기서 주의해야 할 것은 O.D측정에서 나오는 값 또는 전기영동한 band의 굵기에 대해 서로 비슷하더라도 동일하게 생각하면 안 된다는 것이다. 예를 들어 큰 구슬 한 개 와 아주 작은 구슬 한 개 는 서로 숫자면 에서는 같지만 크기는 다른 것이다. 즉 개수는 같아도 농도 나 band의 굵기는 다르다는 것이다. 실제적으로 insert DNA의 염기서열이 2000bp 이고, vector가 4000bp라면 O.D값 또는 DNA band의 크기가 vector에 비해 insert가 2배가 될 때 아주 정확하지는 않아도 수적으로 1:1 비율이 된 다는 것을 예측할 수 있다. 일반적으로 sticky end일 경우 insert : vector = 3 : 1로 하며, blunt end일 경우에는 5 :1로 하는데 어느 정도 유동성이 있으며, 보통 4:1로 하기도 한다.Moral ration이 정확하지 않을 경우 insert gene이 vector로 효과적으로 삽입되지 않게 되어 효율이 떨어질 수 있다.▶ Plasmid prep.에서 S2 용액 과량 첨가 오류: S2, S3 buffer 등의 시약을 과량 혹은 소량으로 넣어주는 등의 실험상의 실수를 들 수 있다. 예를 들어, S2(SDS, NaOH)를 실수로 과량으로 넣어주었을 경우 NaOH에 의해 solution이 급격하게 알칼리성이 되면서 plasmid DNA마저도 denaturation될 수 있기 때문이다.▶ 전사 or 해독의 문제: insert 된 DNA로부터 정확한 전사나 해독이 되지 않을 수 있다는 것이다. 또한 세포 속으로 insert 된 gene이 세포 속에서 계속적으로 지속되지 못하고 도태되어 질수도 있다. host cell 내에서 계속적으로 지속되기 위해서는 insert 된 DNA 분자가 host cell DNA 분자 속으로 삽입되든지, 아니면 DNA절편이 스스로 복제될 수 있어야 한다. 그러나 대부분의 DNA 절편들은 origin of replication을 가지는 replicon이 아니기 때문에 그들의 숙주세포가 계속적으로 분열하는 과정에서 소실될 것이고, 비록 DNA 절편이 replicon이라 하더라도 이질 host cell 속에서 그의 기능이 발휘되지 못할 수도 있기 때문에 host cell 내에서 계속 유지되지 못할 수도 있다. 또한 DNA절편들은 host cell DNA 분자 내로 insert될 수도 있고 안 될 수도 있다.▶ Restriction systems: 많은 Bacteria들은 transformation 효율에 영향을 미칠 수 있는 restriction systems를 가지고 있다. 이들 restriction systems의 완전한 기능은 아직 밝혀지지 않았으나, 그들이 하는 하나의 역할은 이질 DNA를 식별해서 파괴하는 것이다. 그러므로 transformation 실험을 할 때는 일반적으로 restriction systems를 가지고 있지 않은 대장균 돌연변이 균주를 사용한다.

자연과학| 2009.06.24| 3페이지| 1,000원| 조회(801)

오류, gene, cip, cloning, genecloning, S1, S2

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