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[생명공학실험]세포고정화 평가A+최고예요

1. 실험 목적Alginate와 SrCl2를 이용한 발광미생물의 고정화 방법은 immobilized cell이 free cell보다 안정성이 증가되고 우수한 생존력을 유지한다는 예로써 새로운 균활력 유지 방법을 이해한다.2. 실험 원리1) Sodium Alginate (USPNF, BP : Sodium alginate , PhEur : Natrii alginas)알긴산나트륨은 해조류인 김, 파래, 우뭇가사리, 미역, 다시마 등의 세포벽에 풍부하게 존재하는 친수성, 콜로이드성 및 음이온성 다당류의 일종으로서 미역의 경우에는 전체 중량대비 약 40%에 육박하기도 한다. 알긴산은 해조류 외에도 Pseudomonas aeruginosa와 같은 미생물에서 분비되기도 하며 해조류에 포함된 산을 묽은 알칼리로 추출한 후 알칼리에 녹지 않은 잔여물을 여과하고 미네랄산으로 침전시켜 얻는다. 알긴산은 가지 사슬이 없는 (β-1,4) 결합의 만누로닉산(β-D-mannuronic acid)과 글루로닉산(α-L-gluronic acid)이 그 조성과 함량면에서 무작위로 결합되어 형성된 고분자이며 각 성분의 구성비율은 채취한 원료에 따라 달라진다.1966년에 Haug 등은 알긴산은 3개의 블럭 즉, M-블럭, G-블럭, 및 MG-블럭으로 이루어진 혼합 폴리머라고 밝혔으며, M-블럭과 G-블럭의 각각의 반응성, 특히 칼슘이온과의 반응에서 현저한 차이가 있다고 발표하였다. 알긴산은 칼슘, 마그네슘 등과의 혼합된 염의 형태로 세포벽을 구성하며 칼슘이온의 존재하에서는 투명한 구형의 겔을 형성하는데 이는 NMR 등을 통한 연구로 밝혀졌다.생체내에서는 알긴산 소화 효소가 없기 때문에 대사되지 않으며 주로 식품의 안정성 등의 향상을 위한 첨가제로 사용된다. 그 밖에도 알긴산은 치과재료, 제약, 잉크, 화장품, 염료 및 폐수 처리시에도 널리 이용되고 있는 유용한 고분자이다.알긴산나트륨은 정제수에 녹아 미황색을 띄는 투명한 점성이 있는 액상으로 되며 칼슘, 마그네슘, 바륨, 카드뮬, 동, 아연, 코발G-블럭에 의하여 형성되는데 2개의 G-블럭은 칼슘이온을 사이에 두고 그물상의 구조를 형성한다.겔의 형성시 칼슘이온이 충분히 존재하면 글루론산이 많은 종류의 알긴산으로 만들어진 미세립구가 견고하며, 만누론산이 많은 알긴산으로 미세립구를 만들면 탄력성이 우수한 비드(beads)를 만들 수 있다.보통 염화칼슘 수용액에서의 경화시간은 대략 7분 이내로 알려져 있으나 beads의 크기에 따라 차이가 크게 나타날 수 있다. 따라서 염화칼슘액에서의 반응시간은 각각의 의약품이 가지는 특성을 고려하여 정하는 것이 좋다. 즉 부득이 수용성 약물과 같이 제제 공정 중 손실이 예상되는 약물은 반응시간을 짧게 하여 신속하게 미세립구를 회수하여야 한다. 그러나 이때 너무 빨리 회수하면 미세립구의 내부에는 고형화가 진행되지 않았거나 지연되는 경우가 생길 수 있다. 이러한 특성은 제약학적으로 이용 가능한 대부분의 약물에 적용이 가능하여 구형의 beads 형태로 제조가 가능하다. 또한 알긴산나트륨은 산성영역의 pH에서는 구조가 더욱 치밀해지는 경향이 있어 위액과 같은 산성 조건에서 매우 불안정한 약물에는 유용하게 적용할 수 있다. 낮은 pH로 인해 구조가 치밀해진 알긴산 비드는 pH 7.0 이상의 인산염완충액에서 재팽윤이 일어나지만 증류수에서는 재팽윤이 일어나지 않는다. 그러므로 약물이 함유된 알긴산비드는 경구 투여시 위장에서는 구조가 치밀해져 약물을 보호하며 소장에 도달하면 재 팽윤되어 약물이 방출되는 특성을 가지고 있다. 이와 같은 알긴산의 특성은 산에 불안정한 약물의 전달, 약물의 방출 조절 및 경구 투여시 독성이 없는 장점을 가지고 있다.용도별 사용농도는 파스타 및 크림의 제조시 5-10%, 에멀젼의 안정화제 1-3%, 현탁화제 1-3%, 정제의 결합제 1-3%, 정제의 붕해제로는 2.5-10% 정도의 농도로 사용된다.2) 효소의 고정화 (immobilized Enzymes)(1) 고정화 하는 이유① 열, 산, 연기, 유기용매 등에 불안정하며,② 효소반응이 진행되는 환경 하에서도 생산되는 물질이 효소가 전혀 없는 상태④ 효소의 농도의 조절이 용이하며, 정확함⑤ 효소의 안정성이 증가됨⑥ 여러 가지의 효소를 동시에 사용하는 multi-enzyme 반응이 가능⑦ 상업적, 의약학적 이용에 무궁무진한 잠재력이 지님⑧ 폐수의 발생을 줄일 수 있다⑨ 반응생성물의 분리정제가 용이하다 : 착색물질 등의 협잡물의 혼입방지⑩ 단위생산량 수율증가(3) 효소 고정화의 단점① 고정화방법에 따라서 효소의 입체구조가 변화되어 활성 감소② 고정화에 따른 물질전달저항->유리효소에 비하여 격렬한 반응조건요구3) 일반적인 고정화 방법결 합(bonding)물리적 결합(carrier없이 cell끼리의 결합)응집 (flocculation)흡착 (adsorption to surface carriers)화학적 결합(carrier없이 효소끼리 결합)carrier와의 결합 (carrier의 표면)효소끼리의 결합 (cross-linking)포 획(entrapment)gelation (주로 세포의 고정화에 많이 사용)encapsulation (주로 효소의 고정화에 많이 사용)< 고정화 방법 >(1) 화학적 방법가. 공유결합법- 효소를 수불용성 담체에 공유결합시켜서 고정화하는 방법- 작용기: ① 아미노기, ② 카르복실기, ③ 수산기, ④ 이미다졸기, ⑤ 페놀기 등- 효소와 담체간에 별도의 연결물질(linker)을 이용하기도 함- 이온결합법에 비하여 반응조건의 설정이 까다롭고, 반응조작이 복잡- 비교적 격렬한 조건에서 반응시키므로 단백질의 고차구조에 변화가 일어나 활성이 높은 고정화 효소를 얻기 어려우며 효소의 반응특성에 변화(단점)- 효소가 담체와 공유결합으로 강하게 결합하고 있으므로 고농도 기질용액이나 염류용액 등에 의하여 쉽게떨어지지 않는다(장점)- 고정화 담체의 재사용은 불가능하다.나. 가교법- 이온결합법, 공유결합법과는 다르게 수불용성 담체를 사용하지 않고 고정화함- 둘 이상의 작용기를 갖는 시약(multifunctional reagent)을 사용하여 효소끼리 결합시켜서 고정화- 변화가 적음- 담체와의 상호작용이 약하기 때문에 효소가 탈착되기 쉽다.- 담체: 활성탄, 다공성 유리, 산성백토, 알루미나, 실리카겔, hydroxyapatite, 점토, 금속산화물 등과 같은 무기물나. 포괄법- gel의 미세한 격자 내부에 효소가 들어가게 하여 누출되지 않는 상태로 고정화- 효소의 화학적인 변형이 없으므로 효소의 특성이 변하지 않는다- gel을 형성하는 과정에서 실활될 수도 있음- 원료: polyacrylamide, urethane polymer, 광경화성 수지, κ-arrageenan, 알긴산, 펙틴, 키토산 등- 포괄법은 효소의 고정화보다는 세포의 고정화 방법으로 많이 사용됨다. Microencapsulation법- 반투막의 미세캡슐(microcapsule)안에 효소를 고정화- 효소의 미세캡슐은 대개 지름이 수 μm에서 수백 μm인 구형- 효소를 둘러싼 막은 친수성 성분과 소수성 성분의 접촉중합 기술에 의하여 형성라. 막을 이용하는 방법- 효소를 담체에 직접 부착시키는 것이 아니라 적당한 pore size를 같은 막으로 효소를 격리시키고 기질과 생성물의 출입은 자유롭게 하여 상대적으로 효소를 고정화- 한외여과막(ultrafiltration membrane)(3) 혼합법- 혼합법은 물리적인 방법과 화학적인 방법의 장점을 이용한 복합적인 고정화방법-효소를 담체에 흡착시킨 후 가교형성시약으로 효소와 담체, 효소와 효소간을 가교결합으로 연 결하여 고정화하는 방법- 흡착법의 단점인 효소가 쉽게 탈착되는 성질을 가교결합으로 보완- 흡착법, 고유결합법과 가교형성법을 병용하여 효소 고정화의 효율을 높이고 고정화 효소의 안정성을 향상시키려는 노력이 많이 시도되고 있음4) 효소 고정화 방법의 특징흡착법이온결합법공유결합법가교형성법포괄법제법 난이도쉽다쉽다어렵다어렵다어렵다효소 활성낮다높다높다중간높다기질 특이성불변불변변변불변결합력약하다중간강하다강하다강하다담체 재생가능가능불가능불가능불가능응용성낮다중간중간낮다높다고정화 비용낮다낮다높다중간낮다5) 효소고정화에 의해 변의 상태의 변화예) DEAE-cellulose에 이온결합 고정화 효소: 최적 pH가 산성쪽으로 이동③ 이유: 다가양이온 담체에 효소가 결합함으로써 효소 단백질의 양이온이 많아져서 고정화 효소 영역의 pH가 외부 용액의 pH보다 알칼리성이 된다.=> 실제의 효소반응은 사용하는 반응액의 pH보다 알칼리쪽에서 수행되는 것이므로 겉보기 최적 pH는 산성쪽으로 이동한다.=> 고정화효소의 미세환경효과 (microenvironment effect)④ 음이온 전하를 갖는 CM-cellulose에 효소고정화 => 최적 pH는 알칼리쪽으로⑤ 포괄법 고정화: 효소자체는 변화하지 않으므로 최적 pH가 이동하지 않음(3) 최적 온도① 최적온도가 높아지는 경우가 많으며 경우에 따라 낮아지는 예도 동일한 효소라도 고정화 방법 이 다르면 최적온도에 대한 영향이 달라지기도 한다.② 아실아미노산 가수분해효소의 경우 이온결합법, 포괄법으로 고정화하면 최적온도는 높아지나, 공유결합법으로 고정화하면 최적 온도가 낮아진다고 보고되어 있다.③ 고정화하여도 최적 온도가 변하지 않는 경우도 있다.(4) 반응속도상수① 고정화 효소에서 기질과의 친화력을 나타내는 Michaelis 상수(KM)가 달라짐② 화학적인 방법으로 고정화하는 경우, KM 값이 변하는 원인 중의 하나로 담체와 기질사이의 정 전기적인 상호작용을 고려할 수 있다.③ 포괄법으로 고정화한 효소의 경우, KM 값이 높아지는 경향이 있다. 이 방법에서 기질이 gel 내 부로 확산되는 속도가 반응속도를 좌우하며, gel 내부의 기질농도가 외부보다 낮아지므로 KM 값이 증가한다.④ 통상 이온결합법, 포괄법으로 고정화한 경우 최대반응속도는 크게 변하지 않는다.(5) 안정성(stability)① 효소의 안정성 향상은 고정화 방법의 장점② 단백질 변성제, 유기용매, 효소 저해제 등에 대하여 안정성이 향상③ 이유 : 고정화에 의하여 효소 단백질이 단단한 구조가 되어 단백질 변성제에 대한 저항성이 증가하는 것으로 생각 => 많은 종류의 시약에 대한 안정성 증가다

공학/기술| 2005.11.07| 7페이지| 1,000원| 조회(1,068)

고정화, 효소고정화, 세포고정화, Sodium Alginate, immobili..

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[생명공학실험]산소전달계수 평가A좋아요

1. 실험목적생물공학의 기본요소인 미생물의 생장 및 대사특성을 연구하고, 유용생물 공학물질의 대량생산을 위해서 발효기(fermenter) 등 각종 생물반응기(bioreacter)를 사용한다. 호기성 미생물의 생장 및 대사물질의 생산은 반응기 내의 용존산소(dissolved oxygen)에 직접적인 영향을 받는다. 반응기 내에서 기체에서 액체로의 산소전달효율을 나타내기 위하여 산소전달계수(volumetric oxygen transfer coefficient, KLa)를 정의하고, 통기속도(air flow rate), 교반속도등 반응기 운전요소들이 이에 미치는 영향을 연구한다.2. 실험원리1) 발효기에서의 통기와 교반(1) 호흡호흡이란 생물이 물질(대표적인 것은 포도당)을 산화 또는 분해하여 생활활동에 필요한 에너지를 획득하는 작용이다. 호기성 미생물이나 호기성 생물은 산소를 산화의 전자 전달체로 사용한다. 대표적인 호기성 호흡인 포도당(glucose)을 이용하는 호흡은 다음과 같다.C6H12O6 + 6O2 → 6H2O + 6CO2만약 180g의 포도당(6 mol)이 있다면 이를 산화하기 위해서는 192g의 산소(6 mol)가 필요하다.(2) 고체배양고체 배양에서는 물속에 있는 것이 아니므로 여과된 공기를 주입하면 산소로 인한 문제는 없다. 하지만 고체배양에서는 수분의 양이 문제가 된다. 미생물의 대부분이 물로 되어 있고 물을 많이 필요로 하는 미생물도 있다. 이것들은 물속에서 배양하게 되고 이때 산소량이 문제가 된다.(3) 액체배양액체 배양의 장점은 물 부족으로 인한 미생물 성장방해는 걱정하지 않아도 된다. 하지만 기질인 포도당은 물에 잘 녹아 문제가 안되지만 단점은 산소가 물에 잘 안 녹는다는 것이다. 포도당과 산소의 용해도를 비교하면 포도당 6000대 산소 1정도로 안 녹는다.산소의 용해도는 1atm에서 대기 속에서는 8～10ppm밖에 되지 않기 때문에 한 번에 미생물 성장에 필요량만큼의 산소를 넣어 줄 수는 없다. 그래서 미생물이 필요로 하는 만큼 생물 반소의 최대농도는 6～8mg/l정도이다. 미생물에 따라 폭넓은 변화를 보이긴 하지만, 세포의 산소요구량은 1g/l?h 정도이다. 비록 발효배지가 산소로부터 포화되었다 하더라도 계속적으로 공급되지 않는다면, 미생물에 의해서 용존산소는 1분 내에 고갈될 것이다. 호기성 발효에서는 세포에 적절한 산소공급이 종종 호기성 발효의 결정적 요인이 되기도 한다. 심지어 산소의 일시적인 고갈이 세포를 재생할 수 없도록 손상시키기도 한다. 그러므로, 산소가 미생물에 의해서 요구되는 양을 충족시킬 수 있도록 계속해서 공급되어야 하며, 이 경우 산소전달이 세포성장 및 대사작용에 대해서 주된 제한단계(limiting step)가 된다. 실험실 진탕기의 혼합 방법은 플라스크 혹은 시험관에서의 미생물배양에 적절하며, 진탕기의 회전 혹은 왕복운동은 부드러운 혼합 및 표면통기에 효과적이다. 실험실 파일럿(bench-pilot) 및 공업화규모 발효조에서는 통기 혹은 통기없이 기계적 교반에 의해서 혼합이 이루어진다. 가장 많이 사용되는 임펠러는 평날 디스크터빈(flat-blade disk turbine) 또는 Rushton 터빈이라 알려진 디스크에 6개의 평날로 구성된 반지름방향흐름임펠러(radial-flow inpeller)이다.(5) 용존산소농도(DO)최대의 균체생산성을 얻기 위해서는, 산소 공급량은 배양계의 용존산소농도를 임계농도 이상으로 유지하면서, 균의 최대 산소 요구량을 만족시키는 것이 필요하다. 만약 배양계의 용존산소 농도가 임계농도 이하로 되면, 균의 대사 활동은 정상에서 벗어나게 된다. 그러나 발효산업에서는 반드시 균체 생산만이 목적이 아니라, 많은 대사 생산물이 목적으로 되는 일이 많은데, 이들 중 몇 가지의 대사 생산물을 목적으로 하는 발효에서는 오히려 산소부족의 상태에서 양호한 축적이 얻어지는 경우도 많다. 한편 반대로, 균체 생산에는 영향이 없는 높은 용존산소에서 양호한 축적이 얻어지는 대사 생산물도 있다. 따라서 물질생산에 최적인 용존산소농도는 균체 생산의 경우와는 다른하여 사용하면 된다.공기를 생물반응기에 넣으면 기포가 형성되고 그 계면에서부터 산소 녹기 시작하여 결국엔 세포까지 이르게 된다.※ 산소가 균체로 이동할 때① 기포로부터 액중으로의 산소이동② 용해된 산소의 배지로부터 균체로의 이동③ 균체에 의한 산소의 섭취일반적으로 기체 내에서의 산소농도는 균일하다고 가정하며, 2단계에서 산소이동의 저항은 교반속도를 증가시킴으로 해결할 수 있다. 1단계에서 산소전달은 계면의 액체쪽 경막(이중경막설에서 액경막 해당함)을 경유하는 것으로 가정하여 그 전달속도를 구한다.그림 3-11은 위 3단계의 전반적인 그림이며 3-12는 이중 경막설에 의한 계면부근의 산소의 농도를 나타낸 그림이다. 앞에서 설명했듯이 기포에서 산소가 계면을 통해 용해되고 그리고 용액중에서 교반되어 균까지 이르게 된다. 그림 3-12에서 Pg Pt는 산소 분압이며 Ct Ci는 산소의 농도이다. 액중의 산소농도는 CL이라 하고 계면의 산소 분압은 Pi라 한다.그림 3-12에서 기경막과 계면의 분압의 기울기와 계면과 액경막의 농도변화 기울기가 같음을 볼 수 있다. 여기서 산소 이동량 W에 대한 미분식으로 나타낼 수 있다.기상으로부터 액상으로의 산소전달 속도(oxygen transfer rate)는 다음과 같다.…………(1)…………(2)기경막과 계면 그리고 계면과 액경막의 기울기가 같으므로 다음과 같이된다.…………(3)a : 기?액계면의 면적(cm2)CL: 액중의 용존산소농도(mol/cm3)Ci: 계면에서의 용존산소농도(mol/cm3)KG: 기경막의 산소이동계수(mol/min?cm2?atm)KL: 액경막의 산소이동계수(mol/min)Pg: 기상에서의 산소분압(atm)Pi: 계면에서의 기상의 산소분압(atm)t : 시간(min) , W :산소이동량(mol)※ C*(포화농도)값 구하기CL은 측정 할 수 있으나 C*는 측정할 수 없어서 헨리의 법칙을 이용하여 식으로 추정하여 구한다.즉 헨리의 법칙을 이용하여 C*를 구한다. (아래(5)식을 이용하여 구한다.)헨리의 법칙은 분압이동용량계수(volumetric transfer coefficient)로 부르면서 사용하고 있다. KLa의 단위는 시간의 역수로서, 통상 h-로 나타낸다. 산소이동용량계수는 발효조의 산소이동능을 나타내는 기준이 되기 때문에, 같은 조건에서는 KLa의 값이 크면 산소이동능력이 크다는 것을 의미한다. 발효조에 공급되고 있는 산소량과 미생물에 의한 산소섭취량과의 평형이 배양액의 용존산소농도로 표시된다. 만일 발효조의 KLa가 미생물의 산소요구속도에 따르지 못할 정도로 작은 경우에는, 배양액의 용존산소농도가 그 임계농도를 밑돌게 될 것이다. 반대로 발효조의 KLa가 미생물의 산소요구속도를 충분히 만족시킬 수 있는 것이라면, 배양액의 용존산소농도는 그 임계농도보다 크며, 산소포화수준의 70-80% 정도의 값을 나타내게 될 것이다. 즉 발효조의 KLa는 배양기간에 걸쳐서 생산물 축적에 최적인 용존산소농도를 유지할 수 있어야만 한다.그림에서 보여주듯이, log(C* - CL)대 시간의 도시로 KLa를 계산 할수 있다.그림. 시간에 따른 실제 용존산소 그래프그림. 시간에 따른 ln(C*-CL)그래프3) 발효조의 산소이용량계수 ( KLa )에 영향을 미치는 여러 가지 인자발효조의 KLa 에 영향을 미치는 여러 가지 인자는 많이 알려져 있다. 통기속도, 교반강도, 배양액의 레오로지, 소포제의 존재 등이다. 배양규모의 확대에 있어서는, 작은 규모로서 확인된 최적 KLa가 커다란 규모의 탱크에서도 확보되고 있는 지가 중요하다. 다른 규모의 탱크에서 같은 KLa를 얻으려고 하면 커다란 탱크일지라도 운전조건을 여러 가지로 바꾸어가며 KLa를 측정해야 만 한다. 그러나 운전조건의 변화와 KLa와의 관계를 정량화해서, 특정의 KLa를 얻기 위해 필요한 운전조건을 예측하는 것은 불가능하다. 그래서 발효조의 규모확대나 설계에 있어서 이 문제를 어떻게 취급할 것인가가 중요하다.(1) KLa 에 미치는 통기속도의 영향단위배지 액량, 1분간의 통기량이 0.5 로부터 1.5vvm의 범위를 벗어나는 에 의해서도 크게 변화한다.(4) 거품과 소포제의 산소이동에 미치는 영향강한 통기 교반 조건이 필요한 배양에서는 종종 거품 발생이 일어나 문제가 생긴다. 극단적인 경우, 거품이 공기 출구나 시료 채취라인 등으로부터 분출되게 되어, 배지나 생산물의 손실뿐 만 아니라 오염의 기회도 증가하게 된다. 거품의 존재는 또한 산소 이동 속도에도 마이너스 효과를 가져온다.4) KLa값의 측정발효기 내의 적절한 용존산소농도를 유지, 제어하기 위해서는 산소전달계수( KLa )의 정확한 측정이 필요하며, 이를 위해서 산소수지법(oxygen balance method), 비정상상태법(dynamic method), 아황산 산화법(sulfite oxidtion method) 등이 사용되고 있다. 산소수지법에서는 정상상태의 발효기 내의 유입산소와 용존산소농도를 측정하고, 유입산소량과 유출산소량의 차이로부터 산소전달계수를 구한다. 비정상상태법에서는 초기의 무산소상태에서 산소를 공급하면서 시간에 따른 용존산소농도를 측정하여 산소전달계수를 구한다. 아황산 산화법에서는 발효기 내의 용존산소농도의 직접 측정에 의하지 않고, 액체내 용존산소에 의한 sodium sulfite의 sodium sulfate 로의 산화속도를 측정하여 산소전달계수를 구한다.(1) 아황산 산화법을 이용한 ( KLa ) 값의 측정발효기 내의 용존산소농도를 직접 측정하는 것이 아니고, 구리 이온을 촉매로 하여 sodium sulfite가 sodium sulfate 로 산화되는 속도를 측정해서 산소의 전달속도를 알아내는 것이다.이 반응계에 산소가 들어오면 모두 아황산의 산화에 즉시 사용되기 때문에 아황산의 산화 속도와 산소 이동속도는 같다고 가정한다. 이 측정계에서는 실제로 용존산소농도가 0 이기 때문에 다음식이 성립한다.여기서 OTR 은 산소전달속도를 의미하고, P 는 공기중 산소의 압력, H 는 산소의 Henry 상수이다.실제 측정 절차는 다음과 같다. 먼저 발효조에 10-3M의 Cu2+이온을 첨가한 0.5M의 아황산 나트륨

공학/기술| 2005.11.07| 10페이지| 1,000원| 조회(2,153)

산소전달계수, 생물반응기, 발효기, KLA, 산소이용량계수

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[생명공학실험]미생물 생장곡선

1. 실험 목적이 실험은 일정 부피 내에 존재하는 세포의 수를 정량적으로 산출하여, 생물반응기(bioreactor) 내에서 세포의 증식(생장, growth)이 어떤 형태의 속도론(kinetics)을 따르는지 측정하고 분석하는 데 그 목적이 있다.2. 실험 원리1) 생장곡선일반적으로 실험실에서 세포를 배양할 때는 회분배양법(batch culture)이 주로 쓰인다. 회분배양이란 일정한 용기 내에 일정량의 배지를 넣고 세포를 접종하여 일정한 시간 동안 배양하는 방법이다. 이때 세포의 생장 상태를 관찰해보면 그림 2-1과 같으며 4가지 단계로 이루어져 있다. 아래의 그림에서 X축은 배양시간을 의미하는데, 동ㆍ식물세포의 경우 세포분열에 걸리는 시간이 미생물의 경우보다 매우 느리므로 생장곡선의 단계에 대한 시간이 미생물배양의 경우보다 매우 길다.< 세포의 생장곡선 >세포의 생장곡선의 각 단계별 특성을 보면 다음과 같다.(1) 유도기(lag phase)신선한 배지에 접종하였을 때 초기에는 수적인 증가가 나타나지 않는 기간 을 관찰할 수 있는데, 이기간은 세포가 새로운 환경에 적응하는 시간으로 간주될 수 있다. 보통 지체기의 세포는 크기가 매우 작고 분열은 아직 시작하지 않고 있다. 탄소원의 수와 종류 등에 영향 (이용에 필요한 효소의 생산 시기)이며 생합성을 하기 위한 전구물질의 생산한다. 지연기의 정도는 접종균의 상태에도 영향을 미친다.(2) 지수 성장시(exponential phase)적응 후 충분한 영양소를 이용, 지수적으로 증가하는 시기이다. 대부분의 세포가 성숙한 크기에 이르고 분열을 개시하게 될 시점으로부터 시작된다. 이즈음에서 개체군의 폭발적인 증식이 시작되어진다. 개개의 세포는 매 수분마다 두 배가된다. 대수기 동안에는 약간의 세포가 죽어가기는 하지만 세포증식율은 사멸율(death rate)을 훨씬 초과한다. 이 단계에서 성장률은 일정한 환경 조건하에서는 일정하다. 곡선의 기울기는 각 세포에 따라 특징적으로 나타난다. 대수기는 기질이 제한되거나 독성물질이 계(system)에 축적되어질 때 끝난다. 이 시점에서 사멸율과 성장률은 동일 하게된다. 이 때가 정상성장기(stationary phase)이다. 마지막 사멸기(death phase)에 도달하면 세포가 증가하는 것 보다 빨리 죽어가므로 개체군은 감소한다. 세균의 성장곡선은 통계학적인 현상(statistical phenomenon)으로 고려된다. 따라서 곡선의 한 점에서 어떤 단일세포(single cell)는 통계학적 개체군의 상(phase)에서 벗어날 수도 있다.(일반식) △ = dX/dt = μ X → (1/X) dX = μ t(적분) In(X/X0) = μ tX = X0eμ t※ 세포의 배가시간 (doubling time, td)In(X/X0) = μ t → In(2X0/X0) = In2 = μ td(정리) td = (In2)/μ = 0.693/ μ(3) 정지기(stationary phase)보통 세포분열을 계속하던 세포들이 일정한 수에 이르면(세균의 경우 10g/ml) 세포분열을 멈추게 된다. 그 이유는 영양분과 같이 세포의 생장에 필요한 물질 등의 고갈도 이유가 될 수 있다. 그래서 필수영양소의 고갈 및 독성 산물의 축척이 이우러 진다. 내인성대사 세포내의 저장물질을 분해하여 생체물질 합성 및 유지에너제 사용되기도 한다. 동ㆍ식물 세포의 경우 최근에는 형질 변환된 세포들은 매우 오랫동안 정지기에 들어서지 않거나 지수 성장기를 계속할 수 있는 것으로 알려져 있다.(4) 감소기(death phase)정지기에서 세포분열을 멈추고 있던 세포들은 결국 시간이 지남에 따라 죽게 되어 살아 있는 세포의 수적 감소를 보이는 감소기에 이르게 된다. 특히 지수성장기에서의 세포의 양적인 증가는 다음과 같은 수식으로 나타낼수 있다.lnX = lnX0 + μtX0 : 배양초기의 세포의 양(initial cell mass) (g/L)X : t 시간 후의 세포의 양(cell mass after time t) (g/L)t : 배양 시간μ : 단위시간당 단위 세포의 양의 증가를 나타내는 비례상수, 즉 비성장속도 (specific growth rate)이 식을 μ에 대하여 정리하면 다음과 같다.μ = 1/t ln(X/X0)따라서 지수성장기에 있어서 시간경과에 따른 세포의 양의 증가를 반로그그래프지에 그리면 직선이 된다. 이렇게 직선이 되는 것은 이 기간 동안 비성장속도, 즉 μ의 값이 일정하기 때문이며, μ값은 직선의 기울기가 된다. 폐쇄적인 액체 회분배양으로는 세포로 하여금 지수성장을 지속적으로 유지하게 할 수가 없다. 그러나 생물공학적 측면에서 계속적으로 세포를 생산할 필요가 있거나 세포의 2차 생성물을 지속적으로 얻어 내어야 할 경우에는, 세포의 지수성장기를 계속적으로 유지시킬 필요가 있다. 이때 사용되는 방법이 연속배양법(continuous culture)이며 신선한 배지를 지속적으로 주입하고 생성되는 세포를 지속적으로 수확함으로써 배양액의 배지 조성과 세포의 양을 일정하게 유지시킴으로써 세포의 지수 성장기를 유지시킬 수 있다.2) 세포농도의 정량배양액 중의 세포 농도의 정량은 미생물 생장에 포함된 반응속도(kinetics)와 양론적인 관계의 결정에 있어서 필수적이다. 직접적인 방법은 많은 경우에 배지 내의 부유 고형물질이나 기타 측정을 방해하는 물질 때문에 적용이 곤란하다. 필요한 정보의 유형과 대상 시스템의 성질에 따라 세포 수와 질량들 중의 하나를 정량하게 된다. 하나만을 측정할 경우 세포의 질량 농도를 세포의 수밀도에 비해 더 빈번히 사용하나 두 가지를 조합하는 것도 종종 바람직하다. 미생물의 개체 수를 측정하는 방법은 크게 두 가지로 나눌 수 있는데, 살아 있는 세포 수만 측정하는 방법과 전체 세포(죽은 세포도 포함)를 측정하는 방법이 그것이다.(1) 세포수 밀도의 결정① 헤모사이토미터 (hemocytomter)? 총균수를 측정하는 방법? 일정한 부피에 존재하는 미생물의 수를 현미경으로 관찰, 간격이 일정하게 정해진 격자구조가 배양 챔버 위에 있어서 현미경을 통해 한 칸 당의 세포수를 직접 셀 수 있다.? 신뢰성을 갖기 위해서는 적어도 20칸 이상을 세어 평균을 내야함.? 생균수를 측정하기 위하여 염색방법을 이용? 사상곰팡이는 현미경 계수가 어렵다.????????????② Colony count (plate count)? 적절한 고체 배지에 일정한 양의 미생물 배양액을 희석하여 도말? 적당한 온도에서 일정 시간 배양하여 나타나는 콜로니 수를 계측? 박테리아나 효모에는 적합하지만 사상균에는 적합하지 않음.? 한개의 세포로부터 눈에 보이는 콜로니를 얻기 까지25세대 정도가 소요.? Culture 내의 미생물 수가 너무 많기 때문에 보통 1/10씩 여러 번 희석하여 측정한다. 최종적으 로 희석한 용액을 agar 배지에 옮겨 기른 다음에 거기서 나온 콜로니를 센 후에 그 수에다가 희 석한 정도를 곱하여 처음 용액 안의 미생물 개체 수의 농도를 측정한다. 보통 농도는 1ml 당 미 생물의 개체 수로 정의된다.100 ㎕ 100 ㎕ 100 ㎕900 ㎕ 900 ㎕ 900 ㎕1:10 1:100 1:1,000100 ㎕ 100 ㎕ 1 ml1 ml1:1,000 1: 10,000Culture1:100 1:1,000③ Coulter counter? 세포가 갖는 높은 전기저항에 기초? 세포를 포함하는 전해용액이 오리피스(orifice)를 통과할 때 저항이 발생? 이 저항을 맥동 현상(pulse)로 변환하여 세포 수를 계산? 입자가 없는 배지내에 각각 떨어져 존재하는 세포에 적함, 사상균에는 적합하지 않음? 산란광의 세기는 세포농도에 비례? 세포의 입자의 농도가 충분히 낮을 때 좋은 결과? 보통 미생물의 경우에는 전도도가 없기 때문에, 위 기기를 사용하여 얼마나 전기 전도도가 떨어 졌는가를 측정하여 대략적인 미생물의 균체량을 측정하는 방법이다. 간단하면서 정확한 방법이 지만, 비용이 많이 든다는 단점이 있다.< Coulter counter >④ Filtration count거의 plate count 방법과 비슷하다. 배지를 millipore filter를 통해 걸러내면 filter의 표면에 미생물 이 붙게 된다. 그것을 agar medium이 있는 plate에 놓고 배양시키면 colony가 형성되는데, 이것은 filter를 통과한 용액에 들어있는 미생물의 수와 같다. 이것은 liquid나 gas상태의 큰 부피 속에 들어 있는, 적은 양의 미생물 수를 측정해낼 때 사용한다.⑤ Most probable number (MPN)Plate count의 방법과 비슷하게 계속 배지를 1/10씩 희석한 다음 최종 3개의 희석된 sample에서 의 세포 수를 측정한다. 보통 sample 수가 많을수록 결과가 정확한데, 경제적인 면을 고려해 볼 때 3개가 가장 적당하다. 3개의 sample에서의 미생물 개체 수를 측정하였으면, 그것을 MPN 표와 비교 한 후 거기에다가 3개의 sample 중에서 가장 농도가 높은 sample의 희석 factor를 곱하여 원래 있 던 용액 속의 미생물 균체량의 농도를 구한다. MPN 방법은 liquid medium의 미생물 농도나, mixed culture안의 미생물 개체 수를 구할 때 많이 사용한다.3) 세포 질량농도▷ 직접법① 건조증량 (DCW, dry cells weight)? 가장 보편적인 직접법? 고형성분이 없는 배지에서 자라는 세포의 질량 측정? 일정한 양의 배양액을 원심분리하여 상등액을 제거 한 후 세척? 80℃에서 24시간 건조하여 무게를 측정② 충전세포부피 (PCV, packed cell volume)? 배양액 중의 세포 농도를 신속히 측정? 표준조건하에서 원심분리한 후, 세포가 차지하는 부피 측정? 상대적인 간접법으로 균사를 생성한는 방선균, 곰팡이 등에 사용③ 분광계(spectrometer) 사용법? 세포가 빛을 흡수하는 성질 기초? 시료를 투과한 빛의 세기를 분광계를 사용하여 잼? 배양액의 탁도 또는 광학밀도의 측정은 다른 고형물질 또는 빛을 흡수하는 물질이 없을 경우에 신속저렴하고 간단한 세포 밀도 추정 방법

공학/기술| 2005.11.07| 7페이지| 1,000원| 조회(6,700)

유도기, 분광계, 정량, 생장곡선, 지수성장기

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[생명공학실험]동결건조

1. 실험 목적발효 공업에서 균주의 사용은 일반적으로 한천배지에 접종 후 계대 배양 하여 사용하고 있으나, 1회 계대 후 사용 한계는 길어야 40~50일 정도이다. 또한 균주의 계대 작업이 빈번히 되풀이 되어, 여러 종류의 유용한 Product를 생산하는 경우 계대 작업시간이 많이 소요되며, 연속적인 계대 작업으로 인한 유전적인 변이에 의한 균일하면서도 높은 생존도를 가지는 균주를 발효 공업에 이용하기는 쉽지 않다. 따라서 균주의 높은 활성을 잃지 않고 장기간 보존하면서 필요시 언제라도 사용할 수 있는 방법을 강구하는 것은 생물산업에 있어서 매우 중요한 일이다. 이 때문에 현재 균주의 보관방법 중 가장 많이 이용하고 있는 것이 동결건조 방법이다. 이번 실험에서는 동결건조시 미생물 생존에 미치는 영향인자(미생물 성숙도, 미생물 농도, 보호제 조성 및 보호제 종류)에 따른 영향을 검토하여 미생물 동결건조 전후의 생존도(Viability)를 연구한다.2. 실험 원리1) 동결건조많은 물질들은 안정적인 저장과 수송을 위해 건조 시 잔여 수분이 2% w/w 또는 그 이하로 유지되어야 한다. Lyophilization 또는 freeze drying 이라 불리는 동결건조는 액체 상태로 건조할 경우 발생할 수 있는 대부분의 문제점을 제거할 수 있다.물질을 동결시키고, water vapor의 부분압을 낮춤으로써 얼음을 직접 증기로 만드는 승화에 의해 얻어진다. 여기서 부분압을 낮춘다는 의미는 물의 3중점 이하로 압력을 낮춘다는 것을 의미한다(6 mbar or 4.6 Torr). 낮은 압력하에서 얼음의 형태를 가지는 수분은 열 에너지를 공급함으로써 액체로 변하는 것이 아니라 water vapor로 직접 승화한다. 승화된 얼음 결정체들은 공간을 남기기 때문에, 건조된 물질은 무수히 많은 틈을 포함하고 있어서, 수분 흡수가 용이해 재수화 (re-hydration) 시 완전하게 re-solution된다.동결 건조의 이러한 고유 성질은 “용매를 잘 흡수한다”는 그리스어로부터 유래되어 "있기 때문에 동결건조는 특히 주사제 생산에 유용하다.(1) 동결 건조의 장점① 열에 민감한 물질의 손상을 최소화하고 비활성화② 수분의 침투가 용이하고 부스러지기 쉬운 구조 형성③ 정밀하고 깨끗한 충진 가능.④ 빠르고 완벽한 재수화(Re-hydration) 가능(2) 동결 건조의 단점① 장비가 비싸다는 점. (다른 건조 방법에 비해3배 이상)② 높은 에너지 비용(다른 건조 방법에 비해2-3배 이상)③ 긴 공정시간(보통 24시간 이상의 건조 사이클을 거치나 줄일 수 있다.)2) 동결 건조의 원리일반적으로 물의 끓는점은 섭씨 100°C라고 알고 있지만 물의 끊는점은 공급되어지는 열량(칼로리)과 기압에 따라 유동적이다. 따라서 기압이 낮아지면 물의 끊는점도 낮아지게 되어 물은 충분한 감압만 유지하면 -40°C의 온도에서 동결된 채로 수증기로 전환 된다. 이 원리를 이용하여 수분을 제거 건조시키는 방법이 바로 동결건조이다.♧ 동결건조의 공정은 온도/시간과 압력/시간에 의한 다음 3단계로 구성된다.① 냉각으로 물질을 고체화 시킨다.② 승화 건조는 건조된 생산물 속에 수분이 4% w/w 내외로 줄어들고 건조 후 남은 형태는 실제 로 처음 얼려진 물질과 같은 크기, 형태를 갖는다.③ Desorption 또는2차 건조에서는 원하는 정도까지 수분을 줄여야 한다.(종종1% w/w내외)이상의3단계는 보통 제품에서 동시에 일어나기도 한다.예로, 에탄올과 같이 낮은 공융점을 가진 물질이 제품에 존재한다면 실제의 동결건조기의 온도에서 완전하게 얼지 않는다. 낮은 공융점를 갖는 구성 성분들은1차 건조과정의 초기에서 제품이 실제 동결건조가 시작되기 전에 액체 상태에서 증발 하게된다. 그것은 또한 승화 건조가 완전하게 되기 전에 그 cake의 건조된 부분에서 일부의 2차 건조가 시작되는 것이 일반적이다.승화 과정 중 증기는 cake의 외곽부터 점차 내부로 이동되는 건조 경계선에서 발생한다. 승화중인 증기는 반드시 실제의 건조 층의 틈을 통해 지나가야 한다. 그 틈들의 형태는 동결되면서 형성된을 형성하고 결정체의 열 방출은 0℃를 향하여 온도가 올라가게 한다. 그리고 나서 결정체는 Nacl과 물의 평균 melting point에 비슷하게 온도가 점진적으로 떨어지게 된다. 용액의 온도가 떨어지기 시작하면 포화가 막바지에 도달하고 용질의 결정체는 침전된다. 결국 공융점은 물질이 완전한 결정체에 도달하는 위치로 물질이 하나 이상의 용질 결정체를 포함하는 경우 유사한 현상이 나타나며 각 구성 요소의 어는점 보다 낮게 형성된다. 실제의 경우 대부분 용질은 결정화되지 않고 무결정화된 형태를 갖는다. 이 경우 공융점의 온도는 없고, 미세 구조를 유지하는 동결 건조가 가능한 최고의 제품 온도가 있다. 이것을 collapse 온도라고 부른다.동결 과정에서 수분이 얼음 결정으로 분리됨에 따라 용질의 농도가 두드러지게 증가되는 점을 감지해야 한다. 이는 농도와 PH를 급격히 변화시켜 종종 제품에 위험한 영향을 끼친다.(2) 동결 방법액체를 동결 건조할 경우, 제품의 두께를 얇게 하여 동결과 건조 시간을 감소할 수 있다. 이를 위하여 Freezing bath에서 V자 쐐기를 만들기 위해 용기를 기울이거나 수평축으로 천천히 돌리거나 또는 수직축으로 빠른 속도로 돌려 속이 빈 실린더의 모양을 형성하게 하는 등 다양한 방법이 개발되었다. 이런 방법은 상대적으로 작은 규모에 적용되어진다.대부분의 동결건조는 냉각에서 정적인 방법을 사용하는데 대부분 차가워진 표면 또는 동결건조기의 선반과의 표면 접촉에 의존한다. 멸균 제품에서는 handling과 계속적인 오염을 줄이기 위해 보통 동결건조기의 선반 위에서 얼려진다.액체의 질소를 이용하여 신속하게 동결할 수 있으나 이 같은 방법은 작은 얼음 결정체로 형성되기 때문에 주의해야 한다. 이 작은 결정체는 melting-back, collapse 또는 느린 승화 등과 같이 증기의 이탈 속도를 늦추게 한다. 이는 또한 그것 자체도 사용 전에 반드시 멸균정제 해야 한다. 만약 작은 얼음 결정이 나타나는 동결 방법을 피할 수 없다면, 상태조절 게 달라진다. 물질의 안전성이 유지되는 가장 낮은 건조온도(eutectic point)가 승화과정에서 넘어간다면, 융해가 나타난다. 이것은 쪼그라들고 부푸는 등의 제품의 실패를 늘려준다. 이것은 일부의 용질이 결정을 이루지 않고 얼려지지 않은 물과 혼합된 무정형의 “glass”가 형성되는 collapse와 때때로 혼동된다. 그 glass는 순수한 물 얼음 결정체로 지탱되어 단단하게 나타나지만 순수한 물 얼음 결정체들은 승화되어, 그 유지물들이 제거 되면 외관상으로 건조제품이 collapse되어 불침투 물질을 형성한다. 그 현상은 일반적으로 적용되는 수없이 많은 물질의 collapse 온도를 측정했던 Mackenzie 박사에 의해 설명되어졌다.열 대부분이 열전도율이 낮은 얼려진 물질을 통해 전달되어지므로, 융해를 피하기 위해서는 열 변화폭이 낮고 전도된 열이 작아야 한다. 열을 가한 후 증기는 제품의 외부에서부터 흘러나오며 승화율은 제품 cake의 건조된 부분의 길이가 길수록 제한된다. 매우 낮은 압력하의 건조과정에서 vial 아래쪽 제품에 융해 없이 동결건조 될 때 열 이동에 어려움이 있다. -20℃주변이 최대의 건조온도라면, 진공 조건 하에 선반에서부터 vial의 유리 밑으로의 약한 열 전이로 인해 선반 표면 온도를 40℃까지 올리는 것이 필요할 지도 모른다. 승화율을 저해하는 어떤 것이든 melt-back 또는 collapse 그리고 제품을 파괴할 수 있다.승화 과정 동안 선반에서 제품으로의 열 이동은 진공상태를 깨뜨림으로써 증가된다. 이것은 공기 또는 건조한 질소가스를 Drying chamber 속으로 주입하거나 또는 0.5mbar로 압력을 유지하기 위해 진공펌프의 valve를 조절하는 방법 등이 대표적인 방법이다. 이것은 가열된 선반으로부터 제품용기의 밑 부분으로 대류적인 열전달이 개선되고, 주어진 건조 비율을 위한 선반에서부터 제품까지의 온도 차이가 줄어든다. 그 기술들은 많은 연구자들에 의해 설명되어졌다. 멸균된 제품들을 위해 공기 또는 질소 가스는수분은 desortion을 통해서 제거한다. 남아있는 수분의 양은 보통 4%w/w 이내이다. 이러한 수분은 진공상태에서 제품에 열을 가해서 제거할 수 있는데, 일반적으로 15℃~ 30℃사이로 1차 건조시간의 ⅓정도로 한다.건조된 물질의 잔여 수분정도는 생명체 보관의 주요한 요소이다. 많은 생물적인 물질들은 과도한 건조에 의해 피해 입을 수 있고, 최종 수분의 양이1.5%-2% 사이에서 건조 됐을 때 최고의 적정량으로 유지된다. 예로 BCG와 같은 백신들은1.5%, 살아있는 rubella, measles와 그 이외의 것들은 2%, 화학 제제와 항생제 등의 다른 물질들은 최상의 결과를 위해 반드시 잔여수분이 0.1%보다 낮게 건조되어야 한다. 대부분의 동결 건조된 물질들은 흡습성이 있다. 그래서 반드시 용기를 봉인해서 보관하여야한다. 통용되고 있는 방법은 보통 건조 시 순수한 질소가스를 주입시켜 보관한다. Argon과 Helium등의 다른 기체들도 또한 사용되고 있다.3) 동결건조의 특징동결건조법은 원료를 빙점이하의 온도로 동결시켜 얼음의 상태에서 승화에 의해 재료내의 수분이 제거되기 때문에 재료성상의 물리적, 화학적 변화가 극도로 작고, 다시 수분을 가함으로써 복원성이 좋은 건조제품을 얻을 수 있다.① 건조에 의한 수축현상이나, 형태의 변화가 거의 없다.② 천연의 조직구조가 파괴되지 않고, 다공질 상태로 건조되어 가수시 2~3분이면 원형 상태로복원이 된다.③ 천연의 생상이나 향, 단백질, 비타민등의 영양가 변화가 없다.④ 저온에서 건조되므로 고유의 풍미나 식감의 손상이 없다.⑤ 수분 함량이 5% 이하로 건조되어 보존성이 우수하고 가벼워 운반이 편리하다.4) 장치와 용기freeze-dryer는 동결조(cold bath), 냉각기(compressor), trap, 고진공펌프, 다기관 등으로 구성되어 있다.그리고 크기와 모양은 다양하지만 기본적으로 이중의 연질유지가 사용된다. 사용 전에 반드시 살균하여 사용하고, 외부용기에는 푸른 실리카겔을 넣어 함습의 표지로 사용한

공학/기술| 2005.11.07| 8페이지| 1,000원| 조회(2,270)

동결건조, 동결, Lyophilization, 동결보존, 동결방지제

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[생명공학실험2] 생물반응기 조작 및 멸균

1. 실험 목적미생물 배양실험에 있어서 미생물을 대량으로 배양하기 위해 또는 배양환경인자의 영향을 고찰하 기 위해 사용되는 생물반응기의 조작과 멸균 요령에 대하여 알아본다.2. 실험 원리1) 생물반응기생물체에 대한 지식이 축적되어 감에 따라 이들 생물체를 인류에 유용한 방법으로 전환 조작시키 려는 노력도 급증하고 있다. 한 생물체의 유전자를 다루기 쉽거나, 빨리 자라는 다른 생물체로 옮겨 발현시키는 유전자 조작기술의 발달은 이제 단순한 유전자 재조합차원을 떠나 분자생물학적인 접근 으로 더욱 안정하고, 활성이 강하고, 분리 정제가 용이한 신물질을 창출하는 단계에 도달하였다.그러나 이런 생물학적 지식의 축적이 눈부신 생물공학 발전의 유일한 원동력은 아니었다. 유전공 학적으로 개발된 물질을 다른, 경쟁관계에 있는 화학적 합성이나 추출 등의 생산방법보다 경제적으 로 생산할 수 있는 응용공학적인 기술이 순수과학적인 지식의 진보와 보조를 맞추지 못했다면 생물 공학의 발전은 불가능하였다. 즉, 생물공학적 산물의 경쟁력은 원료의 경제성, 적합한 생물반응기의 존재, 분리 정제 방법의 효율뿐만 아니라, 전체 공정의 안정 재현성 등이 복합적으로 작용한다.< 미생물 배양용 생물반응기 >생물반응기는 특정 물질이나 세포를 생산하기 위해 또는 특정 반응을 수행하기 위해, 생물체를 조 절된 환경하에서 키울 수 있도록 만든 용기의 총칭이다. 생물반응기는 발효조라고도 불리나, 엄격한 발효의 의미는 미생물의 혐기적 배양을 말하므로, 대부분의 배양이 호기성임을 감안하여 생물반응기 라는 용어가 보편적으로 쓰이고 있다.따라서 적당한 생물반응기의 선택을 위해서는 키우려는 생물체 및 원하는 생산물의 생물학적, 생 화학적인 특성, 물리 화학적 성질뿐만 아니라 이들 특성에 따른 전체 공정의 설계와 생산물의 판매 전략 등까지 고려되어야 한다. 즉, 최종생산물의 경제성(결국 경쟁력)을 좌우하는 최적생산조건은, 앞에 나열한 모든 조건들이 상호 보완적으로 작용할 수 있는 적당한 반응기의 신중한 선택이 없이 는 얻는 것이 바람직하다. 다음에는 온도와 pH의 제어를 용이 하게 하기 위해 배양액의 혼합특성이 좋고, 또한 호기적 배양에서는 낮은 동력비로써 높은 산소 공 급속도를 만족시킬 수 있는 구조인 것이 바람직하다.3) 발효조의 기본구성발효조의 가장 중요한 기능은, 미생물에 그 생육에 필요한 환경을 주어서 바람직스러운 미생물을 증식시켜서 목적생산물을 얻는 것이다. 따라서 발효조의 설계와 제작에는 많은 배려가 필요하다.① 탱크는 몇 일간이라도 무균성을 유지하면서 운전할 수 있는 것이어야만 되며, 장기간의 운전에 견딜 수 있는 것이 아니면 안 된다.② 미생물의 대사에 따라서, 그것을 만족하는 통기교반이 될 수 없는 것이면 안 된다. 그러나 미생물에 기계적 충격을 줄 수 있을 정도의 교반강도가 되어서는 안 된다.③ 소비동력은 될 수 있는 한 낮은 것이 바람직하다.④ 온도제어 장치가 붙어있지 않으면 안 된다.⑤ pH 조절이 될 수 있게 하여야 한다.⑥ 시료채취가 될 수 있는 것이어야 한다.⑦ 발효조로부터의 증발손실이 극히 적을 것.⑧ 발효, 배양물의 배출, 세정, 보수유지 등에 필요한 노동력은 극히 적지 않으면 안된다.⑨ 공정에 적합한 규모의 크기가 아니면 안 된다.⑩ 탱크내부는 될 수 있는 한 불룩한 테두리를 없애고 매끈한 용접 마무리를 함과 동시에 탱크내부표면은 철저히 반반하게 마무리하는 것이 필요하다.⑪ Pilot plant(중간시험공장)로부터 대형 생산탱크로 규모를 확대하는 경우는 쌍방이 기하학적으로 닮은 꼴이 될 수 있게 설계한다.⑫ 만족할 수 있는 결과가 얻어지는 한, 될 수 있는 한 값싼 재료를 사용한다.⑬ 각각의 발효에 따라 다른 부대설비가 부착되어야 한다.4) 발효조의 본체구조엄격한 무균상태가 요청되는 발효에서는 , 반복되는 증기살균에 견딜 수 있는 재질을 선택하지 않 으면 안 된다. 1~30ℓ 정도의 작은 탱크는 유리라든지 스테인레스 스틸 어느 것이라도 사용되지만, 유리쪽이 표면이 반반하고 독성이 없으며 부식성도 없을 뿐만 아니라 내부가 잘 관찰될 수 있는 이g unit 16. motor17. heat exchanger 18. leg19. acid innet 20. alkali innet21. antifoam innet 22. Tem. sensor23. Do sensor 24. pH sensor25. sampling port 26. safety valve27. cooling water out , steam in28. cooling water in , steam out29. sight window30. pressure gauge31. foam sensor발효조에는 온조제어장치가 필수인데, 이것은 탱크의 설계에 크게 영향을 준다. 열은 미생물 대사와 교반에 의해서 발생하는데, 이 열량의 과부족이 공정에 영향을 주는 경우에는 외부로부터 열을 가한다든지 제거하지 않으면 안된다.5) 교반식 발효기통기의 기본적인 목적은 미생물의 대사에 필요한 충분한량의 산소를 공급하는데 있으며, 교반은 균일한 영양성분의 배지에 균체를 균일한 밀도로 분산시키는 것이라고 말할 수 있다. 사용하는 통기 교반의 방식은, 에너지 비용이 적고 간단한 장치로서 끝난다고 하는 이점이 있는데, 이것은 통기에 의해서 완전한 교반이 행해지며, 배지의 점도가 낮고, 또한 고형물 농도가 낮은 경우에 한해서 가능 하다. 따라서 곰팡이라든지 방선균의 배양에서는 기계교반이 필요하다. 교반기가 없는 발효조는 탱 크의 높이와 직경의 비, 즉 H/D가 5:1 정도의 것이 많은데, 이와 같은 동체길이의 용기에서는, 통기 에 의한 혼합은 용이하더라도 높은 압력의 압축공기가 필요하며, 에너지 비율은 높아지게 된다.(1) 교반기교반기는 다음과 같은 2가지의 주된 기능을 가진다.① 기포를 작게 분단해서 산소이동의 기액계면적을 크게 함과 동시에, 경막의 두께를 얇게 해서 확산저항을 감소시킨다.② 발효조내의 환경을 구석구석까지 균일하게 유지한다.또한 교반날개는 flow pattern에 따라 3가지로 구분된다.① paddle형 : 교반기 회전의 원주방향흐름을 일으킨다.② turbine형 Di/Dt가 1/3~1/2이어야 하며 L/Dt이 1.0이상이면 교반기를 추가로 설치해야 한다. 교반축에 여러 개의 교반 날개를 설치할 경우 고속회전시 거품을 일으키므로 탱크의 밑부분에 짧은 축의 고속교반기를 설치 하면 편리하다. 이 방법은 Waldhuf형 발효조나 acetator에 이용되고 있다.(2) 글랜드(gland)부와 베어링(bearing)교반기 샤프트의 발효조에서의 결합부를 완전하게 밀봉(seal)하는 것은 발효조의 제작에 있어서 가장 어려운 문제인데, 이것은 발효조를 장기간 무균상태에 보존하면서 운전하는 데에 필수적인 것이다.교반기의 샤프트는 위, 가로 또는 밑으로부터 발효조에 설치할 수가 있다. 상부구동구조가 널리 사용되고 있지만, 탱크 상부에 첨가물조를 붙힐 필요가 있다든지 고속회전에서의 중심동요가 일어나지 않도록 짧은 샤프트의 밑 부분 구동구조가 사용되는 경우도 있다.(3) Packed-gland seal(stuffing box)Packed-gland seal 은 탱크의 글랜드부에 석면(asbestos)이나 면사(cotton yarn)의 패킹을 여러 층으로 샤프트에 밀착시켜 밀봉한 것이다. 고속회전에서는 패킹의 마모가 심하며, 기밀성의 보존유지를 위해서는 양을 증가해서 단단하게 얽어매는 것이 필요하다. 이 패킹은 열처리를 해서 구석구석까지 살균하는 것이 불가능하다. 그 때문에 정기적으로 점검을 하고 필요에 따라서는 패킹을 교환한다.(4) Bush sealBush seal법은 실험실용 소형 발효조(jar fermenter)를 위해서 개발된 것으로서 oilite또는 테프론 (teflon)의 간단한 부시(베어링통)를 기름 시일(oil seal)과 병용 또는 기름 시일 없이 사용한다. Magnolia 베어링의 회전체 시일 부분과 oilite의 고정체 부시 시일부분과의 맞춤회전으로서 무균밀봉을 행하고 있다. 베어링의 맞춤회전부분에는 윤활유의 급유구멍이 열려 있어서 살균에 앞서서 윤활유를 급유한다.(5) Mechanical sealMechanical ssing)의 베어링에 의해서 부착되며, 한편 발효조 내의 회전자석은 교반기 축의 말단에 외부자석과 대면해서 부착되어 있다.(7) Baffle (유체조절판)어떤 크기의 교반조라도, 소용돌이의 발생을 방지하고, 통기효과를 증대시키기 위하여 통상 4매의 유체조절판을 부착한다. 유체조절판은 탱크 직경의 약 1/10폭의 금속판으로서, 탱크중심을 향해서 기벽에 수직으로 부착한다.(8) Sparger (공기분산 유입관, 통기관)Sparger는 공기를 발효중의 배양액에 보내 넣는 장치이다. Sparger를 단독으로 사용하든지, 기계교반과 병용할 것인가에 따라서 Sparger로부터 나오는 기포의 크기에 커다란 차이를 만들며, 이 때문에 장치의 설계에 중대한 영향을 준다.(9) Porous sparger(구멍이 많은 통기관)소결유리(유리 여과기) 또는 소결금속 등은 실험실용의 교반기가 없는 jar fermenter에 사용되고 있다. 이 타입의 통기관으로부터 만들어지는 기포의 전표면적은 aerator(통풍장치)에 사용되고 있는 소재의 구멍크기보다 10∼100배로 된다고 한다.(10) orifice sparger(천공관)교반기가 부착되어 있든, 없든 여러 가지 발효조에서 파이프에 다수의 구멍이 있는 통기관이 사용되고 있다. 소형 교반기 부착 발효조에서는 크기가 교반기 직경의 3/4 정도의 원형 또는 십자형의 통기관을 최하단 교반날개의 밑에 부착한다. 대부분의 통기관은 원형 또는 십자형의 파이프의 하면에 공기 송출구멍이 뚫어져 있다.(11) nozzle sparger(노즐 통기관)실험용의 소형 발효조로부터 커다란 공업용 발효조까지 가장 근대적인 발효조는 통기관을 사용하고 있다. 이상적으로는 파이프가 교반기 밑 중앙에 위치하도록 설치하고 커다란 기포의 격렬한 유출이 일어나지 않도록 교반날개와 파이프 선단과 될 수 있는 한 거리를 유지하게 한다.6) 무균성의 확보와 그 유지통기교반에 관한 설계조건이 명확해지면, 다음은 그 공정에 따른 무균성의 확보가 필요하게 된다. 발효조는 여러 가지

공학/기술| 2005.04.09| 8페이지| 1,000원| 조회(1,484)

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