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PCR(중합효소연쇄반응)

1. PCR (Polymerase Chain Reaction, 중합효소 연쇄반응) 이란?중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)은 특정 DNA 부위를 특이적으로 반복 합성하여 시험관내에서 원하는 DNA 분자를 증폭시키는 방법으로서, 아주 적은 양의 DNA를 이용하여 많은 양의 DNA 합성이 가능하므로 분자 생물학적으로 제한효소의 발견만큼 획기적인 것이라고 할 수 있다. 즉 genomic DNA와 같은 아주 큰 DNA로부터 원하는 DNA 부분만을 선택적으로 증폭시킨 후 일반적으로 사용되는 agarose gel이나 polyacrylamide gel 상에서 뚜렷하게 보이는 band로 가시화할 수가 있다.중합효소 연쇄반응을 통하여 in vitro상에서 특정 부위의 DNA를 105～108배까지 수시간내에 증폭시킬 수 있으며, 이렇게 증폭된 DNA를 다음과 같이 여러가지 실험에 이용할 수 있고, 실험 결과를 토대로 여러 의학적인 연구에 응용할 수가 있다.< PCR 반응이 이용되는 실험>1) 병원성 바이러스 및 박테리아 검출2) 적은 양의 mRNA로부터 특정 cDNA의 cloning3) DNA sequencing4) 돌연변이 검사5) Probe로 사용할 목적으로 cloning된 이중가닥 DNA의 증폭6) 유전자의 footprinting7) 특정 부위에 돌연변이를 일으킨 유전자의 제조(site directed mutagenesis)< PCR 반응의 분자의학적 응용 >1) 감염성 질병의 진단 → 세균성질병, 바이러스성질병, 종양성질병, 유전성질병 등2) 법의학 → 특정인의 유전자 검출3) 암유전자의 검출 → ras, myc, fos 등4) 유전성 질병의 진단 → Progressive muscular dystrophy (Duchenne type)등5) HLA형의 결정< 중합효소 연쇄반응의 세 단계 >1) DNA의 변성(denaturation)90°C～96°C로 가열하여 double strand DNA(ds DNA)를 single strand DNA(ssDNA)로 분리시킨다. 높은 온도일수록 ssDNA로 잘 이행되지만 Taq DNA polymerase도 온도가 아주 높은 상태에서는 활성도가 낮아질 수 있으므로 보통 94°C로 쓴다. Cycle의 처음은 확실한 변성을 위하여 약 5분간 시간을 주어야 한다.2) Primer의 결합(annealing)50°C～65°C에서 진행되며, 염기간에 G와 C는 세군데에서 수소결합이 일어나고, A와 T는 두군데에서 결합이 일어나므로 G+C 비율에 따라 결합온도에 변화를 주어야 한다. 일반적으로 사용되는 annealing 온도는 표 1과 같다. 비특이 PCR 산물이 형성되는 경우 결합온도를 올려서 반응시켜 보면 비특이 산물을 줄이는데 도움이 되는 수가 있다.3) DNA의 합성(polymerization)70°C～74°C에서 시행하며 원하는 PCR 산물의 크기가 크거나 반응요소의 농도가 낮을 때에는 시간을 연장시키는 것이 좋다. Taq DNA polymerase는 보통 1분에 2,000～4,000 nucleotides를 합성할 수 있으므로 원하는 PCR 산물의 크기 1 kb마다 1분 정도의 시간을 배당하면 충분히 반응이 일어날 수 있다. Cycle이 계속되면서 효소 활성이 감소할 수 있고 DNA 산물은 점점 많이 존재하게 되므로 cycle 후반부에는 반응시간을 조금씩 늘려가는 것도 좋은 방법의 하나이며, 마지막 cycle에는 시간을 충분히(10분) 주어 효소의 활성이 충분히 발휘되도록 한다.위 과정이 계속 반복하여 진행되면서(보통 25～35회) 원하는 DNA 부분을 증폭시키는 것이 중합효소 연쇄반응의 원리이다.2. Genomic DNA로부터 특정 유전자 부위의 증폭1) 실험에 이용할 PCR 시험관에 다음과 같이 실험에 사용할 재료들을 혼합하고 pipette으로 잘 섞는다.-재료-Template DNA(100 ng/μl) 1 μlSense primer(12.5 pmole/μl) 1 μlAntisense primer(12.5 pmole/μl) 1 μldNTP(dA, dC, dG, dT 2.5 mM-each) 2 μl10x PCR 완충용액 5 μl증류수 39 μlTaq DNA polymerase(1 unit/μl) 1 μl (총 부피 50 μl)최근에 나오는 PCR 기계에 맞는 PCR 시험관은 크기가 작고 얇아서 열 전도가 잘 되도록 된 것이다. 작아서 다루기는 어렵고 비싸지만 반응이 잘 일어나기 때문에 많이 쓰인다.중합효소 연쇄반응은 대단히 민감한 반응이다. 위의 여러가지 시약들이 조금이라도 다른 물질에 오염되거나 더러운 tip을 쓰는 경우 false positive 반응이 나오는 확률이 아주 높으므로 반드시 깨끗한 시약을 조금씩 덜어서 쓰도록 하고 오염이 의심되면 버려야 한다.2) 혼합한 시료를 PCR 기계에 넣고 다음과 같은 프로그램으로 PCR을 시작한다.위 반응은 단지 예일 뿐이며 annealing 온도와 각 시간은 PCR 반응마다 여러번 실험을 반복하면서 최적 조건을 결정하여 사용해야 한다.옛날에는 혼합액 위에 증발을 방지하기 위해서 mineral oil을 얹어야 했지만, 최근의 많은 기계와 시험관은 이런 과정이 필요없도록 뚜껑 쪽에서 가열하게 되어있다.3) 반응이 끝나면 10～20 μl 정도 반응액으로 전기영동을 실시하여 반응산물을 확인한다.3. PCR 반응 각 성분에 대해 고려할 점1) Template DNA선택하여 증폭하고자 하는 target DNA 단편을 가리키는 용어로서 세포내의 chromosomal DNA나 전염성 병원체의 DNA 또는 RNA로부터 제조한 complementary DNA(cDNA), plasmid DNA 등을 쓸 수 있다. 불순물이 섞여 있으면 반응을 억제할 수 있으므로 가능한 한 정제하여 사용하는 것이 좋으며, 정제가 안된 경우에는 양이 적을때 반응이 충분히 일어나지 않고 양이 많으면 비특이적 반응이 일어나므로 주의해야 한다.Chromosomal DNA인 경우 1 μg 이내, plasmid DNA의 경우 100 pg～100 ng 정도를 일반적으로 사용하지만 사용하고자 하는 DNA 내에 증폭하고자 하는 target DNA의 copy 수에 따라 달라질 수 있다. 전기영동상에서 비특이 DNA가 나타나거나 끌린 모양이 나타나면 맨 먼저 template DNA양을 줄이는 것을 시도하는 것이 좋다.2) PrimerTemplate DNA 가운데 선택적으로 증폭시키고자 하는 target DNA 단편의 양쪽 끝에서 안쪽으로 약 20 bp 내외의 염기서열에 대응하는 oligonucleotide를 DNA 합성기로 합성하여 이용한다.G+C 비율이 반 정도 되게 디자인하는 것이 primer와 template 간의 결합력을 강하게 유지하는데 도움이 되며 G+C 함량이 많을 경우에는 annealing 온도를 높이면 되지만, 무엇보다도 양쪽 primer의 annealing 온도를 비슷하게 만들어야 한다. 또한 양쪽 primer가 서로 상보적인 염기 결합이 일어나지 않도록 하고 가능하면 반응산물내에 있는 DNA 염기서열을 분석하여 비특이 DNA가 생성되지 않도록 고안해야 한다. Primer의 디자인이 PCR 반응의 성공 유무의 90%를 차지한다고 할 수 있기 때문에 합성하기전에 신중히 고려해야 할 것이다. Primer 합성은 염기서열을 적어 바이오니아(구 한국생공) 등의 회사에 의뢰하면 주문에 따라서 정제도 해준다. 정제는 Sep-pak, OPC나 PAGE 정제를 이용하는데, 가능하면 PAGE 정제된 primer를 쓰도록 한다. Primer의 양은 0.1~0.5 μM로 시행한다.3) dNTP (deoxynucleotide triphosphate)시약상에서 dATP, dCTP, dGTP와 dTTP(각각 100 mM stock)을 구입한 후 혼합하여 사용한다. 양은 target DNA의 길이에 따라 다를 수 있으나 각각 20～200 μM 정도를 사용한다.4) 10x PCR 완충용액① Magnesium-다음과 같은 여러가지에 영향을 주는 중요한 요소이다.a. Primer가 template DNA에 결합하는 능력b. Template 및 PCR 산물의 변성온도c. Product specificityd. dNTP와의 결합e. Taq DNA polymerase의 활동성f. Primer-dimer artefact의 형성- 반응물내에 EDTA와 같은 chelator가 포함되면 농도를 올려 주어야 하고, dNTP나 template의 농도가 높으면 MgCl2의 농도를 높게 변화시켜야 한다.

자연과학| 2004.12.13| 4페이지| 1,000원| 조회(1,051)

PCR, chain, 중합효소연쇄반응, polymerase, Reaction

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항진균성항생제

항진균성 항생제● Amphotericin B? 적응증? 정제 : 소화기계의 칸디다 이상증식증? 주사 : 효모균증, 북아메리가분아균증, 모닐리아증, 콕시디오이데스증 및 히스토플라 스마증의 전신확산상태, Aspirgillus, Blastomyces, Candida, Coccidioides, Cryptococcus, Histoplasma, Mucor, Rhizopus 균주 등 감염? 작용기전: Ergosterol에 결합하여 곰팡이의 세포막 투과성을 변화시키고 세포내 성분을 유출시켜 살진균작용? 용법, 용량? 정제 : 성인 1회 1정을 1일 2~4회? 주사 : 초기용량-1일 0.25mg/kg을 정주, 1일 총 투여량 1.0mg/kg 또는 격일 투여시 1.5mg/kg을 수 개월간 투여, 1일 총 투여량이 1.5mg/kg을 초과하면 안됨.? 부작용: 저칼륨, 마그네슘혈증, 일시적 정신착란, 정맥염, 저혈압, 고혈압, 신장장애, 골수기능 저하, 피부충혈, 두통, 지각이상, 동통, Urinary retention, 뇌지주막염(arachnoiditis)? 금기: 과민반응 환자● Ciclopirox olamine? 적응증? 백선 : 피부백선, 고부백선, 한포상백선? 칸디다증 : 간찰진, 유아기 생균성, 홍반, 지지간미라증? 작용기전: 진균의 필수적인 성분의 수송을 저해하여 DNA, RNA, 단백질의 합성을 저해한다.? 용법, 용량: 1일 2~3회 환부에 도포? 부작용: 국소자극, 발적, 동통, 작열감? 금기: 과민반응 환자● Clotrimaxole? 적응증? 크림 : 알레르기성 ? 염증성 피부질환, 원형탈모증, 1도 화상, 벌레 물린데 2차 세균감염 피부질환, 피부 사상균증? 질정 : 칸디다성 ? 트리코모나스성 질염? 작용기전: 진균세포막의 인지질에 결합하여 세포막 투과성을 변화시켜 필수 세포내 성분을 유출시킴? 용법, 용량? 크림 : 1일 1~수회 환부에 도포? 질정 : 보통 성인 1일 1회 1정씩 연속 5~7일간 취침시 질내에 깊숙이 삽입, 단기요법으로 1일 1회 2정을 연속 3일간 삽입? 부작용: 간기능 검사 방해, 오심, 구토, 가벼운 자극, 작열감? 금기? 크림 : 상처 또는 점막부위, 피부결핵, 본제 및 bacitracin, aminoglycoside계 항생제에 과민증기 왕력자, 세균, 진균, 바이러스성 피부감염증, 고막천공이 있는 습진성 외 이도염, 궤양, 2도 이상의 심재성 화상, 동상, 피부궤양, 적비(딸기코), 옴● Econazole nitrate? 적응증? 크림, 연고 : 알레르기성 염증성 피부질환, 피부사상균증, 전풍, 피부칸디다증, 겐타마이신 감수성의 2차 세균감염 피부질환? 좌약 : 외음부질염, 칸디다증? 작용기전: 진균 세포막 투과성을 변화시켜서 RNA, 단백질 합성과 지질의 대사를 저해? 용법, 용량? 크림 : 1일 1~수회 환부에 도포? 질좌약 : 50mg 질정을 1일 1회 14일간 취침 전 질내 깊숙이 삽입 또는 1일 150mg씩 3일간 삽입? 뎁보좌제 : 1회 1좌제씩 1일 2회 1일간 치료? 부작용: 작열감, 소양증, 홍반? 금기: 상처 또는 점막부위, 피부 결핵, 본제 및 aminoglycoside계 항생제, bacitracin 과민증기왕력자, 세균, 진균, 바이러스성 피부감염증, 고막 천공이 있는 습진성 외이도염, 궤양, 2도 이상의 심재성 화상, 피부궤양, 적비, 동상, 옴, 입주위의 피부염● Fluconazole? 적응증? 캅셀 : 급성 또는 재발성 질칸디다증, 족부백선, 체부, 고부 백선, 전풍(어루러기) 및 칸디다증을 포함한 피부진균? 캅셀, 정주 : 면역기능이 손상된 환자 및 정상적인 환자의 구강인두, 식도, 비침투성 기관지, 폐감염과 칸디다뇨증, 피부점막 및 만성 위축성 구강칸디다증(의치로 인한 구강내 통증)등을 포함한 점막 칸디다증 및 그 이외의 다른 침투성 칸디다감염증을 포함한 전신성 칸디다증 및 그 이외의 다른 침투성 칸디다감염증을 포함한 전신성 칸디다증, 복막, 심내막, 폐, 비뇨기계 감염증과 악성종양 환자, 중환자실 환자 및 항체나 면역억제요벅을 받는 환자의 칸디다감염증, 면역기능이 정상인 환자 및 후천성 면역결핍증 환자. 장기이식 환자 또는 그 밖의 다른 면역억제요법을 받는 환자의 효모균 수막염 침 기타부위의 효모균증, 후천성 면역결핍증 환자의 효모균증 재발방지를 위한 유지요법, 악성종양 환자의 세포 독성 화학요법이나 방사선요법으로 인한 진균감염증 예방? 작용기전: Cytochrome P450를 저해하여 진균 세포막의 주성분인 ergosterol합성을 저해하므로 세포막의 형성을 저해함? 용법, 용량? 성인- 질칸디다증 : 150mg을 1회 투여- 점막칸디다증, 구강인두칸디다증 : 1일 1회 50mg을 7~14일간 투여- 의치와 관련된 위축성 구강칸디다증 : 1일 1회 50mg을 14일간- 기타 점막칸디다증 : 1일 1회 50mg을 14~30일간- 칸디다혈증, 전염성/침투성칸디다증 : 첫날 400mg 1회 투여, 다음 날부터 1일 1회 200mg, 최대 400mg- 효모균수막염 및 타 부위 효모균증 : 첫날 400mg 1회 투여, 다음 날부터 1일 1회 200~400mg, 치료기간은 6~8주간- 후천성 면역결핍증 환자의 효모균 수막염 재발방지를 위해서는 기초치료를 모두 마친 후 1일 1회 최소 100mg을 무기한 투여- 악성종양 환자의 진균감염증 예방, 세포독성 화학요법 또는 방사선치료로 인한 감염의 위험이 있을 동안 1일 1회 50mg? 부작용: 발적, 복통, 오심, 구토, 두통, 설사, 창백, 현기증, 저칼륨혈증, 혈중 alkaline phosphatase의 상승? 금기: 본제 성분이나 키타 트리아졸계 약물에 과민증인 환자● Griseofulvin? 적응증? 정제 : 피부, 모발, 손톱, 발톱의 백선감염증? 연고 : 피부사상균증(백선)? 작용기전: 진균세포의 유사분열 억제, human keratin에 결합하여 진균의 침입에 대한 저항성을 높임? 용법, 용량? 정제- 성인 : 1일 250~500mg을 1~수회 분복- 소아 : 1일 10mg/kg 투여? 연고 : 환부 및 주위를 세척하고 건조한 후 1일 1~2회 적량 도포? 부작용: 두통, 피로, 판단혼란, 불면증, 단백뇨, 백혈구 감소증, 과립구 감소증 홍반, 지각이상, 담마진, 광과민성반응? 금기? 정제 : 포르피린증, 간장애, 본제과민증, 홍반성낭창, 삼출성다발성 홍반, 표피괴사 환자● Miconazole nitrate? 적응증? 파우다, 크림, 에어로졸 : 칸디다균에 의한 피부질환 및 조갑백선을 제외한 표재성 백선증, 무좀, 체부/안부/두부/고부백선, 어루러기, 피부칸디다증? 질좌약 : 칸디다성 질염? 작용기전: Ergosterol 생합성을 저해하여 진균 세포막의 투과성을 높여 세포내 성분을 유출시킴? 용법, 용량? 파우다, 크림, 에어로졸 : 1일 1~3회 환부에 도포 또는 분무? 질좌약 : 성인 1회 1좌약을 1일 1~3회 질내에 깊숙이 삽입? 부작용: 자극, 작열감, 골반경련, 두통, 발적, 담마진? 금기? 파우다, 크림, 에어로졸 : 눈주위, 정맥부위, 습진, 음부의 습진에 적용● Ketoconazole? 적응증? 정제 : 피부진균 및 효모균에 희한 피부, 모발, 손톱감염, 구강내외 위장관의 효모균 감염증, 질칸디다증, 전신적 진균감염증, 암/기관이식/화상 환자 등 감염에 대한 저항력이 감소된 환자의 진균 감염 예방? 액 : 효모균에 의한 비듬, 지루성 피부염? 크림 : 칸디다 및 피부사상균에 의한 지루성 피부염, 피부백선, 체부백선, 전풍, 피부칸디다증, 완선, 한포상백선? 작용기전: Ergosterol 생합성을 저해하여 진균 세포막의 투과성을 높여 세포내 성분을 유출시킴? 용법, 용량? 정제- 질칸디다증 : 1회 1정씩 1일 2회 5일간 복용- 기타 : 1일 1정씩, 증상소실 후에도 1주일까지 복용한다. 소아는 1일 1/4~1/2정을 복용한다.? 액 : 통상 매주 2회 2~4주간 감염부위에 적용한 뒤 3~5분후에 세척한다. 이후 재발방지 목적으로는 1~2주마다 1회? 크림 : 1일 1~2회 적량을 도포, 증상 소실 후 수일간 계속 적용? 부작용? 정제 : 간장장해, 오심, 구토, 부신피질호르몬 부족, abdominal discomfort, 위장관출혈, 여성형유방, 소양증, 발적? 금기? 정제 : 급성 또는 만성 간질환 환자● Naftifine ? HCl? 적응증: 피부사상균(백선균 등)에 의한 족부/수부/두부/안부/체부/고부백선, 진균성간찰진, 피부칸디다증, 전풍, 조갑진균증? 작용기전: Squalene epoxidase를 저해하여 ergosterol의 생성을 저해하므로 진균세포막의 합성이 저해됨? 용법, 용량? 피부 : 1일 1회 취침시 환부에 엷게 바름? 조갑감염 : 1일 2회 환부에 도포 재발방지를 위하여 증상 소실 후 약 2주간 더 사용? 부작용: 작열감, 발적, 가려움, 국소자극, 건조? 금기: 본제과민증 환자, 급성염증이나 상처가 노출된 부위에의 사용● Nystatin? 적응증? 연고, 크림 : 난치성습진 만성단순백선 또는 타제제로 잘 치료되지 않는 피부질환의 단기요법, 건선 등의 밀봉법 치료시 올 수 있는 2차 세균감염 및 칸디다 감염예방

자연과학| 2004.12.13| 7페이지| 1,000원| 조회(606)

항생제, 항생물질, 항진균제, 항진균성항생제

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