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이차원 전기영동(2-DE)을 이용하여 체외성숙동안 돼지 난자의 단백질 패턴

Protein Patterns of Porcine Oocytes duringIn Vitro Maturation using Two-DimensionalGel ElectrophoresisDong-Min JangDepartment of Animal BiotechnologyGraduate School, Kangwon National UniversityABSTRACTIn vitro maturation (IVM) of fully grown mammalian oocytes is characterized by initial germinal vesicle (GV) breakdown and rearrangement of microtubule network during the first meiosis (MI), followed by extrusion of the first polar body and block of the oocytes in metaphase of the second meiosis (MII). Only fully matured oocytes are capable of undergoing fertilization and the initiation of zygotic development. These observations are mostly based on morphological evaluation; however, the molecular events responsible for these processes are not known. Cellular maturation and differentiation processes are accompanied by the expression of specific proteins. Especially in oocytes, there is no reliable strict linear correlation between mRNA levels and theabundance of proteins. Furthermore, the , the quality of embryos produced in vitro is inferior to those produced in vitro. The major problems include improper oocyte maturation, both nucleus and cytoplasmic, and polyspermy. Despite the progress, the quality of oocytes matured in vitro, defined as the potential of that oocyte to develop into a viable offspring, is still not satisfactory, limiting the improvement of other reproductive techniques in pigs (Hunter, 1991). Thus, the importance of the development and identification of defined in vitro conditions for oocyte maturation and fertilization should not be underestimated, since most reproductive technologies rely on these basic techniques.Looking into the basic aspects of oocyte meiotic maturation and fertilization, fully-frown follicular oocytes of most mammals are arrested at G2 phase of the first meiosis, and resume meiosis in vivo in response to specific signals, often hormones, or in vitro after being liberated from their follicular environment. During and following t1995; Abeydeera et al., 1998). Intracellular glutathione (GSH) level and the ability of cytoplasm to decondense sperm nucleus or to induce male prunucleus formation have been used as indexes for the evaluation of cytoplasmic maturation, and the addition of above elements during maturation may increase GSH concentration or male pronucleus formation (Yoshida et al., 1993; Abeydeera et al., 2000). Gap junctional communication (GJC) between cumulus cells and oocyte is important for regulating the cytoplasmic factors responsible for cytoplasmic maturation. If the GJC is blocked, GSH concentration is decreased.Meiotic maturation of the oocytes has been well accepted that the high level of MPF and MAP kinase activity in MII oocytes works as a cytostatic factor (CSF) and cause the MII arrest in vertebrate oocytes including mammals. MPF is considered to be an important component of CSF involved in MII arrest in porcine oocytes. In MII arrested oocytes, MPF activity reaches the highest level, anwth and completion of all these metabolic steps, allows acquisition of a full meiotic and developmental competence (Motlik et al., 2000). Transcription activity of the oocyte rapidly decreases duringmaturation; therefore, it is expected that the important information necessary for full meiotic and developmental competence of oocytes be retained at the level of proteins. However, the molecular events responsible for these processes are not known. The present study sought to identify these proteins using proteomics techniques; however, proteomics becomes less favorable as a method for protein identification when a very limited quantity of precious material is available, such as with mammalian oocytes. The inevitable losses incurred with two-dimensional (2-D) gel electrophoresis should be avoided if the goal is tooptimize use of this precious material to identify proteins of physiological importance. In other words, this study have used a proteomics approach to analyze protein patterns ofrom Bio-Rad. Trizma base (Tris base), ammonium persulfate (APS), 1,4-dithiothreitol (DTT), urea, thiourea, glycerol, acetonitrile, trifluoroacetic acid, iodoacetamide, α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid and CHAPS were from Sigma. SDS and glycine were from Bio Basic and Junsei, respectively. Silver staining kit was purchased from Amersham Biotech. Standard calibration solutions were purchased from Bruker Daltonics. Methanol and ethanol were purchased from Merck (Darmstadt, Germany). Sequence-grade modified trypsin (porcine) was obtained from Promega (Madison, WI). Antibodies used in this study were purchased from Santa Cruze Biotechnology (USA). Other reagent was obtained from Sigma or Bio-Rad. Isoelectrofocusing (IEF) was performed with lPGphor unit (Amersham, USA ) using precast 18cm pH 3?11 nonlinear IPG gel strips (Amersham Biosciences). 300 ㎍ of total proteins were mixed with the rehydration solution (7 M urea, 2 M thiourea, 4% W/V CHAPS, 50 M DTT and trace of bromophenol blue) to the

공학/기술| 2009.10.14| 43페이지| 2,000원| 조회(554)

2-DE, 이차원전기영동, 논문자료, 체외성숙, 돼지난자

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이차원 전기영동 - 2DE에 대한 전반적인 내용발표

Proteomics Workflows 2D - electrophoresis장 동 민포스트게놈 – Post genome인간게놈프로젝트의 유전자 지도 작성 이후의 프로젝트를 의미 연구방향 - 특정 단백질을 만드는 데 어떤 염기들이 기능을 발휘하는지에 관한 기능유전체학 - 개인들의 염기서열이 어떻게 차이가 나는지를 규명하는 비교유전체학 - 단백질의 구조를 밝혀내는 프로테옴(proteom) - 쥐 등 인간 유전체와 유사한 모델동물들의 유전체 해독 및 인간 유전체와 비교연구 - DNA칩 등 각종 기술개발Proteome ProteomicsProteome – 단백체 Protein (단백질) + -Ome (전체) (PROTEin expressed by a genOME) 인체 내 특정 세포나 특수 상황에서 만들어지고 작용하는 단백질의 총합. Proteomics - 단백체학 Proteome(단백체) + -ics(~학, 론) 단백질체의 기능이상과 구조변형 유무 등을 가려내는 분석기술단백질의 profiling상호작용 network 해석단백질의 동정 정밀 분석Proteome data - base생명과학연구 응용Proteome 해석 흐름Proteome 연구의 개념도단백질의 profiling상호작용 해석에 의한 단백질의 linkage분석Protein synthesisCentral Dogma (중심이론) DNA makes RNA makes Protein but every step is controlled by many, often unknown factorsFirst-dimentional isoelectric focusing (IEF)+1+2+3-3-2-13 4 5 6 7 8 9 10Net chargePISecond dimentional electrophoresis (SDS-PAGE)MALDI-TOF MSMatrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight Mass SpectroscopyMALDI-TOF DatasheetBSA – Bovine serum albuminLandrace pig spermMiniature pig spermIntroductionIn vitro maturation (IVM) of fully grown mammalian oocytes is characterized by initial germinal vesicle (GV) breakdown and rearrangement of microtubule network during the first meiosis (MⅠ), followed by extrusion of the first polar body and block of the oocytes in metaphase of the second meiosis (MⅡ) These observations are mostly based on morphological evaluation; however, the molecular events responsible for these processes are not known. (Zdenka Ellederova et al., 2004; Biology of reproduction) Cellular maturation and differentiation processes are accompanied by the expression of specific proteins. Especially in oocytes, there is no reliable strict linear correlation between mRNA levels and the abundance of proteins. Furthermore, the activity of proteins is modulated by specific kinases and phosphatases which control cellular processes like cellular growth, differentiation, cell cycle and meiosis. (Monika Bhojwani et al., 2006; cloning and stem cells)Sample preparationBasic Medium : TCM-199 M Ⅰ: PFF, EGF, LH, FSH, hCG Total Time - 20~22h M Ⅱ: PFF, EGF Total Time - 40~44hGV stageM Ⅱ stage0.1% hyaluronidaseSonication, 40plus 10~15 sec.×2 PBS washing Centrifuge 8000 rpm, 5minStorage at -20℃Protein precipitation with 2D clean up kitGV stage, 13cm, pH 3-11NLM2 stage, 13cm, pH 3-11NLKDa*************020*************020KDa31131112% acrylamide gelResultsKDa1407050403020KDa*************504030201512% acrylamide gelGV stage, 13cm, pH 3-11NLM2 stage, 13cm, pH 3-11NL140705040302015KDa1407050403020KDa3113111510% acrylamide gelGV stage, 13cm, pH 3-11NLM2 stage, 13cm, pH 3-11NLIEFpH3pH10linear IPGSDS-PAGE20018SDS-PAGE20018MWMWIEFpH3pH10linear IPGABFigure 2-DE gel electrophoresis. Proteins were isolated from GV and MII and 0.225g of total protein was loaded to the 2-DE gel electrophoresis. First dimension was 13cm pH 3-10 NL IPG and second dimension was 10% gels (A: GV; B: MII). They were visualized by the silver staining.Comparison of the protein patterns of GV and MII EmbryosAB3 113 11GV stageMⅡ stageKDa140 10050 40 30 20 15KDa140 10050 40 30 20 15Defect of 2-DE분자량이 큰 것은 분리하기 힘들다 재현성의 정확성이 떨어진다. 농도가 낮은 단백질에 대해 분리가 어렵다 자동화 기술의 미흡Fig. 1. False-colored protein expression pattern of larval hemolymph proteins (Exp. 1). For the forward labeling, propyl-Cy3-labeled proteins of flies challenged with LPS are colored in red and methyl-Cy5-labeled proteins of naive flies are colored in green. IEF was performed with 18-cm IPG strips, pH 4–7. Numbers indicate spots with statistically significant differential fluorescence levels, which were further identified with mass spectrometry.Fig. 2. False-colored protein expression pattern of larval hemolymph proteins (Exp. 2). For forward labeling, propyl-Cy3-labeled proteins of flies challenged with sterile needles are colored in red and methyl-Cy5-labeled proteins of naive flies are colored in green. IEF was performed with 18-cm IPG strips, pH 4–7. Spots with statistically significant differential fluorescence levels in Exp. 1 are indicated; however, five spots (T2, T3, T8, T13, and T16) could not be detected at all in this control experiment.SummaryProteome Proteomics 단백질의 중요성 - mRNA level 과 protein 사이에 상호 연관성이 명확히 드 러나 있지 않다. - 성장, 생식 그리고 죽음에 이르기까지.. 단백질 분리의 최신기술 – Two-Dimentional gel electrophoresis (pH MW) - cy2, cy3, cy5를 이용한 형광염색을 이용한 전기영동{nameOfApplication=Show}

자연과학| 2009.10.14| 27페이지| 1,500원| 조회(444)

단백질분리, Electrophoresis, 실험과정, 2-DE, 이차원전기영동, two-dimensional

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포유류의 팔다리 발생과정 - 발표자료

팔 다리의 발생장 동 민태아 발생 일정표태아의 발생과정배자기 (embryonic period)태아기 (Fetal period)Trilaminar embryonic disc의 파생구조물ICMTrilaminar embryonic discMesoderm(중배엽)Lateral(측면)Connective tissue and muscle of viscera and Limbs Serous membranes of pleura, pericardium and peritoneum Blood and lymph cells Cardiovascular and lymphatic systems spleen Adrenal cortexEctoderm (외배엽) - 중추신경계, 말초신경계, 눈, 귀 및 코의 감각상피, 표피와 그 부속기관, 젖샘, 뇌하수체, 피부밑샘, 및 치아의 에나멜 형성 등 Mesoderm (중배엽) - 결합조직, 연골, 뼈, 사지, 가로무늬근 및 평활근, 심장, 혈관 및 림프관과 그 세포, 신장, 난소 및 고환, 생식관, 체강을 덮는 장막, 비장과 부신피질 등 Endoderm (내배엽) - 위장관 및 호흡기의 상피, 편도, 갑상샘, 부갑상샘, 가슴샘, 간 및 췌장의 실질, 방광과 요도 대부분의 상피 등발생 4~8주째의 발달과정발가락이 자유롭고 더 길어짐.23.0 ~ 28.054~55손과 발이 서로 가까워 짐. 손가락은 자유롭고 더 김. 발가락은 분명하지만 갈퀴모양.22.0 ~ 24.052~33상지가 더 길어지고 발꿈치에서 굽어짐. 손가락은 명확 하지만 갈퀴모양. 발가락열 사이의 패임.18.0 ~ 22.049~51사지가 배쪽으로 펴짐. 몸통은 길어지고 곧아짐.16.0 ~ 18.047~48발가락열이 발판에서 명확히 보임. 발꿈치가 관찰됨. 손가락열 사이의 패임.13.0 ~ 17.044~46손가락열이 손판에서 명확히 보임. 몸통이 곧아지기 시작함.11.0 ~ 14.041~43손판이 형성되어 있고 손가락열이 존재함. 하지는 주걱모양7.0 ~ 9.033~36C자형의 배자. 상지싹은 물갈퀴 모양 하지싹이 출현. 꼬리가 작아짐.30 ~ 3528~30상지싹이 출현.3.0 ~ 5.026~27외형상의 주요 특징길이(mm)배자령(일)발생 24~28일째Fig. 1. 발생 4주 초기 8~12쌍의 몸분절을 갖는 배자의 등쪽 그림발생 4주째배자의 형태는 거의 곧은 모양이고, 몸 분절이 두드러진 표면 융기를 만듬. 배자의 주름에 의해 배자는 특징적인 C자 모양을 하고 있다. 상지싹(upper limb buds)이 발생 26~27일경에 체벽의 전외측부에서 작은 융기로 관찰 하지싹은(lower limb buds) 발생 4주 말에 관찰발생 4~8주째의 발달과정발가락이 자유롭고 더 길어짐.23.0 ~ 28.054~55손과 발이 서로 가까워 짐. 손가락은 자유롭고 더 김. 발가락은 분명하지만 갈퀴모양.22.0 ~ 24.052~33상지가 더 길어지고 발꿈치에서 굽어짐. 손가락은 명확 하지만 갈퀴모양. 발가락열 사이의 패임.18.0 ~ 22.049~51사지가 배쪽으로 펴짐. 몸통은 길어지고 곧아짐.16.0 ~ 18.047~48발가락열이 발판에서 명확히 보임. 발꿈치가 관찰됨. 손가락열 사이의 패임.13.0 ~ 17.044~46손가락열이 손판에서 명확히 보임. 몸통이 곧아지기 시작함.11.0 ~ 14.041~43손판이 형성되어 있고 손가락열이 존재함. 하지는 주걱모양7.0 ~ 9.033~36C자형의 배자. 상지싹은 물갈퀴 모양 하지싹이 출현. 꼬리가 작아짐.30 ~ 3528~30상지싹이 출현.3.0 ~ 5.026~27외형상의 주요 특징길이(mm)배자령(일)발생 32일째발생 32일째 태아 사진. 상지싹은 주걱 모양이고, 하지싹은 물갈퀴 모양의 돌출부.발생 5주째4주째에 비해서 체형의 변화는 뚜렷하지는 않음. 하지만 머리의 성장은 뚜렷 목동굴(cervical sinus)을 형성 상지싹은 더 분화하여 발꿈치 및 손판(hand plate)이 구분 손가락의 원기인 손가락열(digital rays)은 33일경에 발달 몸통과 사지를 움직이기 시작발생 4~8주째의 발달과정발가락이 자유롭고 더 길어짐.23.0 ~ 28.054~55손과 발이 서로 가까워 짐. 손가락은 자유롭고 더 김. 발가락은 분명하지만 갈퀴모양.22.0 ~ 24.052~33상지가 더 길어지고 발꿈치에서 굽어짐. 손가락은 명확 하지만 갈퀴모양. 발가락열 사이의 패임.18.0 ~ 22.049~51사지가 배쪽으로 펴짐. 몸통은 길어지고 곧아짐.16.0 ~ 18.047~48발가락열이 발판에서 명확히 보임. 발꿈치가 관찰됨. 손가락열 사이의 패임.13.0 ~ 17.044~46손가락열이 손판에서 명확히 보임. 몸통이 곧아지기 시작함.11.0 ~ 14.041~43손판이 형성되어 있고 손가락열이 존재함. 하지는 주걱모양7.0 ~ 9.033~36C자형의 배자. 상지싹은 물갈퀴 모양 하지싹이 출현. 꼬리가 작아짐.30 ~ 3528~30상지싹이 출현.3.0 ~ 5.026~27외형상의 주요 특징길이(mm)배자령(일)발생 41일째발생 41일째 손목부분, 손가락열을 동반한 손판, 색소가 침착된 눈 및 외이를 관찰할 수 있다.발생 6주째상지싹의 각 부분이 급속히 분화 발꿈치와 손목부분이 구분 손가락열이 외부에서 관찰 외이도 형성 – 귓바퀴 형성발생 4~8주째의 발달과정발가락이 자유롭고 더 길어짐.23.0 ~ 28.054~55손과 발이 서로 가까워 짐. 손가락은 자유롭고 더 김. 발가락은 분명하지만 갈퀴모양.22.0 ~ 24.052~33상지가 더 길어지고 발꿈치에서 굽어짐. 손가락은 명확 하지만 갈퀴모양. 발가락열 사이의 패임.18.0 ~ 22.049~51사지가 배쪽으로 펴짐. 몸통은 길어지고 곧아짐.16.0 ~ 18.047~48발가락열이 발판에서 명확히 보임. 발꿈치가 관찰됨. 손가락열 사이의 패임.13.0 ~ 17.044~46손가락열이 손판에서 명확히 보임. 몸통이 곧아지기 시작함.11.0 ~ 14.041~43손판이 형성되어 있고 손가락열이 존재함. 하지는 주걱모양7.0 ~ 9.033~36C자형의 배자. 상지싹은 물갈퀴 모양 하지싹이 출현. 꼬리가 작아짐.30 ~ 3528~30상지싹이 출현.3.0 ~ 5.026~27외형상의 주요 특징길이(mm)배자령(일)발생 48일경발생 48일경 잘 발달된 눈과 발생중인 손의 손가락열 사이의 패임을 관찰할 수 있다.발생 7주째사지는 심한 변화 - 손판에 있는 손가락열 사이에 패임이 출현 배꼽탈장 과정발생 4~8주째의 발달과정발가락이 자유롭고 더 길어짐.23.0 ~ 28.054~55손과 발이 서로 가까워 짐. 손가락은 자유롭고 더 김. 발가락은 분명하지만 갈퀴모양.22.0 ~ 24.052~33상지가 더 길어지고 발꿈치에서 굽어짐. 손가락은 명확 하지만 갈퀴모양. 발가락열 사이의 패임.18.0 ~ 22.049~51사지가 배쪽으로 펴짐. 몸통은 길어지고 곧아짐.16.0 ~ 18.047~48발가락열이 발판에서 명확히 보임. 발꿈치가 관찰됨. 손가락열 사이의 패임.13.0 ~ 17.044~46손가락열이 손판에서 명확히 보임. 몸통이 곧아지기 시작함.11.0 ~ 14.041~43손판이 형성되어 있고 손가락열이 존재함. 하지는 주걱모양7.0 ~ 9.033~36C자형의 배자. 상지싹은 물갈퀴 모양 하지싹이 출현. 꼬리가 작아짐.30 ~ 3528~30상지싹이 출현.3.0 ~ 5.026~27외형상의 주요 특징길이(mm)배자령(일)발생 51일경발생 51일경 발에서 갈퀴가 있는 발가락과 발가락열 패임을 관찰.발생 8주째배자기 마지막 주의 초기에 손가락은 짧고 물갈퀴 모양. 패임은 발의 발가락 열 사이에서도 명확히 보임. 사지의 모든 부분이 명확하고 손 및 발가락은 분리 꼬리는 존재하지만 짧음. 8주 말경에는 사지의 운동이 처음으로 일어나며, 동시에 꼬리의 흔적은 소실. 외부 생식기는 성별간에 따른 차이가 있지만 정확한 차이를 알기에는 불명확한 시점.발생 4~8주째의 발달과정발가락이 자유롭고 더 길어짐.23.0 ~ 28.054~55손과 발이 서로 가까워 짐. 손가락은 자유롭고 더 김. 발가락은 분명하지만 갈퀴모양.22.0 ~ 24.052~33상지가 더 길어지고 발꿈치에서 굽어짐. 손가락은 명확 하지만 갈퀴모양. 발가락열 사이의 패임.18.0 ~ 22.049~51사지가 배쪽으로 펴짐. 몸통은 길어지고 곧아짐.16.0 ~ 18.047~48발가락열이 발판에서 명확히 보임. 발꿈치가 관찰됨. 손가락열 사이의 패임.13.0 ~ 17.044~46손가락열이 손판에서 명확히 보임. 몸통이 곧아지기 시작함.11.0 ~ 14.041~43손판이 형성되어 있고 손가락열이 존재함. 하지는 주걱모양7.0 ~ 9.033~36C자형의 배자. 상지싹은 물갈퀴 모양 하지싹이 출현. 꼬리가 작아짐.30 ~ 3528~30상지싹이 출현.3.0 ~ 5.026~27외형상의 주요 특징길이(mm)배자령(일)발생 56일째발생 56일 째 사지 및 하지가 잘 형성되어 있고, 손, 발가락이 잘 분리되어 있음 을 관찰팔 다리의 기형과 돌연변이1000명당 1명 꼴로 기형하 출산 유전적 기형, 비 유전적 기형 수 많은 종류의 유전자가 관여 유전적 결함 – 유전자의 이상 FGF, ZPA, Shh, Tbx-5, noggin, Hox 기형유발인자 - 호르몬, 항암제, 항생물질, 탈리도마이드, 전염병원생물, 방사선, 기타 화학물질, 환경호르몬 등팔 다리의 기형과 돌연변이(A)(B)A) 탈리도마이드에 의한 사지결손증 (quadruple amelia)B) 다지증 (polydactyly)(C)(D)C) 합지증D) 부분적 사지 결손증{nameOfApplication=Show}

자연과학| 2009.10.14| 26페이지| 1,500원| 조회(428)

발표자료, 발생공학, 팔다리발생, 동물발생과정

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발생공학 - 포유류의 초기발생과정

동물발생공학- 포유류의 초기발생 - 초기배의 조작법장 동 민서론 - 용어 설명 및 세포분열1. 발생학 (Embryology) ※ 발생 – Development ※ 분화 – Differentiation 발생해부학 Developmental anatomy 발생생물학 Developmental biology 발생공학 Developmental biotechnology 2. 발생 (Development) 1) 전발생 Progenesis (1) 생식자 발생 Gametogenesis A. 정자 발생 – Spermatogenesis B. 난자 발생 – Oogenesis (2) 수정 Fertilization 2) 배자 발생 Embryogenesis (1) 난분할 Cleavage (2) 착상 Implantation (2) 장배 형성 Gastrulation 3) 기관발생 Organogenesis세포분열 (Cell Division)1) Mitosis 와 cytokinesis (1) Mitosis : 핵(nuclear)분열 (유사분열) (2) Cytokinesis : 세포질(cytoplasm) 분열 2) Cell cycle (세포주기) stage G1 phase (gap 1) S phase (synthesis: protein, DNA) G2 phase (gap 2) M phase (mitosis) - prophase, methphase, anaphase, telophaseInterphase3) Mitosis 와 Meiosis (1) Mitosis(유사분열) : 등수분열(equal division) A. DNA 복제 : 이중구조 염색체 B. Prophase : 염색체가 꼬여, 수축 및 응축 Metaphase : 염색체가 적도판에 배열 Anaphase : 염색체의 중심절 분리 spindle에 의해 양극으로 이동개시 Telophase : 양극으로 이동하여 꼬였던 염색체가 풀림 핵막형성, 세포질 분리Fig. 1. 유사분열의 여러 시기 A.전기(prophase) B.전중기(prometaphaseiring or synapse) - cross-over : 상동염색체간 염색질 분절교환 - 상동염색체의 분리(염색체 수의 반감) B. 2nd meiosis : 등수분열 (haploid  haploid) - DNA 비합성 - 이중구조 염색체의 분리  단일구조(DNA 반감)Fig. 2. 일차 및 2차 감수분열 모식도본론포유류의 초기 발생 1. 난자의 발육과 성장 1.1 난자의 발생과정 1.2 난자의 형성단계 2. 난자의 성숙 2.1 감수분열 성숙 3. 난자의 초기발생 4. 포유동물난자의 발생기구 5. 분할구의 분화능력과 발생능력 초기배의 조작법 1. Micromanipulator의 사용에 의한 조작과 처리법 2. 약물과 바이러스 이용에 의한 초기배의 조작법1.난자의 발육과 성장 1.1난자의 발생과정원시생식세포(primordial germ cell)난원세포 (oogonia)1차 난모세포(primary oocytes)2차 난모세포(secondary oocytes)난자(ovum)증가기성장기성숙기--------- 1차 감수분열--------- 2차 감수분열1.2 난자 형성 단계1) 원시생식세포의 발생 2) 원시생식세포  난원세포 3) 난원세포  미발육난모세포 4) 미발육난모세포  발육난모세포 5) 발육난모세포  난자1) 원시생식세포의 발생원시생식세포(primordial germ cell) 태생기의 초기에 형성되며, 난황낭의 외배엽에서 최초로 발견. 소수가 형성되지만, 유사분열을 반복하여 급격하게 증가 ex) 마우스(임신기간 20일)세포수일령20,000개5,000개170~350개15~100개13~14일령11~12일령9~10일령8일령발달단계별 난소의 모습2) 원시생식세포  난원세포난소의 성삭에 수용된 원시생식세포는 운동력을 잃고, 소수의 세포소기관을 가 진 둥근모양의 세포로 변환된다. 강력한 유사분열 활성. 마우스의 경우 14~16일령에 4번의 유사분열주기를 반복하여 일생동안 사용할 난원세포의 수가 결정3) 난원세포  미발육난모세포유사분열과정이 종료된 다음포  난자제1감수분열 전기의 복사기에서 휴지되었던 감수분열이 재개 제2차 난모세포가 형성 제1극체 방출, 투명층 형성 염색체의 수는 절반, DNA 함량은 절반난모세포의 성숙난포의 성숙과정2. 난자의 성숙 2.1 감수분열 성숙두번의 감수분열 과정 제1감수분열 – 전기 Ⅰ의 복사기(핵난포) 제2감수분열 – 중기 Ⅱ 분열 정지 (제1극체 방출) 감수분열이 재개되는 것을 감수분열 성숙 배란직전에 다량으로 분비되는 성선자극호르몬(FSH와 LH)에 의해 조절되는 난모세포와 체세포(난구세포와 과립막세포)의 상호작용으로 발현된다.3. 난자의 초기발생포유류 난자의 배란과 수정과정에 이어 착상에 이르기까지3.1 난할과정핵의 분열은 일반 체세포의 유사분열과 같지만, 세포질은 모세포의 크기로 성장하지 않고, 기존의 세포질이 나누어 가지기 때문에 분열회수가 증가될수록 세포의 크기가 작아진다. 이와 같이 세포질이 증가하지 않고 등분되는 수정란의 세포분열을 난할이라 한다.부분난할 - 동물극부위에서만 난할 - 조류, 어류, 파충류 등 전난할-균등난할 - 난황량이 적은 수정란 - 난할면이 전체 수정란을 양분 - 포유류 불균등난할 - 식물극 동물극(분할구 크기) - 양서류마우스의 배의 발달과정하등동물과 차이점 ① 난할속도가 하등동물에 비해 매우 느리다. ② 전날할을 하는 동물중에서 포유동물만이 회선난할을 한다. ③ 하등동물과는 달리 각 단계의 난할시기가 동기화되지 않는다.돼지의 배의 발달과정1. 초기 배분할 cell block – 일정 세포주기의 G2 phase 에서 발육정지 혹은 지연, transcription 시기와 연관 Mouse ; 2cell, pig; 4cell Sheep, bovine ; 8~16cell 2. 오디배(상실배; Morulae) compaction – 분할방향 불규칙, blastomeres 간격 밀착, 구분불가3. 배반포 ; Blastocysts - 포배강(blastocoele) 형성 - 배의 분화 a. 영양막(Trophoblast), 영양막외배엽(Trophectodation) 1) Epiboly(싸기): 상피성세포층(외배엽성 세포)이 배 내측세포를 싸기 위해 확장 2) Invagination(함입) : 특정영역의 세포가 내측으로 함입 3) Involution(속말림) : 확장되는 외측층이 내측으로 말려듦 4) Ingression(이주) : 표층세포가 배 내측으로 이동 5) Delamination(배엽분리) : 1층의 세포층이 두층으로 분리 장배의 형태 - 외배엽성강 출현 (돼지, 개, 고양이 제외) - ICM 외층의 trophoblast 퇴화 소실  ICM 노출 - hypoblast : Yolk sac 형성(2층판 배반포배) - 외배엽성의 amniotic fold(양막주름)융기, 융합  amnion 형성(양막강)포유류의 장배형성포유류의 배엽 분리ICMepiblasthypoblastEmbryonic epiblastAmniotic ectodermEmbryonic ectodermPrimitive streakmesodermendodermExtraembryonic endodermYolk sac endoderm외배엽내배엽배자부위 외배엽양막 외배엽배자부위 외배엽원시선중배엽내배엽배자밖내배엽요막 내배엽배자원판표면세포의 이동모습 A. 배자원판 등쪽그림 B. 배자의 정중절편배자원반의 성장 A. 정중절편 B. 머리쪽 가로단면 C. 원시선부위의 가로단면Somites – 몸분절신경관 형성의 연속적 모습신경관 형성모습 A. 태생 22일 B. 태생 23일몸분절(Somites) - 축옆중배엽 형성 - 개수에 따라 일령 추정 가능 - block 형성, 몸 전반부에서 시작 (42~44쌍 형성) - 각 배엽간에 중배엽성의 중간엽 형성 - somites 내부에 몸분절강 형성 a. 외측세포 : 피부분절 b. 내측세포 : 근육분절 c. somites 배쪽 : 골격분절중배엽 발달중배엽의 발달을 보여주는 가로단면내배엽강머리-꼬리접힘과 외측접힘에 의함 앞장관, 중간장관 , 뒷장관 형성 요막형성내배엽층의 분화배엽에서 분화되는 기관Ectoderm (외배엽) - 중추상샘, 흉선, 간, 췌장등5. 할구의 분화능력과 발생능력분할구의 분리는 2세포기부터 배반포에 이르기까지 넓은 범위의 발달단계에 걸쳐 시도되어 왔다. 단, 8세포기가 지나면 분화능력 상실 마우스의 2,4,8 세포기 배에서 분리된 분할구는 각각 87%, 73.2%, 65.8%가 상실배이상의 단계까지 발달하였다.(Rho Chung, 1983) 토끼에서는 4 및 8 세포기 배에서 분리한 하나의 분할구가 신생자로 발달하여 탄생하였다.배의 절단과정초기배의 조작법 1. Micromanipulator의 사용에 의한 조작과 처리법현미경하에서 미세조작기를 이용하여 정자와 난자의 수정을 인위적으로 유도하거나 복제란을 생산하는 기술을 미세조작기술이라 한다. 경제형질에 대한 유전적 능력은 우수하지만, 수정능력이 떨어지는 정자를 생산하는 수컷도 번식에 이용할 수 있게 되었으며 보다 더 생산적인 가축 생산의 길이 열리게 되었다. 투명대 천공법, 투명대부분절개법, 위란강내주입법, 난세포질내주입법, 핵이식 법 등이 있다.미세조작 기법을 이용한 기술2. 약물과 바이러스 이용에 의한 초기배의 조작법(1) 분할구 분리법(Blastomere separation) A. zona 제거 : 염산산성액, pronase이용 B. trypsin, hyaluronidase, separase등의 효소 이용하여 분리 (2) 난자, 분할구집합 및 융합법(aggregation Fusion) A. PHA(phytohemagglutinin-P)에 의한 집합 - 분할구를 접촉시켜 집합유도 B. PEG(polyethylen glycol)에 의한 융합 - PEG 내의 난자 20~30초 후 glass화 되어 수축되며 배양액으로 이동하면 복귀 C. Virus에 의한 융합 - Sendai Virus(inactivated HVJ)이용, 세포주입시 함께 주입 D. Electrofusion - 일정전압의 직류전류를 세포간 접촉면에 직각으로 부여, 세포막의 변화 및 융합유기(3) 각종항체에 의한 배조작 A. ICM 분리 - immunosw}

자연과학| 2009.10.14| 40페이지| 1,000원| 조회(978)

포유류, 발생공학, 기초생물학, 발생과정, 초기발생

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내분비학 - Endocrinology

1. Introduction to hormone1) Endocrinology① hormone의 구조와 작용, 생리적 반응, 분비선의 구조나 기능을 연구한다.② endon(internal) + krinein(to separate or secrete)③ endocrine glands는 exocrine glands와 구별 된다? endocrine : insulin은 췌장에서 생산된다.? exocrine : 소화효소2) Hormone- 화학적인 물질로 특정 기관이나 조직에서 생산되어 혈액으로 분비되어 target 조직이나 기관에 작용하여 생리적인 변화를 촉진한다.① endocrine : ACTH, cortisol② paracrine : epinephrine/norepinephrine, growth factors, immune modulators,prostaglandin③ autocrine : prostaglandin, neurotransmitter3) Mechanism of effector action① Endocrine : 호르몬이 다른 특정기관이나 조직에 생리적 작용② Paracrine : 확산을 통해 근접한 조직과 세포에 작용③ Autocrine : 한 세포에서 분비되어 같은 세포에 작용④ Juxtacrine : 세포막에서 결합하여 근처의 세포나 자신의 세포에 작용ex) EGF, TGF, TNFα, CSF4) The importance of endocrine glands① hormone : 생리적 조절② endocrine glands: 생리적 조절 시스템에 중요한 요소2. Hormone of the Pituitary1) hormone은 뇌하수체에 의해서 분비, 합성되고, 조절된다.releasing factors와 feedback regulatory factors에 의해 분비 조절pituitary의 중요한 역할로 pituitary 추출물을 뇌하수체 적출된 동물에게 투여하여 제거절개, 이식, 교체 등의 연구가 성립2) Hormones of the adenohypopSH): 갑상선 호르몬 조절, gland의 성장과 유지⑤ follicle stimulating hormone(FSH): 난포발달, sertoli-spermatogenesis⑥ luteinizing hormone(LH): ovarian steroid, testicular steroid3. Regulation of pituitary hormone secretion by the hypothalamus1) evidence for the physiological role of releasing hormones① Injection of RHs임상진단 : LH자극 부족에 의한 생식선 결점(or 불임) → LHRH 투여→ LH분비증가② portal vasculature: 혈액의 [RH]측정③ passive immunoneutralization※ TRH assay : TRH의 방출을 검정하기 위해서 antibodies와 cDNA사용Anti CRH → CRH와 ACTH유도를 막음Anti vassopression → 부분적으로 CRH분비 막음Anti LHRH → LH분비 막음④ agonist and antagonist? agonist : 작용물질, 같은 작용으로 같은 효과를 내는 물질? antagonist : agonist의 반대로 방해하는 물질ex) antagonist to LHRH : receptor와 결합하지만 활성 없다.⑤ immunocytochemical localization2) RH(releasing hormones) 작용① TRH증가 → TSH, prolactin 증가② LHRH증가 → LH, FSH 증가③ SRIH감소 → GH, TSH 감소4. Other peptide in the brain1) hypothalamic hormones or releasing factors2) hypophyseal hormones : adeno- and neuro-3) GI/pancreatic : insulin, VIP, GRP, CCK4) kidney hormones : renniCTH-adrenal axis : 부신제거술 → ACTH증가cortisol(dexamethasone) 투여 → ACTH감소선천성 부신 과형성 → cortisol 분비 결핍 → ACTH증가② TSH-thyroid axis : 갑상선 적출술 → TSH증가T4/T3 투여 → TSH 감소갑상선 기능 저하증 → TSH증가갑상선종 → 갑상선비대 → T4/T3감소, TSH증가③ LH/FSH-gonadal axis : 거세 → LH증가황체기 → FSH감소, LH감소2) Inhibins and activins① LH와 FSH분비는 항상 평행하지 않다.? GnRH투여 : LH와 FSH 일정하지 않다.? LHRH: LH 분비, FSHRH: FSH 분비? Castration of animal:FSH normal, LH증가Radiation(inhibin분비하는 sertoli cell을 파괴) → FSH증가, LH normal② Water soluble inhibitor of FSH release? inhibin에 의해 FSH분비 억제③ inhibin A와 inhibin B의 특징 : 공통의 α-chain, 다른 β-chain의 비슷한 구조를 가짐LH(little or no)와 FSH분비 억제④ activins과 같은 FSHRFs발견activins : inhibin β-subunit와 같은 위치에 존재하며, FSHRH 분비를 촉진cf) homodimers of β-subunit : TGF-β, MIF, DPPGP, BMP6. Neurohypophyseal Hormones1) nerohypophyseal peptide hormones① oxytocin : 자궁근육의 수축, 유선의 근상피세포의 수축② vasopressin : 혈관근육의 수축, 신장의 재흡수 증가2) Regulation of oxytocin and vasopressin secretion① vasopressin/ADH : 시상하부의 시삭상핵과 실방핵에서 분비된다.? 분비 : 혈액의 삼투압 증가, 혈액량 감소, angioten보유Neurophysin : 시상하부로부터 합성과 분비되는 단백질7. Hormone assays and especially bioassay1) hormones assays의 종류① bioassays (생체분석)? 약물이나 화학물질 등의 효력의 단위나 역가에 관해서 실제로 사용하기 전에 동물에 사용하여 정량?적정량을 검정하는 것? bioassays보다 chemical assay가 더 정확하지만, 특이적이고 민감하며, 여렵지 않으며 가격이 저렴하다.② chemical assays? 예를들어 17-ketosteroid 검출할 때 사용? 특이성을 위한 특징적인 물질이 필요③ competitive protein binding assays? radioimmunoassay (방사면역측정법) :항원항체반응을 이용하여 방사성 동위원소를사용하여 생체물질을 체외에서 측정하는 방법? transport protein (수송단백질)? radioreceptor assay (방사성 수용체측정법) :특정 생물활성 물질을 특이적으로 결합시키는 수용체를 분리하여 이를 항체대신 사용하는 측정법2) structural domains of hormones호르몬은 다양한 상호작용에 관여되며, 상호작용을 위해서 다른 구조적 도메인이 요구된다.① steroids : estradiol(small hormone)② ACTH : small peptides? N16,17 : 체내 안정성? N20-39 : 대사경로 효소 결정? N25-32 : 종간에 면역원, 면역반응의 차이를 보임? N1-5, 15-18 : 수용체 binding 부위? N6-14 : 세포간의 반응이나 상호작용의 친화력을 나타냄③ protein과 large peptide hormones은 tertiary구조 때문에 더 큰 복합체이다.3) what do various assays detect?① preproACTH(PPOMC)? tumor의 전구체이다.? Ab(antibody)는 precursor ACTH domain을 인지할 수 있다.? PPOMCull activity에 매우 중요하다.? glycosylation이나 posttranscriptional modification에 의해 모든 LH는 같지 않다.4) desireable features of any assay① accuracy② specificity③ precision④ sensitivity⑤ validity⑥ ease/practicability/cost8. Competitive protein binding assays and the radioimmunoassaybinding assays1) assays utilized 4 components? binding protein : tissue receptor, antibody, transport protein? labeled version of the hormone(ligand) : 일반적으로 125I, 3H(방사선동위원소)를 사용? unknown sample? standard curve2) mass action and binding equilibrium? standard curve 작성 : B(binding), F(no binding), binder의 양을 측정9. Hormone localization by immunocytochemistry and plaque assay1) Strategies for immunocytochemical localization? direct & indirect methoddirect method : 1차 항체에 표지를 붙여서 사용, 비교적 간편하지만 단백질 발현이 적으면 1차 항체로만 detection 하기 어렵다.indirect method : 직접법에 비해서 민감도가 높지만 시간이 많이 소요되고 과정이 복잡하다.? bridge methodPAP : 하나의 항원-항체 반응물에 3개의 과산화 효소가 결합되어 민감성 증가Avidin-biotin conjugate : avidin이 biotin에 친화력이 강한 원리를 이용, 민감도가 높다2) hemolytic plaquon

학교| 2009.10.14| 5페이지| 1,500원| 조회(533)

호르몬, 시험정보, 내분비학, 노트정리, Endocrine

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