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형질전환 (Transformation)

Transformation (Heat shock)* Purpose : Heat shock 방법을 통하여 E.coli에 GFP유전자를 주입시킨다.1. Introduction① Transformation형질전환은 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것을 뜻한다. 1928년 영국의 F.그리피스가 폐렴쌍구균을 이용하여 실시한 실험이 계기가 되어 발견되었다. 다당류로 이루어진 두꺼운 막, 즉 협막을 가진 S형균으로부터 DNA를 추출하여 이것을 다당류성 협막을 가지지 않은 R형균에 작용시키면 R형균의 일부가 S형균으로 변한다. 이것은 S형 세균의 DNA가 R형 세균 속에 들어가서 유전자 발현을 하기 때문이다. 전환을 일으키는데 필요한 DNA의 최소량은 약 1/10만 mol이며, DNA의 단일가닥을 주는 것보다도 이중가닥을 주는 쪽이 전환을 일으키기 쉽다. 그러나 고등생물에 있어서도 세균류에서 볼 수 있는 것 같은 형질전환이 일어나는지 어떤지는 아직 밝혀지지 않았다.② Transformation vs TransfectionTransformation은 DNA를 원핵생물에 주입할 때 쓰이는 기술로 주로 E.coli에 plasmid를 이용하여 주입하는 반면, Transfection은 DNA를 진핵생물에 주입할 때 쓰이는 기술로 주로 bacterio phage를 이용한다.③ Competent cellE.coli를 포함한 대부분의 bacteria는 일반적인 환경에서 극히 제한된 양의 DNA만을 받아들인다. 이러한 종류를 효과적으로 transformation 시키기 위하여 bacteria는 DNA를 받아들이는 능력을 향상시키는 물리적, 화학적 형태의 처리가 필요하다. 정상적인 bacteria cell에 이러한 물리적, 화학적 처리를 하여 외부의 DNA가 잘 들어갈 수 있도록 만든 cell을 competent cell이라고 한다.* Competent cell에 이용되는 strain[DH1] Recombination에 관련된 유전자가 결핍된 균으로 plasmid와 cosmid를 plating하고 성장시키는데 사용하는 균주이다.[DH5] Recombination에 관련된 유전자가 결핍된 균으로 plasmid와 cosmid를 plating하고 성장시키는데 사용하는 균주라는 점에서 그 특징이 DH1과 같으나 DH1보다 transformation 효율이 높다.[DH5α] Recombination에 관련된 유전자가 결핍된 균으로 plasmid와 cosmid를 plating하고 성장시키는데 사용하는 균주이다. 항생물질을 포함하는 배지에서는 자라지 않는다. β-galactosidase의 α-complimentation unit을 암호화하는 유전자를 포함하고 있다. 이 경우 X-Gal(lactose analogue)를 포함한 배지에서 배양하면 흰색 colony를 형성한다.[MM294] Large-scale의 plasmid의 생산에 사용되는 균주이다.[XL1-Blue] M13 phage가 infection시 붙는 receptor인 F pili를 F' factor에 가지고 있고, 이 factor는 tetracyclin을 가진 rich media에서 계속 유지된다. 따라서 이 균주는 M13 phage infection에 매우 유용한 균주이다.[JM109] pUC계 plasmid vector의 형질전환이나 M13 phage vector DNA의 형질도입 등을 실시하는 경우, vector DNA로부터 발현하는 lacZ α-peptide와 β-galactosidase의 α-complimentation을 이용하여 재조합체의 선별에 매우 유용한 균주이다. F′plasmid를 갖고 있기 때문에 유전자 library의 제작이나 subcloning 이외에 M13 vector DNA의 숙주로써 ssDNA의 제조에도 사용할 수 있다.[CJ236] dUTPase(Dut)와 Uracil-DNA glycosylase(Ung)를 결손하고 있어 DNA 중의 Thymine(T)의 일부가 deoxyuracil(dU)로 치환된 DNA를 합성한다. F′plasmid(pCJ105)는 chloramphenicol 내성 유전자를 갖고 있기 때문에 chloramphenicol 존재하에서 안정하게 보호·유지된다.[TH2] supE- trpR- rpsL-균주로 trp promoter의 하류에 amber 변이를 갖는 치사 유전자 rpsL이 코드하는 Enforcement Cloning System용 vector pKF3 DNA를 사용함으로써 외래 유전자의 삽입 유무를 streptomycin 첨가 배지에서의 생육으로 간편하게 판별 가능하다.[MV1184] Amber suppressor free 균주로 non-amber DNA vector만이 증폭이 가능하므로 amber 변이의 선택에 이용한다. 또한 F' plasmid를 가지고 있기 때문에 M13 phage vector나 phagemid의 host cell로 이용이 가능한 균주이다.2. Methods ([DH5α] competent cell을 사용할 경우)① 5-10ng (DNA 크기 및 competent cell 상태에 따라 0.1-50ng까지)의 plasmid/cosmid DNA를 50ul competent cell에 첨가한 후 잘 섞는다. (이번 실험시 순도가 낮아서 80ng을 사용) → GFP 0.44ug/ul을 2ul씩 첨가한다.

자연과학| 2009.09.01| 2페이지| 1,000원| 조회(561)

형질전환, Transformation, 형질변환, 형질

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핵형분석 실험 (Karyotyping)

[생물공학 실험보고서]Karyotyping-4th Experiment-1. Principle(1) 핵형분석(Karyotyping)사람 염색체가 46개라는 것은 1956년 Tjio와 Levan에 의해 확정되었다. 염색체는 크기와 동원체 위치에 따라 4 종류로 나눈다.메타센트릭(metacetric): 동원체가 한가운데 위치하여 염색체의 2개의 팔이 같거나 거의 같은 크기.서브메타센트릭(submetacentric): 중심체가 한쪽에 치우쳐 있어 장완(long arm)과 단완(short arm)이 구별됨.아크로센트릭(acrocentric): 중심체가 한쪽 끝에 치우쳐 있어 장완은 아주 길고 단 완은 짧은 상태.텔로센트릭(telocentric): 중심체가 염색체 한쪽 끝에 있어서 한쪽 팔만 존재.사람의 46개의 유전자를 그 크기 및 동원체(centromere)의 위치에 따라 7군(A-G)군으로 우선 분류하고 그것들을 크기에 따라 나란히 한 것을 핵형이라고 부른다. A그룹 염색체는 3쌍으로 구성되며, 전체 염색체 중에서 가장 크며 메타센트릭 염색체들이다. B그룹은 가장 큰 서브메타센트릭 염색체 2쌍으로 되어 있고, C그룹은 조금 작은 서브메타 센트릭 염색체 7쌍으로 구성된다. 또 D그룹은 큰 아크로센트릭 염색체 3쌍, E그룹은 작은 서브메타센트릭 3쌍, F그룹은 작은 메타센트릭 염색체 2쌍 그리고 G그룹은 작은 아크로센트릭 염색체 2싸으로 각각 구성되어 있다. 사람의 성 염색체는 서로 다른 형태를 가지는데 X염색체는 C염색체형의 서브메타센트릭 염색체이고 Y염색체는 G염색체형의 아크로센트릭 염색체이다.개개의 염색체 위에 어떤 유전자가 놓여 있고 그것들의 상대적 위치관계가 어떻게 되어 있는가를 결정하기 위해서는 각종 염색체의 동정이 대단히 중요하다. 그러나 B군(2종), C군(7종), D군(3종)처럼 형태가 아주 유사한 염색체군에서는 통상적인 염색에 의한 식별이 곤란하다. 이 때문에 1970년대에 들어와서 각종 염색체 분염법이 개발되었다. 이들 중에 현재에도 이용되는 것에는 Quinaquiline에 의한 Q band법(Q banding), Giemsa 염색에 의한 G band법(G banding) 등이 있다. Q band법은 퀴나크린(quinacrine)과 같은 형광물질로 염색하여 밴드 양상을 관찰할 수 있으나 형광이 유지되는 시간이 짧고 시료를 관찰하기 위해서는 형광현미경과 자외선 투사가 필요하다는 단점이 있다. G band법은 감자(Giemsa)시약으로 염색한 후 특별한 처리가 필요하지 않으며, band 양상의 안정성과 재현성 때문에 가장 유용하고 일반적인 방법으로 이용된다. 이들 분염법의 염색기전에는 미지의 부분이 많지만 어느 조직에서 염색체 표본을 만들어도 일정한 염색체 pattern을 나타내기 때문에 실용으로 유용한 방법으로 사용되고 있다. 이러한 염색체 분염법의 발달로 유전자의 증폭이나 염색체 전좌에 관한 이제까지 불가능했던 상세한 해석이 가능해 지고 있다.(2) Fluorescence In Situ Hybridization(FISH)염색체의 비정상으로 상당히 많은 질병이 유발된다. 이런 염색체 이상을 쉽게 발견하여 질병과의 연관성을 쉽게 함으로써 진단의 새로운 방법으로 떠오르고 있다. 전통적인 핵형분석은 흑백의 23개의 염색체 세트를 관찰하는 방법으로 염색체의 크기와 염색체 번호를 밝힐수 있는 방법으로 전위와 같은 염색체의 이상성을 정확하게 밝히기에는 적당한 방법이 될 수 없다. 그러나 최근 개발된 Fluorescence In Situ Hybridization(FISH)은 새로운 분자ㆍ세포유전학적 기법으로 특정 DNA 배열을 표적 DNA와 hybridization을 시행한 후 형광으로 그 특정 DNA 배열에 관한 정보를 얻어 염색체 이상을 신속하게 진단할 수 있는 기법이다. 이 기술은 세포분열 중기의 염색체는 물론 세포분열 간기 세포에서도 결과를 얻을 수 있어 분열기 세포가 적은 융모막 세포에 적용할 때 유리하며 통상적인 세포 유전학 방법에 반해 과정이 비교적 간단하고 판독이 용이하며 비용이 덜 들고 신속한 결과를 얻을 수 있다는 장점이 있다. 또한 여러 가지 소식자를 동시에 사용할 수 있어 하나의 간기세포에서 많은 정보를 동시에 얻어낼 수 있다.FISH는 색으로 구분되는 염색방법을 사용함으로써 한눈에 염색체에 다른 색이 섞여 있는 것을 관찰함으로써 이상을 확인할 수 있다. 형광 표지된 짧은 single strand DNA를 probe를 library화 한 뒤 이들을 동시에 염색체에 hybridization시킨다. 이렇게 한 염색체를 1가지색(1번 염색체는 빨간색, 2번 염색체는 노란색 등)으로 표지할 수 있는 것이다. 위의 그림에서 2번 염색체와 같이 염색체의 이상을 쉽게 발견할 수 있다. 또한 지금까지 FISH 방법의 분석은 형광현미경을 통하여 직접 눈으로 관찰하는 방법으로 주로 이루어져왔으나 최근에 들어 FISH 검사시 형광으로 나타나는 신호를 탐지하는 FISH 시스템의 도용으로 간접적으로 보다 정확한 검사가 이루어지고 있다.2. Materials① Phytohemagglutin (HA) enriched RPMI-1640 media② Colcemid solution, 10ug per ml, in Hanks balance salt solution (HBSS)③ Hypertonic KCL, 0.075M④ Fixative, 3 parts anhydrous methanol to 1 part glacial acetic acid⑤ Giemsa working solution 1% at pH 6.8⑥ Giemsa stock solution⑦ Phosphate buffer 0.025M (3.4g KH2PO4 per liter adjusted to pH 6.8 with KOH)⑧ Trypsin (1:250), 1% solution in water⑨ Methanol⑩ Acridine orange3. Method(1) Prepartion of Chromosomes① Heparinized tube들을 autoclave② PHA enriched RPMI-1640 Media 5ml를 15mL culture tube에 넣고 동결③ 3~4 방울의 피를 각 tube(해동된 것)에 넣음heparinized tube 사용하거나 직접 방울 EJfdjEmfla④ Tube를 뒤집으면서 흔들음⑤ CO2 incubator (5%), 37도에서 72시간 배양 - EN껑은 헐겁게 하여⑥ 매 24시간마다 tube를 뒤집어 놓음⑦ 각 tube에 colecimid 0.2ml 첨가

자연과학| 2009.09.01| 4페이지| 1,000원| 조회(1,215)

유전학, 분석, 핵형, karyotyping, Karyo

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FISH (Fluorescent In situ hybridization)

FISH (Fluorescent In situ hybridization)-1st Week : DNA extraction-PRINCIPLEWhat is FISH?Fluorescence in situ hybridization (FISH)는 형광염료를 사용하여 염색체나 유전자를 선명하게 색상으로 나타내는 기술이다. 이 기술은 gene mapping과 chromosomal abnormality를 관찰하는데 사용된다.How does FISH work?FISH를 하기 위해서는 일단 probe라 불리는 ssDNA으 짧은 서열이 필요하다. 이를 찾고자하는 DNA에 상보적으로 결합시켜 원하는 DNA부위를 찾아낼 수 있다. 이러한 probe를 혼성화시키거나 결합시킨 후 cDNA를 만들어낸다. 이렇게 만들어진 cDNA는 형광꼬리로 표지되었기 때문에 원하는 DNA를 눈으로 관찰 가능하게 해준다. 기존의 염색체를 관찰하는 다른 기술은 대개 actively dividing cell만을 이용하는 반면 이 기술은 nondividing cell을 이용할 수 있다.What is FISH used for?3가지 다른 FISH probe가 있다. 이들은 각각 다른 용도에 쓰인다.Locus specific probes는 염색체의 특정부위와 혼성화된다. 이 probe는 유전자에서 작은 부분을 분리할 때, 또 유전자가 염색체의 어느부위에 위치해 있는지 알아보는데 쓰인다.Alphoid or centromeric repeat probes는 염색체의 센트로미어에서 발견되는 반복되는 서열을 만들고자할 때 쓰인다. 각각의 염색체는 다른 색깔로 염색되기 때문에 이 기술은 염색체의 숫자를 알아보는데 쓰인다. 예를 들어 정상숫자 이상의 염색체를 갖고 있는 사람을 발견해낼 수 있다.Whole chromosome probes는 작은 probe를 모아놓은 것이다. 각각의 probe는 한 개의 염색체를 따라 각각의 다른 서열과 혼성화된다. 이들을 이용하여 염색체 전체의 모습을 규명할 수 있고 spectral karyotymal amount of solution according to the amount of tissue. When tissue is homogenized, bubbles may formed; however, it disappears when it is centrifuged or incubated.* G-buffer는 lysis기능을 하는 용액으로 RNase A, Proteinase K등이 첨가되어 조직을 Lysis 시킨다. 조직 덩어리는 쉽게 용해되지 않기 때문에 homogenizer를 이용하여 잘게 갈아줘야 한다.3. Incubate at 70℃ for 20min. (Lysis time)Note : For much tissue (>20-30mg), increase incubation time. To help lyse tissue, mix by vortexing the tube once during the incubation.4. Mix well by pipetting 2-3 times.Note : This step is semi-homogenization step to denature protein. Also, this step conduces to pass efficiently cell lysates through a column.5. Add 400μl of Binding buffer and mix gently.Note : Binding buffer adds equal volume of G-buffer.* Binding buffer 는 column과 DNA가 결합하는 것을 도와주는 용액이다. 후에 컬럼을 이용하여 원심분리 할 때 DNA를 제외한 나머지 물질들은 밑으로 걸러지게 된다.6. Centrifuge tissue lysates for 3-5min at 13,000rpm at 4oC and carefully transfer the supernatant to a new 1.5ml tube (not provided) by pipetting. Use only e all traces of lysates.8. To wash, add 500μl of washing buffer to the column and centrifuge for 1min. After centrifugation, remove the column from collection tube, discard filtrate in collection tube. And then place the column back in the same collection tube.* Washing buffer는 말 그대로 DNA에 붙어서 남아있는 나머지 물질들을 세척해주는 용액이다. 이물질들은 washing buffer에 녹거나 쓸려서 걸러지게 된다.9. Centrifuge the column for an additional 1min at 13,000rpm to dry the filter membrane.10. Place the column into a fresh 1.5ml tube. To elute DNA, add 100-200μl Elution buffer to the center of the column, incubate at RT for 1min, and then centrifuge for 1min.* Elution buffer는 column에 붙어있는 DNA를 용출시켜 원하는 얻을 수 있게 해주는 용액이다.RESULTO.D(Optical Density) valueAbsorbanceA10.031 Abs260 nmA20.020 Abs280 nm0.008 Abs320 nm0.181 Abs230 nmA1/A2 = 1.553DNA 농도 : A260 or O.D260 = 1이라면O.D Value x Dilution percent(%) x 50/ul= 0.031 x 50 x 50 = 77.5 ug/ul* 자외선 흡수 복사량은 DNA량에 비례 : 260nm에서 흡광도 1.0은 50ug의 복선 DNA양과 일치한다. 260nm와 280nm에서 흡광도 비율은 1.8이므로 1.8에 가까울수-3'377bpX12696Sus scrofa (pig)ch 1Forward225'-GTTGCACTTTCACGGACGCAGC-3'244bpX51555Sus scrofa (pig)ch 1reverse225'-CTAGCCCATTGCTCGCCATAGC-3'244bpX515552. PCR componentPCR reaction componenti-Taq DNA polymerase2.5UdNTPs2.5mMReaction Buffer (10x)2ulTemplate1ulPrimer (F : 12.5pmole/ul)1ulPrimer (R : 12.5pmole/ul1ulTotal reaction volumeup to 20ul with D.W3. PCR replication cycleFirst denaturation step94℃2min30 cycleDenaturation94℃20sAnnealing60℃10sExtension72℃30sElongation step72℃10minMATERIALSAccuPowerⓡ PCR PreMix kitContentsComponent Reaction Size20 ul reaction50 ul reactionTaq DNA polymerase1U2.5UEach: dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)250uM250uMTris-HCl (pH 9.0)10mM10mMKCl40mM40mMMgCl21.5mM1.5mMStabilizer and tracking dyeMETHODS① Add template DNA and primers to AccuPowerⓡ PCR tube.Concentration of template RNA and primerReaction volume20 ul reaction50 ul reactionTemplate DNA5~50 ng10~100 ngPrimer10 - 30 pmole20 - 50 pmole② Add distilled water to AccuPowerⓡ PCR tubes to a total volume of 20ulel이나 polyacrylamide gel 상에서 뚜렷하게 보이는 band로 가시화할 수가 있다. PCR반응을 통하여 in vitro상에서 특정 부위의 DNA를 105∼108배까지 수 시간내에 증폭시킬 수 있다.How does it work?1) DNA의 변성(denaturation)90°C∼96°C로 가열하여 double strand DNA(ds DNA)를 single strand DNA(ssDNA)로 분리시킨다. 높은 온도일수록 ssDNA로 잘 이행되지만 Taq DNA polymerase도 온도가 아주 높은 상태에서는 활성도가 낮아질 수 있으므로 보통 94°C로 쓴다. Cycle의 처음은 확실한 변성을 위하여 약 5분간 시간을 주어야 한다.2) Primer의 결합(annealing)50°C∼65°C에서 진행되며, 염기간에 G와 C는 세군데에서 수소결합이 일어나고, A와 T는 두군데에서 결합이 일어나므로 G+C 비율에 따라 결합온도에 변화를 주어야 한다. 일반적으로 사용되는 annealing 온도는 표 1과 같다. 비특이 PCR 산물이 형성되는 경우 결합온도를 올려서 반응시켜 보면 비특이 산물을 줄이는데 도움이 되는 수가 있다.3) DNA의 합성(polymerization)70°C∼74°C에서 시행하며 원하는 PCR 산물의 크기가 크거나 반응요소의 농도가 낮을 때에는 시간을 연장시키는 것이 좋다. Taq DNA polymerase는 보통 1분에 2,000∼4,000 nucleotides를 합성할 수 있으므로 원하는 PCR 산물의 크기 1 kb마다 1분 정도의 시간을 배당하면 충분히 반응이 일어날 수 있다. Cycle이 계속되면서 효소 활성이 감소할 수 있고 DNA 산물은 점점 많이 존재하게 되므로 cycle 후반부에는 반응시간을 조금씩 늘려가는 것도 좋은 방법의 하나이며, 마지막 cycle에는 시간을 충분히(10분) 주어 효소의 활성이 충분히 발휘되도록 한다.위 과정이 계속 반복하여 진행되면서(보통 25∼35회) 원하는 DNA 부분을 증폭시키는 것이 PCR의.

자연과학| 2009.09.01| 7페이지| 1,000원| 조회(996)

DNA, 형광, fish, hybridization, fluorescent

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[분자생물학 실험] Genomic DNA Extraction

1. Date2. Group3. Name4. TitleGenomic DNA 분리5. MaterialPhenol (equilibrated with 0.5 M Tris buffer pH 8.0), Chloroform, Ethanol (100%, 70%), Distilled water, Tissue sample.6. Method1. 준비한 조직을 잘게 뭉갠 후 앞서 만들었던 DNA extraction buffer에 넣는다.2. Proteinase K의 단백질분해를 위해 37℃ ~ 45℃에서 3시간 ~ 밤새 인큐베이션 시킨다.3. 1.5mL tube에 인큐베이션 시킨 용액을 500㎕ 넣고, 이어서 페놀 400㎕를 넣는다.4. 조심스럽게 섞어준 후 층이 질때까지(약 15분간) 방치한다.5. 12000rpm에서 5분간 RT(실온)에서 원심분리한다.6. 상층액(약400~450㎕정도)을 새로운 tube로 옮기고 400㎕ chloroform을 넣는다.7. 조심스럽게 섞어준 후 아까와 같이 12000rpm에서 5분간 RT(실온)에서 원심분리한다.8. 상층부를 ~400㎕정도 다른 튜브로 옮긴 후, 부피의 2배만큼의 100% EtOH를 넣고 잘 섞어주면 하얀 pellet(DNA)가 생긴다.9. 잘 섞은 후 20~30min standing 시킨다.10. 12000rpm에서 3분간 4℃에서 원심분리한다.11. 용액을 모두 버리고 pellet만 남긴 후, 70% EtOH(800㎕정도)로 세척한다. (2번 반복)

자연과학| 2009.04.09| 1페이지| 1,000원| 조회(1,122)

분리, DNA, Extraction, genomic

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[분자생물학 실험] DNA extraction buffer 만들기

1. Date2. Group3. Name4. TitleDNA extraction buffer 만들기5. Material1M Tris/pH8.0, 10% SDS, 0.5M EDTA/pH8.0, 100mg/mL proteinase, 70% EtOH, 3M Sodium acetate/pH4.76. Method[1] Solution 만들기1. 1M Tris(pH 8.0) 수용액 50mL 만들기 (Tris의 분자량은 121.1)1mol/L = 1M 이면 0.05mol/0.05L = 1M이다. Tris 0.05mol은 121.1×0.05mol = 6.055g 이 필요하다. 즉, 물 0.05L에 Tris 6.055g 을 넣으면 1M Tris 50mL가 완성된다.2. 10% SDS용액 만들기 50mL 만들기SDS 용액 5mL에 물 45mL를 섞는다.3. 0.5M EDTA(pH 8.0) 수용액 50mL 만들기 (EDTA의 분자량은 292)0.5mol/L = 0.5M 이면 0.025mol/0.05L = 0.5M 이다. EDTA 0.025mol은 292×0.025mol = 0.73g 즉, 물 0.05L에 EDTA 0.73g을 넣으면 0.5M EDTA 50mL가 완성된다.[2] 희석하기1. 1M Tris 수용액 50mL를 10mM Tris 수용액 10mL 만들기1M의 Tris 수용액 50mL를배로 희석시켜 10mL로 만드려면 Tris 수용액 0.1mL에 물 9.9mL를 섞으면 완성된다.2. 10% SDS 용액 50mL를 0.5% SDS 용액 10mL 만들기10% SDS 수용액 50mL를배 희석시켜 10mL로 만드려면 SDS 수용액 0.5mL에 물 9.5mL를 섞으면 완성된다.3. 0.5M EDTA 50mL를 0.1M EDTA 10mL 만들기0.5M의 EDTA 수용액 50mL를배 희석시켜 10mL로 만드려면 EDTA 수용액 2mL에 물 8mL를 섞으면 완성된다.[3] 최종 Buffer Solution 만들기만들고자 하는 Buffer 용액의 부피가 10mL이므로 1M Tris 0.1mL + 10% SDS 0.5mL + 0.5M EDTA 2mL에 물 7.4mL를 섞으면 1mM Tris + 0.5% SDS + 0.1M EDTA의 혼합물이 완성된다. 추후 이 용액에 Proteinase를 섞는다.

자연과학| 2009.04.09| 1페이지| 1,000원| 조회(2,376)

DNA, Buffer, 분자생물학, Extraction

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