Ⅰ. 원심 분리의 원리 및 목적1. 원심분리기의 정의부유물이 있는 현탁액을 가만히 두면 밀도가 높은 물질은 중력의 영향으로 서서히 바닥으로 가라않고 밀도가 낮은 물질은 서서히 상층부로 이동하게 되는데 이런 과정을 침전이라 한다. 밀도차가 나는 물질이 섞이면 침전현상이 발생 하게 되고 시간이 지나면 혼합물을 밀도 차에 따라 분리해 낼 수 있다. (실제로 침전의 원리를 이용하여 폐수 정화시설에서 부유물과, 침전물을 분리하고 있다.) 혼합물끼리 밀도 차는 혼합물을 분리해주는 힘인 중력이 강해질수록 커지므로 인위적으로 중력을 크게 해주면 침전현상을 가속할 수 있다.중력대신 원심력을 이용하면 쉽게 침전현상을 가속시킬 수 있는데 이런 과정을 원심분리라 한다. 원심분리기는 원심분리의 원리를 이용해 성분이나 비중이 다른 물질을 분리 ·정제 ·농축하는데 쓰이는 기계이다.2. 원심분리기의 사용원심분리기는 사용목적에 따라 의료용, 폐수 처리용, 우라늄농축용, 생산용, 실험용으로 분리될수 있다.의료용 원심분리기는 혈액, 뇨, 타액등의 분석을 위해 구성성분의 분리를 목적으로 사용한다.폐수처리용 원심분리기는 환경오염 방지를 위해 폐수에서 미립자를 고형화 시켜 슬러지의 형태로 분리해내거나 유류오염물질을 분리시키기 위해 사용한다.우라늄 농축용 원심분리기는 핵무기의 원료인 농축우라늄235를 얻기 위한 원심분리기이다. 우라늄을 기체화 한 후 원심분리하면 우라늄 235와 238을 분리해낼 수 있다.생산용 원심분리기는 의약품및 식약품의 농축, 정제에 쓰이는 원심분리기이다.실험용 원심분리기는 실험에 사용되는 물질을 분리, 정제, 농축 할때 쓰는 원심분리기로 상대적으로 크기가 작아 미량원심분리기라고 부르기도 한다.3. 원심분리의 원리물체가 원운동을 하면 관성의 원리에 의해 원의 중심방향에서 원 바깥 방향으로 나가려는 힘이 원심력이다. 원심력의 크기는 질량*반지름*각속도의 제곱이므로 각속도를 조절하면 원심력의 크기를 조절할 수 있다. 원심분리기는 원심력의 크기를 조절하여 물질간의 상대적 밀도차를 조절 G라는 단위가 주로 사용 된다 (1G는 중력과 같은 힘으로써 10G는 중력 10배의 힘에 해당한다.) 실제로 원심분리에 이용되는 힘을 계산할 때는 반지름과 각속도, 원심분리되는 대상물질의 질량 이외에 물질의 점도, 밀도, 반지름, 부력이 함께 계산된다. 원심분리의 방법은 크게 두 가지로 나누어 진다.4. 원심분리의 종류1. 편차 원심분리 (differential centrifugation)원심분리를 할 때 가장 큰 입자가 먼저 침전되고 질량과 밀도가 같을 때는 보다 구형의 입자가 비대칭형 입자보다 빨리 침전된다. 그리고 원심분리의 속도나 시간을 증가시키면 상대적으로 작은 입자들도 침전된다편차원심분리는 크기에 따라서뿐 만이 아니라 같은 질량의 밀도가 큰 입자와 작은 입자를 분리할 수 있다. 이러한 특성은 크기는 비슷하지만 밀도가 다른 입자를 분리하는데 유용하다. 이 방법의 가장 큰 문제점은 튜브의 위쪽에 있는 큰 입자가 침전되는 동안 아래쪽에 있는 작은 입자와 함께 침전된다는 점이다. 이러한 동시침전을 개선하는 방법은 침전물을 다시 녹여 원심분리를 하는 것이다. 그러나 이 방법은 회수율이 떨어지며 손상을 입기 쉬운 물질의 분리에는 적용하기가 어렵다. 편차원심분리의 장점은 분리에 소요되는 시간이 몇 분 정도로 짧게 소요되며 분리매질이 간단하고 가격이 경제적이다. 따라서 편차원심분리는 실험실이나 산업현장에서 세포의 회수에 일반적으로 많이 이용되고 있다. 예를 들면, 크기가 다른 E. coli (0.5 ㎛)와 D. discoideum (10 ㎛)의 분리와 같은 경우에 효율적으로 이용될 수 있다.2. 밀도 기울기 원심분리밀도 기울기 원심분리에서는 편차원심분리 경우와 다르게 균질 용액 대신에 밀도기울기를 이용한다. 용액의 밀도는 튜브 아래로 내려갈수록 증가하기 때문에 원심분리 중의 대류(convection)에 의한 혼합을 방지할 수 있다. 밀도기울기 원심분리에는 속도침강원심분리와 등밀도원심분리의 두 가지 형태가 있다.1) 속도침강 원심분리 (rate-zonal cent 활용할 수 있다그러나 세포막 단편, 세포내 소기관 등은 분리하기 힘들다. 이 방법의 이용시에 주의할 점은 시료를 넣을 때 밀도기울기 매질의 가장 윗면으로 매질과 섞이지 않도록 조심하여 주입(loading)해야 한다는 것이다. 또한 원심분리시에도 저속에서 시간을 짧게 실시하여야 하며 그렇지 않으면 모든 입자가 바닥에 가라앉게 된다. 또한 밀도기울기 원심분리는 분리하고자 하는 시료의 형태에 따른 입자의 분리에는 적합하지 않다.2) 등밀도 원심분리 (isopycnic centrifugation)등밀도 원심분리는 밀도에 기초하여 입자를 순수하게 분리하는 방법으로 입자의 크기는 입자의 등밀도 위치에 도달하는 속도에만 영향을 준다. 이 방법의 특징은 입자가 등밀도 위치에 존재하기 때문에 고속으로 오랜시간 동안 원심분리하여도 입자에 아무런 영향을 주지 않으며 바닥에 가라앉지도 않는다. 또한 시료를 주입(loading)할 때 매질과 섞이어도 분리에는 아무런 영향을 주지 않는다. 밀도기울기의 형성은 매질에 따라 만들어서 넣어 주어야 하는 것과 원심분리하는 동안 자발적으로 이루어지는 것이 있다.5. 원심분리기의 성능에 따른 분류원심분리기의 성능은 원심분리기의 분당가능 회전속도와(최대 rpm) 원심효과(G)로 정해진다.1) 저속 원심분리기 (low-speed centrifuge)탁상용 원심분리기라고도 불리우며 일반적으로 6,000 rpm (6,000 xg) 이하의 속도를 낼수 있고 속도와 온도의 정밀한 조절이 어렵고 주로 세포나 핵 등과 같이 쉽게 침전되는 시료의 원심분리에 이용된다.2) 고속 원심분리기 (high-speed centrifuge)최고속도가 20,000-25,000 rpm (60,000 xg)으로 냉각장치를 갖추고 있으며 진공장치가 되어있는 것도 있다. 이 기계는 주로 밀도기울기 분리에 이용할 수 있으며 주로 세포, 핵, 세포내 소기관 등의 분리에 이용된다.3) 초원심 분리기 (ultracentrifuge)초원심 분리기는 최대속도가 40,000-80,000 rpm소기관, 세포막 구성성분, 라이보좀, 폴리좀, 거대분자 등을 분리할 수 있다.6. 원심분리기의 로터 (rotor)초기의 로터는 구형의 금속을 이용하여 원하는 속도에 도달하였을 때 파괴되지 않을 만큼 충분히 강한 상태를 실험에 의해 알아내어 설계하였다. 그러나 오늘날에는 컴퓨터를 이용하여 회전시의 원심력의 작용을 예측한 후 원심분리에 충분히 견딜 수 있을 만큼 강하게 설계하고 있다.1) 로터의 재료로터의 강도는 속도의 제곱에 비례한다. 따라서 초고속원심분리기에는 저속 원심분리기에서 사용되는 것보다 매우 큰 강도를 가져야 한다.저속의 로터는 황동 및 플라스틱, 알루미늄 합금 등으로 만들고 고속 및 초고속의 로터는 알루미늄이나 티타늄 합금을 이용하여 만든다. 흔히 사용하는 알루미늄 로터는 산이나 염기성의 용액에 의한 부식에 매우 약하기 때문에 표면을 산화필름으로 감싸 부식을 방지하고 있다. 또한 알루미늄 로터는 빠른 속도로 원심분리할 때 로터 몸체 내부의 부식이 진행될 수 있다. 티타늄 합금은 산과 알카리의 부식에 강하기 때문에 거의 영구적인 내구성을 가지며 외부는 검은 에폭시(epoxy) 페인트로 칠해져 있으며 값은 비싸지만 표면에 손상을 입지 않기 때문에 로터의 온도 조절에 적합하다.2) 로터의 형태일반적인 로터의 형태는 수평 로터, 고정각 로터, 수직 로터, 그리고 침강 로터로 구분할 수 있다.(1) 수평로터(swing-out rotor)이 방식은 로터가 축에 대해 수직으로 회전한다. 고정각로터나 수직로터보다 적은 양의 시료를 처리하며 속도침강 원심분리와 등밀도 원심분리에 이용된다. 이 로터는 입자들의 침강거리가 길기 때문에 대류현상을 감소시키며 고리로 바구니를 걸도록 되어있기 때문에 저속에서 주로 이용한다. 그러나 편차 원심분리에는 적합하지 않다.(2) 고정각 로터 (fixed-angle rotor)이 방식은 로터 내에 일정한 각도 (보통 14°-40°)로 회전할 수 있는 공간이 마련되어 있으며 침전거리가 짧기 때문에 주로 침전물 형성에 이용된다. 그리고 튜에서 이용되는 것으로 튜브의 축과 로터의 축이 평행하여 침전거리가 짧다. 그리고 회전반경을 줄일 수 있어 로터에 원심력이 적게 걸리므로 고속으로 회전시키는데 큰 문제가 되지 않는다. 이 로터는 수평로터나 고정각로터보다 기울기 형성 능력이 크기 때문에 주로 등밀도 원심분리에 이용된다.(4) 침강로터 (zonal rotor)침강로터는 대부분 밀도기울기 원심분리를 위해 이용되는 것으로 원리는 수직로터와 비슷하나 큰 부피의 기울기매질을 사용할 수 있고 로터가 회전 중에 분리하고자 하는 시료를 주입할 수 있다는 점이 다르다. 침강로터는 회분식 형태와 연속식 형태로 구분되어진다.7. 원심분리의 목적뇨, 타액 등의 분석을 위해 구성성분의 분리를 목적으로 사용한다. 폐수처리용 원심분리기는 환경오염 방지를 위해 폐수에서 미립자를 고형화 시켜 슬러지의 형태로 분리해내거나 유류오염물질을 분리시키기 위해 사용한다. 우라늄 농축용 원심분리기는 핵무기의 원료인 농축우라늄235를 얻기 위한 원심분리기이다. 우라늄을 기체화 한 후 원심분리하면 우라늄 235와 238을 분리해낼 수 있다. 생산용 원심분리기는 의약품 및 식약품의 농축, 정제에 쓰이는 원심분리기이다. 실험용 원심분리기는 실험에 사용되는 물질을 분리, 정제, 농축 할 때 쓰는 원심분리기로 상대적으로 크기가 작아 미량원심분리기라고 부르기도 한다.Ⅱ. 생화학에서의 원심분리란?생화학에서의 원심분리는 세포의 가장 중요한 요소인 단백질 및 Plasmid DNA or RNA를 정성, 정량하기 위한 분리법이 중심이 된다.1. Plasmid DNA or RNA 원심분리플라스미드를 정제는 total cell DNA를 일반적인 분리방법과 같다. 플라스미드를 지니는 세포를 액체배지에서 배양하여 수확하고 cell extract를 하면된다. extract는 단백질을 제거하고 에탄올침전으로 DNA를 응축시킬 수 있다. 그러나 totall cell DNA 분리와 plasmid 정제와는 중요한 차이점이 있다. 플라스미드 분리는 일반적으로 많은 양의 chro.
1. 사이토크롬 P450 대사효소란?약을 먹게 되면 혈액으로 흡수되고 간에서 대사를 받은 다음에 인체의 각 조직에 분포하게 되고 마지막으로 배설기관을 통하여 몸 밖으로 나가게 된다.체내로 들어온 약의 대사는 주로 간의 효소가 담당을 하는데 이 가운데 사이토크롬 P450이라는 효소가 약을 체외로 배출하기 쉽게 바꾸어 주는 역할을 한다. 사이토크롬 P450은 의약품 대사의 75%이상을 차지하고 있다. 인체 내에는 50 여종 이상의 사이토크롬 P450 효소가 존재하는 것으로 알려져 있다. 의약품의 화학적 구조에 따라 사람의 간에서 약 15종 정도의 사이토크롬 P450효소가 대사에 관여하고 있다. 사이토크롬 P450 2C19 (CYP2C19) 효소는 사이토크롬 P450효소의 한 종류로서 항우울제나 항궤양제 등의 약물을 대사시킨다.2. CYP2E1?(Cytochrome P450, family 2, subfamily E, polypeptide 1)Cytochrome P450 2E1 (abbreviated CYP2E1, EC 1.14.14.1), a member of the cytochrome P450mixed-function oxidase system, is involved in the metabolism of xenobiotics in the body.While it is involved only in the oxidative metabolism of a small range of substrates (mostlysmall polar molecules), there are many important drug interactions mediated by CYP2E1.3. CYP2E1의 기질, 억제제, 유도제기질억제제유도제Often mentioned:anaestheticshalothaneisofluraneenfluraneparacetamol (analgesic, antipyretic)Other:dapsone (antibiotic)theophylline (stimulant)ethanol (psychoactive)chlorzoxazone (muscle relaxant)toluene (solvent) - primarilyStrong:diethyldithiocarbamate (in cancer)unspecified:cimetidine (H2-receptor antagonist)disulfiram (in alcoholism)acetone (cleaning fluid)ethanol (psychoactive)isoniazid (in tuberculosis)4.Regulation of CYP2E1?Within one day of birth, the rat hepatic CYP2E1 gene is activated transcriptionally. CYP2E1 expression is easily inducible. It seems that there exist two stages of induction, a posttranslational mechanism for increased protein stability at low levels of ethanol, and an additional transcriptional induction at high levels of ethanol.-따라서, 과도한 음주가 CYP2E1 대사 효소를 증가시킨다.5.약물의 대사약물대사의 의의체내에 흡수된 약물은 대부분이 여러가지 생화학적 변화를 거쳐 배설되는데, 그 의의는 다음과 같다.생화학적 변화로 인하여 형성된 산물은 원래 약물에 비하여 지방 용해도가 낮아진 극성 물질(polar compound)로 변화되는 경우가 많으며, 그 결과 세포막을 잘 통과하지 못하고 소변 또는 담즙으로 배설된다.화학적 변화로 인하여 그 약리학적 작용도 경감 내지는 소실되는 것이 보통이다. 이것은 일종의 생리적 방어 기전이라고도 생각할 수 있어서 약물의 체내 화학적 변화를 해독 작용(drug detoxication)이라고도 하였다. 그러나 체내에서 일어나는 화학적 변화가 반드시 작용의 소실을 가져오는 것은 아니고 오히려 작용이 강하게 되는 때도 많으므로 이것을 해독작용이라고 하기에는 적당치 않아 약물의 생체내 변화(biotransformation of drug)라고 부르고 있다.Phase I and Phase II Reactions체내에서 일어나는 약물의 생화학적 반응은 크게 제 I 상 반응(phase I reaction)과 제 II 상 반응(phase II reaction)으로 구분한다.제 I 상 반응은 붕괴(degradation) 또는 비합성 반응(nonsynthetic reaction)이라고도 하며 산화, 환원 및 가수분해가 있다. 제 I 상 반응의 대사산물은 극성물질로서 대부분 작용이 약하게 되거나 없어지지만 반대로 불활성 물질이 활성 물질로 되기도 한다. 원래 약물(parent drug)은 작용이 없고 대사 산물이 활성을 가질 경우 원래 약물을 전구 약물(prodrug)이라고 한다.제 II 상 반응은 포합(conjugation) 또는 합성 반응(synthetic reaction)이라고 하며 약물 또는 대사 산물이 내인성 물질과 결합한다. 제 II 상 반응에는 glucuronic acid 포합, etherial sulfate 포합, glycine 포합, ornithine 포합, glutamine 포합, mercapturic acid 포합, acetyl화, methyl화 등이 있다.I 상 반응과 II상 반응은 대개 순서대로 일어나지만 약물에 따라서는 어느 한 가지만 있는 경우도 있고 II 상 반응이 먼저 일어날 수도 있다.간장 microsome 효소계에 의한 약물 대사산 화：약물 대사의 산화에서는 cytochrome P450이 중요한 역할을 한다. 여러 약물이 체내에서 주로 산화 반응으로 대사되며, 그 대부분의 산화 대사는 간장의 microsome에 있는 mixed function oxidase 즉 monooxygenase 또는 microsomal hydroxylase라고도 불리우는 효소에 의하여 이루어진다. 대표적인 효소로는 Cytochrome P450과 cytochrome reductase가 있다.환 원：Microsome에 의한 환원 반응은 azo 및 nitro기를 가진 화합물에 한하며 이같은 반응은 microsome 이외의 효소에 의해서도 일어난다.가수분해：Ester 및 amide 화합물의 일부는 microsome 효소에 의해 환원되며 ester인 meperidine과 amide계 국소마취제의 가수분해가 대표적인 예이다.Glucuronic acid 포합：여러 포합반응중 유일하게 microsome 효소에 의해 일어나는 합성(포합; 제 II 상) 반응이다. Glucuronic acid에 포합된 물질은 수용성이 크게 증가되어 소변 또는 담즙으로 배설되며 때로는 능동적 분비에 의해 배설된다.약물대사효소의 유도 및 억제1. 약물 대사 효소의 촉진(유도)：어떤 약물이 자기 자신 또는 다른 약물의 간장 microsome에 의한 대사를 촉진 시킬 때를 말하며, 이런 약물에는 수면제인 phenobarbital, steroid 호르몬, 발암물질인 benzo[a]pyrene과 3-methylcholanthrene 등이 있다.약물 대사 효소의 촉진은 약물을 반복 투여할 때 생기는 내성(tolerance)을 일으키는 원인이 되기도 하고, 두가지 이상의 약물을 투여할 때에 나타나는 약리 작용의 변동 원인이 되기도 하여 약물치료에 중요한 역할을 한다.2. 약물 대사 효소의 억제：일부 약물은 간장의 microsome 약물 대사를 억제한다. 그중 대표적인 약물은 SKF-525A(proadifen), 결핵 치료제인 isoniazid, 위궤양 치료제로 사용하는 cimetidine 등이 있으며, 이러한 약물의 작용으로 다른 약물들의 약효 지속시간이 연장되거나 독성이 심하게 나타나는 등의 영향이 나타난다.6.음주와 CYP2E1알코올과 구강 · 식도우리가 술을 마시면 위장관에서 흡수되기 전에 가장먼저 접촉하는 신체 부위가 구강과 식도이다. 간이나 다른 조직에 비해 구강 및 식도에는 유해산소를 중화시킬 수 있는 여러가지 항산화제나 복구에 관여 효소들이 적어서 암이 쉽게 발생할 수 있다는 연구가 있다.
1. 서론(introduction): 과산화물가측정1. 목적 (원리)지방의 산패에서 생기는 과산화물가를 실험을 통해서 측정해보고, 산패의 정도에 따른 과산화물가의 정도를 알아보자.▶ 과산화물가란?? 유지 1kg에 함유된 과산화물의 mg 당량수? 과산화물은 유지의 산화가 진행됨에 따라 증가하다가 carbonyl 화합물로 되어 결국 감소? 유지의 초기 단계에 있어서 산패정도를 나타내는 척도? 값이 높을 수록 산패가 진행된 것임? 요오드 적정법 : 요오드는 높은 산화환원 전위를 가진 물질에는 산화제로서 활동하기 때문에 요오드 표준액으로서 직접 그 물질을 정량할 수 있다.시료에 할로겐 원소를 작용시켰을 경우 흡수되는 할로겐 원소의 양을 요오드로 환산하여 시료에 대한 백분율로 표시한 것이 요오드값(Iodine value)이다. 즉, 유지 100g에 흡수되는 ICl의 양을 I로 환산해서 g수로 표시한 것이다. 이 값으로 유지의 불포화도를 알 수가 있다. 이 값은 지방질의 불포화도를 나타내는 척도가 된다.?R-OO+2H++ 2I-→ R-OH+I2+H2O2+2Na2S2O3 →Na2S4O6+2NaI2. 재료 및 방법(materials & method)1)재료- 초산: 클로로포름(3:2)혼합액: 초산 300ml과 클로로포름200ml을 비커에 넣고 교반봉으로 저었다.-시료(식용류): 살짝 가열한 뒤 식혀서 실험하였다.-0.01N티오황산 나트륨용액, 포화요오드칼륨용액2)방법과산화물가를 측정하기 위하여 유지는 식용류 를 사용하였으며, 가열한 뒤 식혀서 이물질을 살짝 넣었다. 순수한 식용유는 실험하기 어려우므로 인위적으로 과산화물가값을 높이기 위함이다. 시료5g을 초산:클로로포름(3:2)혼합액 25ml에 녹인뒤, 포화요오드칼륨용액 1ml을 넣고 어두운 곳에 서 10분간 방치한 뒤에 물30ml과 전분시액 1ml을 가하였다. 0.01N티오황산 나트륨용액 을로 무색이 될 때까지 적정하였다. 공시험은 증류수 5g을 사용하였으며, 같은 방법으로 적정한 뒤 계산식에 의하여 과산화물가 값을 구하였다.ㄱ. 시료5g을 삼각플라스크에 취한다.ㄴ. 초산: 클로로포름(3:2)혼합액25ml을 넣고 유지를 녹였다.ㄷ. 포화요오드칼륨용액1ml을 넣고 섞은 후 어두운 곳에서 10분간 방치했다.ㄹ. 물 30ml와 전분시액1ml을 가한다.ㅁ. 0.1N- 티오황산 나트륨용액으로 무색이 될 때 까지 적정작업을 했다.ㅂ. 공시험은 증류수 5g을 넣고 같은 방법으로 적정하였다.ㅅ. 측정항목과 측정값을 모두 기재 했는지 확인하고 그값을 이용한 계산 과정까지만채점했다.3. 과산화물가(V - v) × F × 0.01 × 1000 /SV : 본시험의 0.01N ? NaSO용액의 적정 소비량(ml)v : 공시험의 0.01N ? NaSO용액의 적정소비량(ml)F : 0.01N ? NaSO용액의 역가S : 시료채취량(g)4. 주 의 점①산을 다루는 실험이므로 안전을 위해 실험복을 착용하고 장갑을 끼도록 한다.②KI포화용액은 미리 만들어 놓았다가 사용하면 안되고 실험 바로 전에 만들어 사용한다.③0.01N ? NaSO용액의 역가는 변화하기 쉬우므로 희석한 다음 신속히 사용해야한다.④클로로포름은 마취제로 사용하는 유독한 물질이며 흡입 시 매우 유해하므로 입을 이용하여 다루지 말아야 함. 또한, 클로로포름은 매우 성능이 좋은 유기용매로 피부에 닿았을 경우 피하지방을 녹여내어 백선 반점을 만들므로 피부에 닿지 않도록 주의한다.⑤산을 사용하는 실험이므로 산에 의한 화상에 주의한다.⑥표준용액을 묽힐 때 증류수를 쓰는 이유는 표준용액 속에 녹아있는 인산염은 100ppm으로 극히 미량이 사용되고 또한 묽히는 양에 비해 매우 적기 때문에 다른 이온에 의해서 반응하여 그 양 이 급격히 차이가 날 수 있다. 이를 막기 위해서 순수한 증류수로 희석을 하게 된다.⑦빙초산이 피부와 점막에 닿으면 심한 염증을 일으키므로 주의한다.5. Overall유지의 산화 초기 단계에서 산화정도를 나타내는 것은 과산화물의 축적인데. 이를 정량 하는 것이 과산화물 값이다.과산화물가란 유지 1Kg에 함유된 과산화물의 mg당량수를 말한다. 과산화물은 유지의 산화가 진행됨에 따라 증가하다가 carbonyl화합물로 분해되어 결국에 가서는 감소되는 특징이 있다. 과산화물가가 높을수록 유지의 산패가 진행된 것으로 식품으로서 부적당한 것이다.
1. 아질산나트륨이란?식품첨가물영문명 Sodium Nitrite화학식 NaNO2분자량 69.00성분규격함량 이 품목은 건조한 다음 정량할 때, 아질산나트륨(NaNO2) 97.0% 이상을 함유한다.성상 이 품목은 백∼엷은 황색의 결정성분말, 알맹이 또는 막대기 모양의 덩어리이다.확인시험 이 품목은 확인시험법중 아질산염 및 나트륨염의 반응을 나타낸다.순도시험(1) 용 상 : 이 품목 1g을 물 20ml에 녹일 때, 그 탁도는 거의 징명 이하이어야 한다.(2) 염화물 : 이 품목 1g을 물에 녹여 500ml로 하고 그 10ml에 초산 3ml를 가하여 천천히 가온하여 가스가 발생하지 않게 된 다음 묽은질산 6ml를 가하여 이를 시험용액으로 하여 염화물시험을 할 때, 그 양은 0.01N 염산 0.4ml에 대응하는 양 이하이어야 한다.(3) 황산염 : 이 품목 1g을 물에 녹여 100ml로 하고 그 중 10ml에 염산 1ml를 가하여 수욕상에서 증발건고하고 그 잔류물에 묽은염산 1ml 및 물 20ml를 가하여 녹인 것을 시험용액으로 하여 황산염시험을 할 때, 그 양은 0.01N 황산 0.5ml에 대응하는 양 이하이어야 한다.(4) 비 소 : 이 품목 0.25g을 물 5ml에 녹여 염산 2ml를 가하여 수욕상에서 증발건고한 다음 그 잔류물에 물 5ml를 가하여 녹인 것을 시험용액으로 하여 비소시험을 할 때, 이에 적합하여야 한다(4ppm 이하).(5) 중금속 : 이 품목 1g을 물 10ml에 녹이고 염산 1ml를 가하여 수욕상에서 증발건고한 다음 다시 염산의 냄새가 없어질 때까지 수욕상에서 가열한 다음 잔류물에 묽은초산 2ml 및 물 20ml를 가하여 녹인 액을 시험용액으로 하여 중금속시험을 할 때, 그 양은 20ppm 이하이어야 한다.건조감량 이 품목을 100°에서 5시간 건조할 때, 그 감량은 3% 이하이어야 한다.정량법 이 품목을 건조한 다음 약 1g을 정밀히 달아 물에 녹여 100ml로 하고 그 중 10ml를 취하여 미리 0.1N 과망간산칼륨용액 40ml, 물 100ml 및 황산 5ml를 가한 삼각플라스크 중에 피펫의 끝을 담그면서 가하여 5분간 방치한 다음 0.1N 수산용액 25ml를 가하여 약 80°로 가온하여 뜨거울 때 과잉의 수산을 0.1N 과망간산칼륨용액으로 적정한다. 따로 같은 방법으로 공시험을 한다.0.1N 과망간산칼륨용액 1ml ＝ 3.450mg NaNO2아질산나트륨 및 이를 함유하는 제제의 사용기준아래의 식품 이외에 사용하여서는 아니된다. 사용량은 아질산이온으로서 아래의 기준이상 남지 아니하도록 사용하여야 한다.1. 식육가공품(포장육, 식육추출가공품, 식용우지, 식용돈지 제외) 및 고래고기제품 : 0.07g/kg2. 어육소시지 : 0.05g/kg3. 명란젓 및 연어알젓 : 0.005g/kg2.실험 이론▣ 아질산염의 정량▶원 리방향족 amine류는 NO2 에 의해 diazo화 되며, 이 diazonium염은 또한 적당한 결합제(방향족 amine류)에의해 zo색소를 생성한다. 이것은 NO2 의 특이한 반응으로서, 대부분의 NO2 정량법은 거의 이 반응을 이용하여 비색정량을 행하는 것이다. 이 방법에서는 염산 산성하에서 sulfanilamide와 NO2 가 반응하여 diazonium염을 만들고 또한 naphthyl ethylenediamine 과 결합시켜 생긴 azo색소를 비색정량한다.▶시 약① Sulfanilamide 용액 : Sulfanilamide (특급) 0.5g을 10% HCI 100㎖에 가온하여 녹인다.② Naphthyl ethylenediamine 용액 : N-(1-naphthyl) ethylenediamine 염산염(특급) 0.12g을 물에 녹여 100㎖로 한다. 녹지 않는 물질이 있으면 여과한다.③ 0.5 Na- NaOH용액④ 12% ZnSO4`7H2O 12g을 녹여 100㎖로 한다.⑤ 10% 초산암모늄완충용액 : 초산암모늄(CH3COONH4 ) 100g을 물 약 900㎖에 녹이고 10% 암모니아수로 pH 9.1로 조정한 다음 물을 가하여 1,000㎖로 한다.⑥ 아질산성 질소 표준용액 : NaNO2 (특급)을 황산 데시케이터 중에서 24시간 건조시켜 다음 그 0.493g을 정확히 칭취하여 멸균증류수에 녹여 전량을 1ℓ로 하여 표준원액으로 한다. 이 표준원액 10㎖를 취하여 멸균증류수를 가해서 100㎖로 하고 다시그액 1㎖를 취하여 물로 100㎖로 한 것을 표준용액으로 하며 사용할 때 새로 조제한다. 아질산성 표준용액 1㎖는 0.1㎍의 NO2 -N(아질산성 질소)를 함유한다.▶사용 기구분광광도계▶조 작(1) 시험용액의 조제시료를 잘게 썰고 유발에서 충분히 으깨어 부순 다음 그 5~10g을 취하여 물 150㎖를 가한다. 이어서 0.5 N- NaOH용액 10㎖와 12% ZnSO4 용액 10㎖를 가하고 70~80℃의 수욕 중에서 20분간 가온한 다음 흐르는 물로 냉각시키고 10% 초산암모늄완충용액 20㎖를 가한다. 이 침출액을 200㎖의 메스플라스크에 정량적으로 옮기고 또한 삼각플라스크도 물로 2~3회세척하여 세액을 메스플라스크에 합친 다음 물을 가하여 200㎖로 한다. 이 액을 충분히 혼합하여 약 10분간 방치한 다음 건조여과지를 사용해서 여과하여 공전 삼각플라스크에 넣는데 처음 나오는 여액약 20㎖는 버리고 맑은 여액을 시험용액으로 한다.
1. 실험제목: 간에서의 glycogen 분리2. 실험일자: 2009. 9. 93. 제출자 및 공동실험자: 전경혜, 임주영, 이승일, 이형식, 이지현4. 목적: glycogen을 정제하는 법을 이용하여 동물 간에 있는 glycogen을 분리하고 그 수득률을 계산한다.5. 원리:GlycogenGlycogen은 동물세포에서 탄수화물의 중요한 저장상태로써 polysaccharide이다. 특히 간과 근육에서 많이 발견된다. Glycogen은 glycosidic bond로 연결 되어있는데 glucose가 chain 형태를 가지게 하는 α(1→ 4) linkage와 branch를 가지게 하는 α(1→ 6) linkage로 가지가 많이 달린 중합체이다. 분자량은 *************00으로 알려져 있다. Glycogen synthase는 α- 1, 4 연결만을 촉매한다. 그러므로 glycogen이 가지를 형성하게 하는 α- 1, 6 결합을 만드는데 다른 효소가 필요하다. 가지를 형성하면 수용성이 증가하고 또한 말단 잔기를 많이 형성하게 하여 glycogen phosphorylase와 glycogen synthase의 작용을 많이 받게 된다. 그리하여 가지형성은 glycogen의합성과 분해의 속도를 빨리 하게 하는 역할을 한다. glycogen은 요오드 반응에 의해 발색하여 붉은 색을 띠게 되는데 이것은 요오드가 나선 사슬구조의 타수화물에 갇혀 발색하는 것이다.6. 시약 및 기자재: 얼린 간, 약수저, centrifuge tube, pestle, funnel(class), 20% TCA, 95% EtOH, filter paper7. 방법: 1) mouse를 해부하고 간을 적출, 필요한 간을 나눠서 조별로 분담한다. 2) 냉각된 TCA 수용액을 넣고 얼음 위에서 pestle로 분쇄 3)원심분리 4) supernatant를 새로운 centrifuge tube에 모은다. 5) EtOH를 넣는다. 6)원심분리 7)침전물을 증류수로 녹이고 95%의 EtOH를 넣는다. 8) 원심evel에 따라 간에 저장되어 있는 glycogen이 분해될 수도 있고 합성될 수도 있다. 실험과정을 간단히 보면 먼저 3.02g의 얼려 있는 mouse의 간을 TCA를 넣어주고 pestle로 더욱 잘게 부셔줬다. 먼저 잘게 분쇄한 후에 TCA를 넣어준 이유는 TCA가 단백질을 응고시키는 아세틴산의 일종이기 때문에 먼저 TCA를 넣으면 간이 더욱 질겨져 약수저로 분쇄하기 어려워지기 때문이다. 그런데 pestle로 분쇄할 때 pestle이 너무 커서 내용물이 밖으로 튀었다. 이것이 glycogen의 수득률에 영향을 주었을 가능성이 있었다. 또한 TCA는 인체에 toxic하기 때문에 실험할 때 눈에 튀지 않도록 주의 해야 했다.*간에서의 글리코겐 합성StepsⓐGlucose is converted into glucose-6-phosphate by the action of glucokinase or hexokinase.ⓑGlucose-6-phosphate is converted into glucose-1-phosphate by the action of Phosphoglucomutase, passing through an obligatory intermediate step of glucose-1,6-bisphosphate.ⓒGlucose-1-phosphate is converted into UDP-glucose by the action of Uridyl Transferase (also called UDP-glucose pyrophosphorylase) and pyrophosphate is formed, which is hydrolyzed by pyrophosphatase into 2 molecules of Pi.ⓓGlucose molecules are assembled in a chain by glycogen synthase, which must act on a pre-existing glycogen primer or glycogenin (small protein tidic bond, forming branches, which further grow by addition of more α-1:4 glucosidic units.Control and regulationGlycogenesis responds to hormonal control.One of the main forms of control is the varied phosphorylation of glycogen synthase and glycogen phosphorylase. This is regulated by enzymes under the control of hormonal activity, which is in turn regulated by many factors. As such, there are many different possible effectors when compared to allosteric systems of regulation.EpinephrineGlycogen phosphorylase is activated by phosphorylation, whereas glycogen synthase is inhibited.Glycogen phosphorylase is converted from its less active b form to an active a form by the enzyme phosphorylase kinase. This latter enzyme is itself activated by protein kinase A and deactivated by phosphoprotein phosphatase-1.Protein kinase A itself is activated by the hormone adrenaline. Epinephrine binds to a receptor protein which activates adenylate cyclase. The latter enzyme causes the formation of cycnase control this helps to change the rate of flux in response to energy demand.Epinephrine not only activates glycogen phosphorylase, but also inhibits glycogen synthase. This amplifies the effect of activating glycogen phosphorylase. This inhibition is achieved by a similar mechanism, as protein kinase A acts to phosphorylate the enzyme and this lowers activity. This is known as co-ordinate reciprocal control. Refer to glycolysis for further information of the regulation of glycogenesis.InsulinInsulin has an antagonistic effect to adrenaline. The glycogen synthase enzyme can be kept in a low activation form by insulin, which switches off one of its kinase enzymes ? glycogen synthase kinase 3.Calcium ionsCalcium ions or cyclic AMP (cAMP) act as secondary messengers. This is an example of negative control. The calcium ions activate phosphorylase kinase. This activates glycogen phosphorylase and inhibits glycogen synthase.2) 생체는 어떠한 상황일 대 glycogen을 glucose로 분해하는가?Glycongenolysis stepGlyinto the bloodstream for uptake by other cells.Muscle cells in humans do not possess glucose-6-phosphatase and hence will not release glucose, but instead use the glucose-6-phosphate in glycolysis.간에서 글리코겐의 작용과 혈당 조절탄수화물을 섭취하여 소화시키면 혈당이 증가하고, 이자는 인슐린을 분비한다. 포도당은 간문맥 혈관을 통해 간세포로 들어간다. 인슐린은 간세포에 작용하여 여러 효소들의 작용을 촉진하는데, 이 때 글리코겐 합성 효소도 활성화된다. 이 효소는 포도당을 결합시켜 긴 포도당 사슬을 만든다. 인슐린과 포도당이 충분히 남아 있는 동안 이 작업이 계속된다. 식후 상태에서는 간이 혈액으로부터 포도당을 흡수한다.어느 정도 소화가 되고 혈당이 떨어지기 시작하면, 인슐린의 분비가 줄어들고 글리코겐 합성이 멈춘다. 식사 후 네 시간쯤 지나면 글리코겐은 포도당으로 분해되기 시작한다.글리코겐의 분해에는 글리코겐 인산화효소가 주로 작용한다. 그 다음 8~12시간 동안 혈당의 대부분은 간의 글리코겐을 분해하여 얻으며, 이는 몸 전체의 연료 역할을 한다.글루카곤은 이자에서 분비되는 호르몬으로, 몸의 많은 부분에서 인슐린의 반대 작용을 한다. 혈당이 정상 이하로 떨어지면, 글루카곤의 분비량이 늘어난다. 글루카곤은 인슐린이 많이 존재하는 경우에도 글리코겐의 분해를 촉진한다.근육과 기타 세포에서 글리코겐의 작용근육세포에서, 글리코겐은 긴급히 포도당이 필요할 때 즉시 포도당을 공급하는 역할을 한다. 기타 세포들도 조금씩 글리코겐을 저장하고 사용한다. 근육세포에는 포도당육인산화효소(글루코오스-6-포스파타아제)가 없어 포도당을 혈액으로 운반할 수 없다. 따라서, 간세포와는 달리, 근육 내부에 저장된 글리코겐은 근육세포에서만 소모된다.3) 이 실험에서 사용한 TCA solution과 95% ethanol의 역할을 실험 원리에 된다.
생화학에서의 원심분리의 정의와 응용
