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[생명공학실험]생물 반응기 조작 및 멸균

1. 실험목적미생물 배양 실험에 있어서 미생물을 대량으로 배양하기 위해 또는 배양환경인자의 영향을 고찰하기 위해 사용되는 생물반응기의 조작과 멸균 요령에 대하여 알아본다.2. 실험원리(1) 생물반응기(bioreactor)의 정의생물반응기는 특정 물질이나 세포를 생산하기 위해 또는 특정 반응을 수행하기 위해, 생물체를 조 절된 환경 하에서 키울 수 있도록 만든 용기의 총칭이다.생물반응기는 발효기라고도 불리나, 엄격한 발효의 의미는 미생물의 혐기적 배양을 말하므로, 대부 분의 배양이 호기성임을 감안하여 생물 반응기라는 용어가 보편적으로 쓰이고 있다. 따라서 적당한 생물반응기의 선택을 위해서는 키우려는 생물체 및 원하는 생산물의 생물학적, 생화학적인 특성, 물리 화학적 성질뿐만 아니라 이들 특성에 따른 전체 공정의 설계와 생산물의 판매전략 등까지 고려되어야 한다. 즉, 최종생산물의 경제성(결국 경쟁력)을 좌우하는 최적생산조건은, 앞에 나열한 모든 조건들이 상호 보완적으로 작용할 수 있는 적당한 반응기의 신중한 선택이 없이는 얻어질 수 없다. 생물반응기 설계에 중요한 요소들은 각 경우에 따라 다르지만, 먼저 최적 세포 농도, 비생산속도 및 생산율, 비증 식속도, 비산소소비속도와 비발열율 등에 대한 정보가 필수적이다. 이들 정보를 기초로 필요한 물질전 달속도와 열전달속도를 구할 수 있고, 이들과 앞에 언급한 생물 생화학적 특성 등에서 적당한 생물반 응기의 형태를 찾아 규모 확대 등을 통하여 최적 생물반응기의 종류와 크기를 설정할 수 있다.(2) 생물반응기의 역사인류가 미생물의 발효능력을 이용한 역사는 수천 년에 이른다. 기원전 6000년경 수머 사람들의 양 조가 그 시작이라 추측된다. 기원전 4000년경 이집트 사람들은 양조기술과 효모를 이용한 제빵 기술 을 가지고 있었으며, cheese와 yogurt 등의 유가공 제품도 오랜 역사를 갖는다. 기원후14년경 중국 에서 발효액의 증류공정이 개발되면서 독한 술이 개발되었다 제 1차 세계대전 동안, 영국의 Weismann등은m yeast by Buchner (zymase) first sewage plants in Germany and Franceproduction of food and fodder yeast in GermanyWeizmann process for the production of butanol and acetonesulphite process for producing glycerolmanufacture of citric acid (surface process)first large-scale aerobic fermenters (for yeast production)patent on steam sterilization process (Stauch and Schmidt)microbial transformationstricarboxylic acid (TCA) cycle (or citric acid cycle/Krebs cycle) beginning of penicillin productionsubmerged process for production of acetic aciddiscovery of other antibioticsDNA structure identification (Watson and Crick)production of glutamic acidsubmerged production of citric aciddevelopment of single cell proteinproduction of xanthan gumuse of immobilized enzymes for high-fructose syrupproduction of monoclonal antibodiesgrowth of genetically engineered organisms6000-2000 BC pre-3000 BC 4000 BCAD 14about 1680 *************88118971900 1914-1916 1915-1916 1915-1916 about 1920 about 1930 19341서 반응이나 조건을 탐지할 수 있는 기술의 발달도 매우 중요- 환경요소의 조절에 필수 (sensors, instrumentation, control 등)- pH, 온도, DO, CO2 등은 on-line 측정이 가능- DNA, RNA, protein, enzyme, biomass 등 생물학적 변수가 off-line 분석에 의존→ 수 시간에서 수일의 시간이 걸려 생물공정의 제어에 실시간 이용이 불가능(4) 생물반응기의 종류① 연속교반식 생물반응기 (CSTR: continuously stirred tank reactor- 기/액상의 물질전달과 열전달이 원활하고, 적당한 혼합에 최적- 새로운 생물반응기는 많이 개발되었으나, 지난 40년간 꾸준히 사용되어, 가장 흔함② 공기부양식 생물반응기 (ALR: air-lift loop bioreactor)- 교반대신 기계적/공기유압식 pumping에 의한 혼합③ 혐기성 생물반응기 (anaerobic bioreactor)- 하수/폐수의 처리에 오랫동안 사용- 산소가 없는 조건에서 미생물에 의한 유기물의 분해→ CH4, CO2, biomass 생성④ 발효기(fermenter)발효공정 생산물의 종류 이를테면 아미노산, 핵산, 항생물질, 효소, 알코올 등에 따라서 다소의 차 이는 있으나 기본적으로는 모두 같고 주요장치는 주 발효기와 종 발효기로 구성되어 있다. 이들의 발효기는 부속된 원료의 조제, 증자, 살균, 냉각설비, 통기용 공기의 압축, 제균 설비, 교반기 등을 가지고 있다. 종 발효기는 주 발효기에서 미생물을 배양하는데 필요한 균체 량을 획득하기 위한 것 이며 주 발효기는 목적 생산물을 취득하기 위한 것이다. 발효기의 가장 중요한 기능은 미생물에 그 생육에 필요한 환경을 주어서 바람직스러운 미생물을 증식시켜서 목적 생산물을 얻는 것이다.따라서 발효기의 설계와 제작에는 많은 배려가 필요한데, 특히 탱크는 며칠간이라도 무균성을 유 지하면서 운전할 수 있고 장기간의 운전에 견딜 수 있어야 한다. 또한 미생물의 대사에 따라서 그것 을 패들(paddle) 임펠러는 높은 전단민감성을 가지는 세포 계에 있어 관심을 끌고 있다.③ 배플(baffles)배플은 발효조 벽에 난류의 이동을 일으켜서 혼합과 기체분산을 증가시킨다. 일반적으로 발효조 지름의 1:10 또는 1:12의 너비를 가진 4개의 배플이 설치되어 있다.④ 거품분리기(foam separators)거품은 발효기에서 유출되면 여과기를 적셔서 압력강하를 증가시키고 기체흐름을 감소시켜서 오염 세포가 발효기로 들어오는 통로를 제공하는 문제가 된다. 거품을 제거하는 화학제가 발효를 저해하는 효과가 있기 때문에 항상 사용될 수는 없다. 멸균된 공간에서 거품을 기계적인 방법으로 파괴할 수 있는 몇 가지 장치가 ㅇㅆ으니 가장 간단한 장치는 교반기위에 갈퀴를 고정시키는 것이다.⑤ 반응기(reactor)실험규모의 발효기는 반응기의 멸균과 발효액의 부식성 또는 마모성 때문에 유리 용기에 스테인리스 스틸 덮개판을 주로 사용한다. 대부분의 발효기는 높이 대 지름의 비가 2:3 으로 제작된다.(5) 생물반응기의 상업적 이용① 세포 자체 (또는 생물량)를 생산② 세포를 이용하여 효소나 대사물을 생산 (세포내부 또는 외부에 축적)③ 세포를 이용하여 전구체를 원하는 산물로 바꾸는 경우 (생물변환)< 생물공정의 응용분야 >Industrial SectorsExamples of Products and ServicesEstimated Market by the year 2000chemicalsethanol, acetone, butanolorganic acids (citric, itaconic)enzymes (detergents etc.)perfumeries, polymers (gums, agars)$13.5Bpharmaceuticalsantibiotics, monoclonal antibodies, vaccinesdiagnostics, hormones, blood factorsenzymes, enzyme inhibitors, enzyme sensors steroids (compl응기는 약 10%에 불과하다. 이런 무균성 생물반응기는 항생제 등의 고부가가치 산물에만 이용되고 있는 실정이다. CSTR이 표준 생물반응기라지만, 거의 모든 배양의 특성이 각각 다르므로 실제 이용되는 생물반응기 들은 모두 다르다고 볼 수 있다. 표 1.3.에 각 균주별 특성을 나타내었다.< 생물반응기에서의 생물체와 배양의 종류 >Culture TypeSpecial Characteristicsbacteriamay be highly aerobic, or thermophilicyeastmay be highly aerobicfungican be mycelial, producing highly viscous culturesStreptomycesmycelial in nature, which produces viscous culturesalgaeoften require light for growthanimal cells insect cells fish cells plant cellsslow-growing, delicate, often anchorage-dependent and with specific medium requirements3. 실험방법준비 및 멸균배양조 내부를 깨끗이 세척한 후, 위 뚜껑을 닫아 고정시키고, 공기 출입구이외는 밀폐시킨다. 조제 한 배지를 jar 내에 넣고, 공기 출입구에 솜마개를 해서, autoclave에 넣은 후, 121℃에서 15분간 멸 균한다.1) 주입구 또는 상판을 제거하여 용기에 배양액을 채운다.2) pH probe, DO probe의 zero를 맞춘다.3) 각 probe를 용기 상판에 있는 용구에 삽입하고 조인다. 이 때 삽입 시 전극의 끝이 상하지 않도 록 조심한다.4) Thermometer를 thermo-well로부터 분리한다.5) pH probe, DO probe의 연결부를 제거하고 호일로 감싼다.6) Air filter가 젖지 않게 호일로 잘 감싼다.7) Acid, alkali, anti-foam line의 끝을 호일로 감싸거넣는다.

공학/기술| 2006.01.12| 11페이지| 1,500원| 조회(1,202)

멸균, 생물반응기, fermenter, bioreactor, stirred ta..

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[생명공학실험]냉동 건조 조건이 생균에 미치는 영향 및 균주 보관방법과 세포 활성 평가A+최고예요

1. 실험목적목적하는 산물을 생산하거나 목적하는 특성을 가진 균주를 자연계에서 분리하거나, 균주 기탁기관에 서 구입하거나, 연구소 또는 기업체에서 구입하거나 전임자의 냉장고에서 발견하거나 하면 제일 먼저 무엇을 해야 할 것인가? 어렵게 구한 균주를 이용하여 열심히 연구를 하였는데 연구가 완료되거나 산 업화가 계획되었는데 예전의 균주와 매우 다르다는 것을 발견하면 얼마나 당황하게 될까? 또 어렵게 구한 균주 또는 오랜 기간에 걸쳐 개발된 우수 균주가 부주의 또는 과실로 사멸되었다면 얼마나 당황 하게 될까? 어쩌면 지구상에서 그 종이 다시 발견되기는 매우 어려울 것이다. 각종 실험의 결과가 잘 되어 목적 산물의 생산성이 올라가거나, 배양 특성이 개선되어 원가 절감이 이루어졌다고 생각되었는 데 원인도 없이 생산성이 저하되어 가거나, 매 batch마다 큰 폭의 생산성 변동이 나타나면 산업화는 이미 어려운 상태가 된다.따라서 자연계에서 탐색, 분리된 균주가 산업적인 균주로 활용되기 위해서는 실험실내에서도 다시 우수 균주의 탐색 및 분리가 진행되어야 하고, 적당한 보존과 배양을 통하여 그 순계성이 보전되어야 한다. 이러한 점에서 보존, 배양의 기본적인 원리와 방법이 균주 탐색, 분리 단계와 일치하는 점이 많 고 산업 현장에서도 그 균주의 탐색, 분리 역사를 참고하는 것이 중요하다고 할 수 있다. 또 우량 균주 인 산업균주는 유전적으로 열성 형질이라는 점 때문에 보존과 배양법이 중요하다. 즉 쉽게 형질이 사 라지기도 하고, 몇 세대 후에 다시 나타나는 불안정성을 나타내기도 하기 때문이다. 이 때문에 현재 균 주의 보관 방법 중 가장 많이 이용하고 있는 것이 동결건조방법이다. 이번 실험에서는 동결건조 시 미 생물 생존에 미치는 영향인자(미생물 성숙도, 미생물 농도, 보호제 조성 및 보호제 종류)에 따른 영향 을 검토하여 미생물 동결건조 전후의 생존도(viability)를 연구한다.2. 실험원리(1) 균주의 보존미생물은 부적당한 환경에 두고 장기간 보존하면 그 성질이 변하거나ony)를 발생, 분리, 계대하여 순계를 유지하는 것이 중요하다. 다음에는 저온 등에 보존하면서 고유의 형질을 보전하도록 하는 것이 중요하다. 생장에 필요한 DNA 복제 시 mismatch가 일어날 확률은 약 10-6∼10-8이다. 확률은 낮지만 지속적인 계대과 정에서 우성인 돌연변이주가 전체 집단을 이루게 되면 이미 균주는 없어진 상태로 보아야 한다. 보존 과정에서 저온 보존, 동결 보존 또는 동결건조보존인 경우에는 동결보호제(cryoprotective agent)를 첨가하여 생존율(viability)을 높여 주어야 한다.따라서 방선균 보존을 위한 연구 내용 또는 주지할 내용은 열거하면 다음과 같다.㉠ 균주 관리 대장을 반드시 작성한다. 컴퓨터를 이용하여 데이터베이스화하는 것도 좋다. 균주의 명칭, 구입 날짜, 형태학적 특성, 생리적 특성, 돌연변이 유도제, 분리 일자, 분리 시 특성, 계대수(generation), 보존상태 별, 제조일자, 제조자 등이 표시되어야 한다.㉡ 보존용 균주 제조 작업 지침서를 작성한다. 균주의 배양 방법, 배지 조성, 수확 방법, 균체 농도 등을 명시한다.㉢ 동결 시 동결보호제의 종류, 농도, 살균 방법을 정한다.㉣ 보존 조건 및 안전성을 확인한다. 수시로 보관 설비의 온도, 시건 장치, 재고 등을 확인하고 각각에 대한 경보 장치를 수시로 확인한다.㉤ 일정한 기간별로 생존율과 안정성을 확인하는 계획을 세우고 주기적으로 확인한다.㉥ 순계 균주의 특성(marker)을 정하고, 그것이 만약 생리적 특성이라면, 선택 압력(selection pressure)의 농도, 첨가 방법 등을 정한다.이상과 같은 방법으로 균주를 보존 관리를 하면 연구와 생산에 큰 기여를 할 수 있지만, 규모가 큰 연구실의 경우에는 별도의 관리 인력이 필요할 것이다.(3) 균주 보관의 방법의 종류1) 단기보존법: 계대배양(subculturing), 광유(mineral oil) 침지보존법, 동결보존법(freezing), 건조 보존법(drying)2) 장기보존법: 동결건(2)의 수분 포집부에 연결된 도관에 앰플을 하나하나 장착하는 다기부 (manifold)식과 다수의 앰플을 내압용기 내에서 건조하는 chamber식으로 구분한다. 수분포집은 cold trap 또는 건조제(P2O5, CaSO4 등)를 사용하여 행한다. 진공펌프에는 회전식 진공펌프(도달진공도 1∼ 10μHg)와 유확산식 진공펌프(도달진공도 0.1∼ 0.01μHg)가 있다.< 동결건조법 >A.진공측정계; B.진공펌프; C.동결건조기 용기; D.동결 trap;E. 이중용기 뚜껑; F. 이중용기; G.동결건조앰플2) 분산매분산매는 보통 고분자 물질과 저분자 물질을 섞어서 만든다. 고분자 물질 또는 이를 함유하는 것으 로는 혈청, skim milk, 전분, dextran, polyvinylpyrrolidone(PVP) 등이며 저분자 물질로는 dextrose, sucrose, 유당, meso-inositol 당이나 glutamic acid - Na 등의 아미노산이 이용된다. 고분자 물질 중 에서 널리 사용되는 것은 혈청과 skin milk로서 혈청은 여과멸균 후 무균을 확인한 냉장실에서 보관한 다(1∼2년 보존가능). skin milk를 이용할 때는 분산매를 시험관에 소량 분주하여 증기멸균(116℃, 20 분간) 후 30℃에서 2∼3일 배양하여 무균을 확인한 후 사용한다. 이 때 멸균이 완전하지 못하면 기포 가 생기며 멸균조건이 너무 강하면 갈색으로 변하여 보존성적이 좋지 못하게 된다. 혈청을 이용할 때 는 시판조직 배양용 혈청을 이용하는 것이 편리하며 여과멸균한다. 보존성은 혈청이 좋다.분산매에 저분자 물질로 첨가되는 당(5∼10%) 또는 glutamic acid-Na(5%)는 건조시료와 수분함량 이 과도하게 저하되지 않게 수분 완충제로서 작용한다. 동결건조시료의 보존온도가 높은 경우에는 carbonyl 기를 가지고 있지 않은 당을 이용하는 것이 좋다. 동결조건에 이용되는 분산매는 다음 표와 같다.< 미생물의 동결건조에 사용하는 분산모의 조성 >동결보호제 멸균시에는 ca의 종류에 따라 국부적인 염증이 생기므로 주의할 필요가 있다. 병원균을 분주할 때는 사용하지 않는다. 분주량은 앰플 이 커도 0.05∼0.2㎖이면 충분하다. 세포농도가 높은 편이 미생물의 생존율이 높다(특히 그람 음성세 균일 경우).5) 예비동결세포현탁액은 공결점 이하에서 동결한다. 통상 시료를 넣은 앰플을 -30∼-79℃의 한제속에 넣어 행 한다. 한제는 dry ice를 잘게 부숴 메틸세로솔로블, 에틸세로솔로블, 95% 에탄올 또는 아세톤과 혼합 하여 만든다.세균은 보통 상기의 방법에 의해 급속동결하지만 효모는 온도제어동결장치에서 -35℃까지 1℃/분의 완만동결을 한다.6) 건조건조는 승화에 의해 수분을 제거하는 1차 건조와 증발된 수분을 제거하는 2차 건조의 두 단계로 나 눈다. 1차 건조중의 온도는 원칙적으로 사용하는 분산매의 공결점 이하에서 보존한다. 한편 다기관식 동결장치는 앰플을 한제에 담그거나, 1차 건조를 행하지 않고 예비동결 후 앰플을 다기관에 장착하여 외기에 노출된 상태로 행하는 방법이 있다. 이 때 앰플에 솜 마개를 하여 그대로 1차 건조를 하면 앰 플 내의 진공도가 부족하여 건조 중 시료가 용해되는 경우가 있다. 또한 chamber식 동결건조기에 의 한 방법에서 건조를 촉진시키기 위해 가온을 하는 경우가 있지만 절대로 시료가 녹아서는 안 된다.7) 수분함량수분이 1∼3%일 때는 일반적으로 보존에 큰 영향을 주지 않지만 5% 이상이 되면 보존온도가 높을 때 생존율이 저하된다.8) 용봉앰플의 용봉에는 burner가 이용된다. 용봉 시 불꽃에 국부적으로 모이면 앰플내의 음압 때문에 구멍 이 생기므로 균일하게 화염을 가한다. 유리가 부드럽게 되면 앰플을 가볍게 잡아당겨 용봉한 후 용봉 부위가 약한 불꽃에 닿게 한다. 불꽃이 강하면 용봉 부위가 찌그러지며 방냉 후 또는 보존 중에 금이 생긴다.Pyrex제 유리는 강한 불꽃을 이용하여도 용봉의 실패는 거의 없다. 일반적으로 진공도 10∼100μHg 의 범위에서 용봉하지만 낮을수록 좋다. 앰플에 솜 마조균의 복원복원 시 앰플을 끊으면 급격히 공기가 앰플 속으로 들어가 건조균이 공중에 비산되거나, 공기중의 균에 의해 오염되는 위험이 있다. 그러므로 앰플을 줄로 홈을 만들고 70% 알코올로 멸균된 가제로 앰 플을 감싸서 끊어대거나, 줄로 홈을 낸 부분에 적열된 유리봉의 선단을 가볍게 접촉시켜 틈새를 만들 어 그 사이로 공기가 서서히 들어가기를 기다린 후 끊는다. 솜 마개가 된 앰플은 마개 부위를 끊으면 공기가 솜 사이로 들어가므로 오염의 위험을 방지할 수 있다.앰플 내의 소량의 배양액, 또는 적당한 복수액(0.3∼0.5㎖)을 서서히 가해 건조 균체를 잘 용해시켜 액체배지에 접종한다. 동시에 한천평판에 도말시켜 오염의 유무와 콜로니 형상을 확인하는 것이 좋다. 동결 건조균은 세포상해를 입을 수 있으므로 한천배지에서 생육이 되지 않는 경우가 있다. 이때는 액 체배양에서 생육된 균을 한천평판에 다시 숙주하여 배양한다.12) 적용 미생물사상균, 효모, 세균, 방선균과 phage에 적용된다. 사상균 중 단단하고 작은 포자를 형성하는 것에 이 용되지만 Entromophthorales에 속하는 것은 부적당하다.효모 중에서 Erettanomyces, Saccharomyces, Endomycopsis, Schizosaccharomyces 등은 동결건 조하면 생존율이 낮아진다. 세균은 그람음성균에 감수성균이 많다. 그 외 동결건조에 부적당한 균은 액 체질소에 의한 동결건조나 L - 건조를 이용한다.보존기간은 수년부터 30 수년이 있지만 생존 균수의 시기적 변화에서 계산하면 Micrococcus는 수 천년동안 생존할 수 있다는 보고가 있다.(5) L - 건조L - 건조는 소량의 세포현탁액을 진공 하에서 수분을 급속히 증발시키는 보존법이다. 수분의 증발을 촉진하기 위해 다공질의 담체에 가해서 증발표면적을 넓혀 하기도 한다. 장치는 동결건조장치를 사용 하며 조작방법도 동결건조법에 준하여 실시한다.이 방법은 동결건조법과 동일한 특징인 장기보존법으로 이용되고 있지만 이 건조법은 동결건조.

공학/기술| 2006.01.12| 9페이지| 1,000원| 조회(842)

분산매, 냉동 건조, 동결건조법, 균주 보관, 세포 활성

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[생명공학실험]분자생물학 기초실험2

1. 실험일자: 2005년 9월 23일2. 실험제목: 분자생물학 기초실험 23. 실험목적: 이번 실험을 통하여 박테리아에서 plasmid DNA를 뽑아낼 수 있고 PCR을 이용하여 DNA를 증폭한 후 제한효소를 사용하여 DNA를 절단한다. 이를 Mini Gel Unit를 이용하 여 gel electrophoresis를 통해 DNA를 분리하는 방법을 배운다. 또한 DNA추출과 전기 영동에 이용된 시약의 특성을 이해하고 클로닝에 이용되는 plasmid의 특성 및 제한효소 의 기능을 이해한다. Plasmid DNA를 이용하여 미생물 형질변환을 한 후 미생물 형질변 환체 선별하는 기술까지 분자생물학을 공부하는데 필수적인 실험 기술을 습득한다.4. 실험원리(1) PCR 이란Polymerase chain reaction(PCR)은 1983년 Mullis와 Faloona가 처음으로 개발한 시 험관에서의 DNA 증폭 방법으로, PCR은 DNA 중합효소에 의한 DNA 복제 특징을 이용 한 것이다. 즉, DNA의 열에 대한 특성과 고열에 내성을 가진 DNA polymerase를 응용 하여 DNA의 특정부분을 필요한 양만큼 복제하는 기술로 수백 ~ 3kb의 길이를 복제할 때 주로 사용한다.유전자를 분석하고 연구하는데 있어서 가장 큰 문제점은 복잡한 전체 genome중에 연 구하고자 하는 유전자가 희귀하다는 것인데, PCR은 특정 DNA Sequence의 copy수를 기 하급수적으로 증폭시키는 것이 가능하여, 유전자 클로닝을 포함한 분자유전학, 의학생물 학, 집단유전학 등 생명과학의 전 분야에 혁신을 일으켰다.특히 PCR에 사용하는 DNA 중합효소인 Taq polymerase는 고온의 온천수(72-74℃)에 서 서식하는 미생물에서 분리한 것으로 72℃에서 활성이 가장 높으며 95℃ 이상의 고온 에서도 매우 안정하여 PCR을 자동화시키는데 결정적인 역할을 하였다.(2) PCR의 원리PCR 반응은 변성(denaturation), 가열냉각(annealing), 신장(extension) 또는 중합 (polymerization)의 3단계로 구성되어 있다. 그러나 세부적으로 Pre-denaturation, Denaturation, Annealing, Extension, Final extension, Store로 나눌 수 있다. 그리고 이론적으로 한 가닥의 주형으로 30회 cycle을 수행하면 230의 DNA 가닥을 얻을 수 있 게 된다.< PCR 의 반응 개요 >① Pre-denaturation93°C ~ 95°C로 보통 약 5분간 가열하는 과정으로 DNA는 이 정도의 열에서 일정속 도로 외가닥으로 분리가 된다. 2번 과정보다 시간이 긴 이유는 원본 template의 길이가 새로이 생성되는 DNA의 길이에 비해 훨씬 길기 때문이다. 다음 단계부터는 새로 만들 어진 DNA들이 template로 사용되게 되며 상대적으로 원본 template보다 짧다.② Denaturation보통 93°C ~ 95°C로 30초에서 40초 정도이며, 쌍가닥 DNA가 외가닥으로 분리된다. 이때 변성 온도가 필요 이상으로 높거나 가열 시간이 길어지게 되면 Taq polymerase 의 활성을 감소시키게 된다.③ AnnealingAnnealing 온도는 실험 경험적으로 정하게 되나, 일반적으로 45°C ~ 60°C 에서 30 ~ 50초 정도 반응시킨다. 그러나 primer의 염기서열, 길이, melting point(TM)에 따라 조정해야 한다. 보통 primer의 TM보다 5°C정도 아래에서 시작하며 온도를 낮출수록 결 합성이 강해지나, 차이가 있는 비슷한 염기서열에서 잘못 결합한 가능성도 아울러 커진 다.Annealing Temperature 계산 (primer의 염기로 계산) : Tm(°C) = 4(G+C) + 2(A+T)④ Extension72°C ~ 74°C정도에서 30 ~ 60초간 반응시킨다. Taq polymerase의 경우 72℃에서 1초당 약 60개의 염기를 중합시키기 때문에 1 kb까지는 45초 정도면 충분하지만, cycle이 진행됨에 따라 조금씩 extension time을 늘려주는 것도 보다 많은 양의 산물을 얻는 방법이다.⑤ Final extension4번 과정에서 합성이 덜 일어난 DNA가닥들의 합성을 마무리하는 단계이다.⑥ Store모든 과정이 끝나고 합성된 DNA를 안정적으로 보존하는 단계로 필요할 때 끝내면 된 다.일반적인 PCR 반응액 조성온도주형 DNA(100-500ng)Pre-denaturation Temp.기질(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 각각 0.2mMDenaturation Temp.primer (20 pmol)Annealing Temp.Mg2+(일반적으로 1.5mM)Extension Temp.Taq DNA 중합효소(2.5U)Final extension Temp.up to ddH2O(3) 용어 설명① Primer setPrimer set은 forward/reverse primer라고도 부르는데 이는 DNA의 방향성과 관련이 있는 용어이다. primer set은 원하는 target region의 상보적 strand의 각 5’부위의 끝 에 있는 수십 base pairs 정도의 sequences대로 인위적으로 합성한 oligonucleotides라 고 할 수 있다. 중요한 point는 상보적이라는 것과 3' end 에서부터 Taq polymerase가 작용해 새로운 strand를 합성해 나가기 시작한다는 것이다.② dNTPsdNTPs는 nucleic acids (DNA, RNA)를 구성하는 LEGO block 같은 것이라 할 수 있 다. 중요한 것은 hydrogen bond가 3개인 GC 결합이 2개인 AT 결합보다 안정적이라는 것과 dNTPs는 단순한 building block의 역할을 하는 것뿐만 아니라 polymerase가 nucleic acids를 합성해 나가는데 필요한 energy를 제공하는 역할도 한다는 것이다.③ Taq polymeraseTaq polymerase는 일반적으로 thermostable 혹은 heat-stable polymerase를 의미 하나 원래는 그 기원이 Thermus aquaticus 라는 미생물에서 유래한 polymerase를 지 칭하는 용어이다. 이 enzyme은 5’→3’ polymerization-dependent exonuclease activity를 가지고 있고 60bps/sec이 속도로 DNA를 합성해 나간다.(4) PCR의 응용분야- 유전자 지도의 작성, Human Genome Project(인간 유전체 연구)에서 염기 서열 분석 에 이용된다.- 멸종된 과거 생물이나 현존 생물의 상호 유연관계를 규명하는 유전적 구성을 분석하 는 진화 생물학에 이용된다.- 친자확인, 범인 식별 등 Genetic Finger Printing(유전적 지문 채취)을 이용한 법의학 분야에 활용된다.- 돌연변이분석, 유전병진단, cDNA 합성 등에 이용된다.- 세포로부터 한 특정 DNA 조각을 직접 cloning하는데 쓰인다.- 바이러스나 각종 병원균 검출 초기식별에 사용된다.(5) Mini Gel ElectrophoresisDNA gel 전기영동 방법은 DNA를 크기에 따라서 분리하는 방법으로 간단한 장치를 이 용한다. DNA는 backbone의 phosphate group 때문에 음전하를 띠므로, 매질을 타고 양 전하 방향으로 움직이게 된다. 이때 DNA분자가 gel matrix 사이를 통과하는 속도는 분 자량이 커질수록 늦어지며 gel matrix가 치밀할수록(gel%가 높을수록) 늦어진다. 또한 DNA의 분자량이 같더라도 구조에 따라서 움직이는 속도가 다르다. 예를 들면 supercoil 된 DNA는 Linear DNA 보다 빠르게 움직인다.그리고 Electrophoresis에 쓰이는 Gel의 재료는 agarose나 polyacrylamide가 흔히 쓰 이며 분리하고자 하는 DNA의 크기에 따라서 선택한다. Agarose gel은 100bp이상 20Kb 까지의 DNA를 분리하는데 사용되며 polyacrylamide gel은 1Kb 이하 크기의 DNA를 분 리하는데 쓰인다.전기영동장치는 전극이 달린 아크릴 탱크를 사용하며 전기영동 tank와 gel은 동일한 전 기영동 완충액을 사용해야 한다. 이온강도 또는 pH에 약간의 차이만 있어도 DNA 조각의 이동속도에 크게 영향을 주기 때문이다.(6) BufferDNA gel 전기영동에는 세 가지 완충액이 흔히 쓰인다. 보통 농축액인 저장용액(stock solution)으로 만들어 놓고 사용한다. Tris-acetate buffer는 주로 DNA 분자량이 큰 경우와 agarose electrophoresis에서 쓴다. 이것은 resolution은 좋으나 Capacity가 적으 므로 양극과 음극의 Buffer를 순환시키는 것이 좋으며, 전기영동 하는 중간 중간에 피펫 을 사용하여 몇 번 섞어 주어도 된다. Tris-borate와 Tris-phosphate는 capacity가 충분 하며 resolution도 좋다.(7) Gel loading bufferDNA 전기영동 시 쓰이는 gel Loading buffer는 sample이 뜨는 것을 막기 위하여 glycerol, sucrose 또는 ficoll을 포함하고 있다. 보통 5배 또는 10배의 농축액으로 만들 어 사용하며 2~3배 높은 정도가 되어도 아무 지장이 없다.Tracking dye로는 Bromophenol blue와 xylene cyanol을 사용한다. 또한 DNA 전기영동이 흔히 제한효소 반응 후에 시행되므로 제한효소의 반응을 중지시키기 위하여 10mM EDTA을 함유하는 것이 편리하다.(8) DNA의 가시화(Visualization)Ethidium bromide(Etbr)는 평면적인 분자구조를 가지고 있는 물질로 DNA의 base 사 이에 끼어들며 (intercalation), 이때 형광이 free ethidium bromide에 비하여 크게 증가 한다. 그러므로 gel을 ethidium bromide 용액 속에서 station 시킨 후 UV-lamp 아래서 DNA band를 쉽게 관찰할 수 있다.

공학/기술| 2006.01.12| 5페이지| 1,500원| 조회(472)

PCR, Buffer, taq polymerase, Ethidium bromi..

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[생명공학실험]SDS-PAGE에 의한 단백질 전기영동 평가B괜찮아요

1. 실험날짜: 2005년 10월 7일2. 실험제목: SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)에 의한 단백질 전기 영동3. 실험목적: SDS-PAGE를 이용한 단백질 전기영동으로 단백질을 분리하고 미지 분자량을 측정해본다.4. 실험원리(1) 단백질 전기영동단백질은 아미노산이 길게 연결되어 있는 고분자 물질이다. 각각의 아미노산의 종류와 배열 순서에 따라 그 기능이 정해진다. 단백질은 선형의 일차 구조에서 다른 여러 수소결합, 소수성 결합 등에 의 해서 입체적인 구조를 가지게 된다.< 단백질 3차 구조에 영향을 미치는 결합종류 >단백질 전기영동(electrophoresis)은 단백질분자의 전하를 이용한 분리, 분석법이다. 단백질 분자는 보통 등전점 이외의 pH에서는 양 또는 음의 전하를 가지고 있어서 일정한 pH의 완충액 중에서 직류 전류를 가하면 양극 또는 음극방향으로 이동한다. 전기영동의 원리는 단백질의 길이에 의존한다. 단백 질의 3차 구조를 깨고 선형으로 만들어서 단백질의 charge에 의해 한쪽 전극 방향으로 끌리게 만든 다. 즉 단백질 분자의 전하량, 분자의 크기에 따라 이동하는 속도가 다른 점을 이용하여 분리, 분석하 는 것이다. 단백질을 여과지, 전분이나 agarose와 같은 다당류 gel, polyacrylamide gel 등과 같은 것을 담체로 하여 전기영동 하면 단백질은 band를 형성하여 분리되므로 분리, 분석조작이 간단하게 된다. 또한 모든 단백질들은 구성하고 있는 amino acid에 따라 질량과 pI (isoelectric point)값이 다 르다. 따라서 이 두 요인을 이용하여 단백질을 분리할 수 있다. pI를 이용하여 단백질을 펼치는 방법 을 IEF (isoelectric focusing)라고 하며 질량에 의해서 단백질을 펼치는 방법을 SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) 라고 한다.(2) SDS (S 다리결합을 환원시키는 2-mercaptoethanol에 의하여 촉진된다. SDS가 단백질과 결합 하여 단백질 복합체가 되면 단백질이 지니는 음전하는 SDS가 가진 음이온에 기인되는 것이 대부분이 다. 중성 pH에서는 단백질 자체의 전하가 극소화되기 때문에 이 경우에는 단백질이 띠게 되는 음전하 는 단백질에 결합한 SDS에서 오는 음전하뿐이다. 종류가 다른 모든 단백질에 대하여 SDS는 단위 무 게 당 일정한 양(1.4g SDS/ g 단백질)이 결합하므로 SDS-단백질 복합체는 질량에 대한 전하의 비가 일정하게 된다. 또한 SDS-단백질 복합체는 모두 불규칙한 코일구조를 가지게 있으므로 마찰계수도 동일하다. 그러므로 SDS-단백질 복합체의 전기이동 속도는 겔의 체 효과에 의해서만 좌우되며, SDS-단백질 복합체의 크기가 클수록 확산계수가 작아서 이동속도가 작아지게 된다.즉,① 모든 단백질은 일차구조를 유지한다.② 모든 단백질은 negative charge를 띤다. 그래서 그 단백질들을 전기영동하면 (+)전극을 향 해 이동하게 된다.< SDS 분자 구조 >< SDS 처리 전과 후 >(3) SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)일반적으로 단백질을 분리하는 것은 단백질이 가진 2가지 특징, 다시 말하면 전하와 분자량의 차이 를 이차원 전기영동은 통상 1차원적으로 등전점 전기영동(Iso Electric Focusing : IEF)을 하고, 단 백질을 등전점으로 분리해서 다시 2차원적으로 SDS-전기영동(SDS-PAGE)으로 등전점이 같은 단백 질을 분자량을 기준으로 분리하는 방법이다. 이 방법은 최초 O Farell이 고안하였지만 지금은 1 차원에서 높은 재현성을 얻을 수 있는 고정화 pH 구배(immobilized pH gradient : IPG) gel을 사용 하므로 고도의 기술적 숙련도를 필요로 하지 않는다.※ SDS-PAGE의 장점 ※1. 단백질을 분리할 수 있을 뿐 아니라 눈으로 확인할 수 있다.2. Poly하여 그들의 이동속도를 예상하는 것은 간단하지가 않다. 따라서 단백질의 순도의 분석 및 분자량의 결정을 위한 전기영동 은 음이온 세제인 sodium dodecyl sulfate(SDS)와 disulfide bond(S-S bond)를 끊는 2-mecaptoethanol 을 단백질 용질에 첨가해 줌으로써 가능하다. 이와 같이 SDS를 이용한 전기영 동은 질량(분자량)의 크기에 따라 큰 폴리펩티드는 늦게 이동하고 작은 폴리펩티드는 빨리 이동되 는 영동 상을 볼 수 있는 것이다. 그러므로 단백질의 분리과정을 확인해 볼 수 있을 뿐만 아니라, 이들 단백질의 이동도가 각 분자량의 대수 값에 비례하므로 분자량을 이미 알고 있는 표식단백질과 비교하여 분자량을 산출해 낼 수 있다. 다양한 pH 범위를 가진 IPG가 다수 시판되고 있지만(예를 들면, pH3~10, 4~5, 5~8등) 시료 속에 함유된 단백질의 분별이 어려운 경우는 우선 pH3~10와 같이 넓은 pH 범위로 전기영동을 한 후, 목적 단백질이 검출되는 영역의 pH 구배가 넓게 되는 IPG를 선택하는 것이 좋다.2) 2차원 SDS-PAGE비슷한 분자량의 다른 단백질은 1차원 SDS-PAGE만으로는 효과적으로 분리될 수 없다. 2차원 SDS-PAGE는 고분리능을 기지고 있는데 이것은 특정 단백질이 가지는 고유의 등전점에 따라 분리 를 한 후(IEF: isoelectric focusing), 분자량에 따라(SDS-PAGE) 또 분리하는 것이다. 이 때 각 2 차원 전기영동의 패턴을 화상처리하거나 목적 단백질의 대략적인 등전점이나 분자량을 알기 위해서 는 몇 개의 marker 단백질을 동시에 영동해야 한다.① 1차 전기영동IEF는 pI(등전점)가 다양한 양쪽성 용매를 함유하는 구멍이 큰matrix에서 이루어진다. 전기장에서 양쪽성 용매는 pH 구배를 형성하여, 전하량에 따라 이동하는 단백질이 전기장에서 net charge가 0이 되는 곳에서 정지하게 된다.② 2차 전기영동전하량에 의해 분리된 gel을 다시 SDS-PAG계의 극복 : IPG (immobilized pH gradient gel)Gel에 loading할 수 있는 단백질의 절대량이 약 100배 증가 (mg 단위)되었다. IPG gel strip이 상품화되어 재현성이 증가하였다.4) IPG (immobilized pH gradient gel)란?strip pH gradient를 만드는 물질을 immobiline이라는 zwitter ion을 사용하게 된다. 단백질의 위 치가 ampholyte의 배치에 따라 달라지는 것을 막을 수 있다.5)단백질의 loadingCup loading. rehydration시 단백질을 함께 넣어주면 polyacrylamide가 물을 흡수하는 과정에 단백질이 gel속으로 흡수한다.(4) Polyacrylamide GelAcrylamide와 bis-acrylamide를 라디칼 반응으로 연결시켜 그물 조직의 중합체를 형성하여 만드는 데, 그물 조직의 구멍(Pore)의 크기는 acrylamide의 농도를 변화시킴으로써 임의로 바꿀 수가 있다. Acrylamide의 자유라디칼을 발생시키기 위해서 ammonium persulfate를 가하며, 중합반응의 촉매로 서, N, N, N',N'-tetraethylenediamine(TEMED)을 첨가한다.Polyacrylamide gel은 성분들을 전하에 따라서 분리할 수 있을 뿐 아니라 분자를 거르는 체의 구 실을 하여 질량에 의존하는 분리도 수행한다. 오늘날 polyacrylamide gel은 단백질의 분리, 분자량 측정, 그리고 작은 크기의 DNA, RNA의 분리, DNA의 염기서열 결정 등에 이용되고 있다. 중성 pH 에서 단백질 자체의 전하가 극소화되면 겔의 sieving 효과에 의해서 단백질의 크기 증가에 따라 전 기이동속도가 감소한다. 따라서 단백질이 이동한 거리는 단백질 분자량의 대수 값과 반비례관계가 성립하게 된다. 미지의 단백질의 분자량은 동일한 조건에서 전기이동 시킨 표준 단백질들의 이동거 리들과 비교함으로써 결정된다. 단백질의 분자량이 음전하와 양전하를 동시에 띨 수 있다. 이와 같은 zwitter이온 의 성질을 이용하면 gel내의 pH조건에 따라 glycine의 net charge와 이로 인한 전기영동속도를 조절 할 수 있다. 전기영동을 시작하면 leading 이온인 Cl-이온과 단백질, glycine이온이 모두 양극을 향해 출발하게 된다.①Stacking gelGlycine은 pI (Net Charge 가 0이 되는 pH)가 대략 6.2 정도이다. 따라서 glycine은 pH6.8의 Stacking gel에서 일부만 음전하를 띠게 된다. Glycine은 stacking gel의 낮은 pH 조건에서는 거 의 중성을 띠므로 국부적인 전류의 감소현상이 유발된다. 따라서 낮은 pH 조건에서도 이동도가 빠른 Cl-이온과 이동도가 느린 glycine 이온 사이에 매우 높은 전위차가 형성되는데 이러한 전위 차에 의해 glycine이온이 Cl-이온을 빠르게 뒤따르게 된다. 이때 상대적인 이동속도는 glycine < 단백질 < Cl-이 되며 따라서 단백질은 Cl-와 glycine 이온 사이에 축적되어 이동하게 된다. Cl-와 glycine 이온의 간격은 수 mm로서 많은 용적의 시료에 있던 단백질도 running gel에 들어가기 전에 이사이에 축적되어 해상도를 높이는 효과를 나타내게 된다. Stacking gel은 large-pore gel 이므로 단백질의 molecular sieving현상(gel내의 미세통로 크기에 따라 단백질이 분리되는 현상) 은 나타나지 않는다. 따라서 running gel에서 동시에 출발하게 된다.Stacking gel은 acrylamide농도가 3~5%인 것을 사용하며 pH는 6.8이다.②Running gel이동 중인 이온들이 running gel에 이르게 되면 running gel의 높은 pH는 glycine이온을 음전 하로 강하게 대전시켜 glycine의 이동속도가 단백질보다 빠르게 되며 단백질은 gel내에서 molecular sieving현상에 의해 분리된다. 즉 Run이다

공학/기술| 2006.01.12| 6페이지| 1,000원| 조회(5,209)

전기영동, 등전점, SDS-PAGE, polyacrylamide gel, IEF..

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[생명공학실험]미생물 생장곡선 평가A+최고예요

1. 실험목적: 이 실험은 일정 부피 내에 존재하는 세포의 수를 정량적으로 산출하여, 생물반응기(bioreactor) 내 에 서 세포수의 증식(생장, growth)이 어떤 형태의 속도론(kinetics)을 따르는지 측정하고 분석하는 데 그 목적이 있다.2. 실험원리(1) 미생물(Microorganism)미생물이란 육안의 가시한계를 넘어선 0.1mm이하의 크기인 미세한 생물로서 주로 단일세포 또는 균사로써 몸을 이루며, 생물로서 최소 생활단위를 영위한다. 조류, 균류, 원생동물류, 사상균류, 효모 류와 한계적 생물이라고 할 수 있는 바이러스 등이 이에 속한다. 이들은 지구상 어디에서나 습기가 있는 곳에는 생육할 수 있으며 인간생활과 밀접한 관계가 있다. 사람을 비롯한 동식물에 질병을 가져 오는 병원 미생물, 독소를 생성하여 식중독을 일으키는 미생물, 의식주에 관계되는 각종 물질을 변질. 부패시키는 원인 생불인 유해 미생물들도 잘 알려져 있다. 이러한 미생물의 특유한 성질을 이용하여 식품, 의약품 그 밖의 공업생산품 등 생산 공업에도 많이 이용하며, 간편한 시설로써 계속 배양시킬 수 있는 생물자원으로도 각광을 받고 있다. 미생물의 균주 개발에는 유전자공학적인 방법이 도입되어 이용되고 있다. 자연계에서는 동식물의 시체, 배설물 등을 분해하는 청소부 역할을 함에 따라 수질환 경 및 토양의 지력보존에도 이들 미생물이 많이 이용되고 있다. 미생물은 생육, 활공, 환경에 많은 영 향을 받고 있다.(2) 미생물의 생장생물의 생장은 확립된 성장조건에서 생물체의 모든 화학 성분량이 생물학적으로 질서 있게 증가하 는 현상이라고 정의 할 수 있다.(3) 미생물의 생육곡선(growth curve)미생물을 배양할 때 배양시간과 생균수의 대수(log) 사이의 관계를 나타내는 곡선으로 S자를 그리 며 유도기(적응기)와 대수기(로그대수기), 정지기, 사멸기로 나누어진다.①유도기(lag phase, induction phase)? 균을 새로운 배지에 접종하여 배양할 때 배지에 적응하는 시기?ase, maximum phase)? 생균수는 일정하게 유지되고 총균수는 최대가 되는 시기? 일부 세포가 사멸하고 다른 일부의 세포는 증식하여 사멸수와 증식수가 거의 같다.? 영양물질의 고갈, 대사생산물의 축적, 배지 pH의 변화, 산소공급의 부족 등 부적당한 환경이 되 어 균수가 증가하지 않는 시기? 내생포자를 형성하는 세균은 이 시기에 포자를 형성함? 생균수 = 사균수? 영양성분 고갈? 내성포자균은 포자형성④ 사멸기(death phase, phase of decline)? 생균수가 감소하는 시기? 영양분 고갈과 미생물의 대사노폐물로 인해 생육에 최고로 열악한 환경? 영양분이 없어진 미생물은 영양분을 얻기 위해 자기 몸의 성분을 각종 가수분해 효소를 이용해 분해하여 영양분으로 사용하는 시기? 다른 미생물을 죽이기 위해 독소를 만드는 시기.? 자가소화(autolysis)가 어느 정도 진행되며 세포가 용해되고 사멸하게 된다.(4) 세포의 생육속도분열에 의해서 생긴 세포가 자라서 다시 분열할 때까지 요하는 시간을 말하며, 젖산균이나 대장균 의 한 세대는 20분이며 효모는 약 60분이다. 계산대로 하면 대장균은 24시간 후에는 472×1019의 박대한 숫자가 된다. 그러나 실제는 대사산물의 축적, 영양 물질의 소비 등에 의해서 사멸하는 세균도 많아진다.(5) 미생물 세대시간 (generation time)분열 또는 출아에 의해서 생긴 새로운 세포가 생장해서 또다시 2개로 분열 또는 출아할 때까지 소 요되는 시간을 말하며, 세대시간은 대수기의 균에 대하여 일정기간의 최초 및 최종시간의 생균수를 측정하면 다음 식에 의해서 계산할 수 있다.지금 한 개의 균이 증식을 시작했다고 하면 세포 수는 세대가 바뀔 때마다 2배가 되므로,제 1세대 균수 = 1×2 = 2제 2세대 균수= 1×2×2 = 4제 n세대 균수 = 1×2n(n은 세대수)로 되고,많은 수(a)의 균을 접종하였을 때 총균수(b)는 b = a×2n이 되므로 이것을 바꾸어 쓰면log b = log a + n log : 작은 particle에 의해 빛이 산란되는데, 이때 빛의 산란정도는 어느 범위까지는 작은 particle의 농도와 직접 비례하게 되는 점을 이용한다.② 간접측정법? 세포조성의 측정 : 균체질소량 (균종, 배양조건에 따라 변화 가능)? 영양성분 흡수속도? 대사산물 생성속도? DNA or ATP 정량? VISCOSITY? Heat evolution? packed cell volume2) 세포수의 측정? Direct microscopic count (계수반): 106 cell 이상의 고농도 시료 + 각종 염색법 (생사판단의 어려움)? counter electronic counting: 세포가 electrode사이의 작은 구멍을 통과할 때, 전기적 저항이 증가하여 pulse를 발생시키는 점을 이용하여 세포수 및 size의 분포 측정이 가능하다. 그러나 죽은 세포, filamentous type 세포에는 사용할 수 없고 먼지까지 측정되는 단점이 있다.? count (colony count): spreading method로써, labor intensive하고 filamentous type 세포에는 사용이 어렵다.(30~300 colony)? technique (most probable number): 고체배지를 이용할 수 없는 경우연속희석, 배양법 viable cell count*동조배양정의 : 모든 cell population이 꼭 같은 growth phase 에 있는 배양이용: 세포 생리 실험, 세포분열 실험에 필수적동조배양을 얻는 방법1.유도법 : 환경조건의 조작으로 동일age의 세포를 유도온도, 영양성분 (탄소원), 광선, 단백질 생산저해제등2.선별법 : 특정 age의 세포만을 분리, 배양원심분리법, filtration (milipore filter: 0.45 um), micromanipulator세포주기의 아주 미세한 차이로 인해 무한히 동조배양 할 수는 없다.(7) Serial dilution적절히 희석한 시료를 배지에 접종하여 형성되는 콜로니(colon흡광도법이라고 하는데 주로 자외선 (ultraviolet, 180~320nm)및 가시광선 (visible, 320~800) 영역에서 빛의 흡수를 이용한다.빛이 시료를 통과하게 되면 시료에 의하여 빛이 흡수되기 때문에 빛의 강도는 약해진다. 시료용 액을 통과한 빛의 양(transmittance, T)은 흡광물질이 존재하지 않았을 때의 빛의 강도(I0)에 대한 흡광물질이 존재할 때의 빛의 강도(I), 즉 T=I/I0로 표시되기 때문에 빛의 통과율은 항상 1보다 작 으며 다음과 같이 %로 표시될 수 있다.%T= T×100빛의 통과율은 시료의 농도와 특별한 상관관계를 나타내지 않지만 그 로그함수는 다음과 같이 시료 의 농도와 일정한 상관관계를 나타낸다.- log T=K×C여기서 C는 시료 중의 흡광물질의 농도이고 K는 상수이다. 위의 식에서 -log T 를 흡광도 (absorbance, A) 라고 한다면 흡광도는 시료의 농도와 특별한 상관관계를 지니게 된다. 그러므로 강도를 비교하여 얻어지는 것이다 .A = K×C< 그림 2. 시료 중에 흡광물질이 존재할 때와 < 그림 2.Cuvette의 직경이 빛의 통과율에 존재하지 않을 때의 시료를 통과한 미치는 영향 >빛의 강도 >위의 A = KC의 관계를 Beer's law라고 한다. 하지만 시료의 흡광도는 위에서 설명한 시료중의 흡 광 물질의 농도에 의해서만 결정되지 않는 다. 즉 그림 2에서 보는 바와 같이 cuvette의 직경 또는 폭에 따라서 흡광도는 달라진다. 또한 흡광도는 물질 고유의 특성에 따라서도 달라지는데 이것을 몰 흡수계수(molar absorptivity)라고 하며 ε로 표시한다. 그러므로 Beer's law는 다음과 같이 쓸 수 있다.A = ε ×b×c여기서 A는 흡광도, ε는 물질 고유의 흡광계수, b는 cuvette의 지경 또는 폭, c는 흡광물질의 농도 를 말한다. 시료용액의 흡광도는 대조구(blank test)의 흡광도에 대한 비율이기 때문에 단위가 없으 며 시료 중의 흡광물질의 농도와 정의 상관관화에 기인한다고 할 수 있다. 예 를 들면 용액에서 어떤 산, 염기, 염 등은 농도가 희석될수록 그들의 이온화가 증가되는데 이들 이 온의 빛 흡수는 이온화되지 않은 분자들의 그것과 다르기 때문이다. 또한 어떤 유기 화합물은 농도 의 변화에 따라서 응집되는 경향이 있다. 따라서 흡광도를 측정할 때에는 표준용액을 사용하여 standard curve를 얻은 후 Beer's law가 적용되는, 즉 농도와 흡광도가 정의 상관관계를 나타내는 범위의 농도에서 흡광도를 측정하는 것이 좋다. 흡광도를 측정할 때, 시료 용액은 cuvette이라고 불 리우는 용기에 넣어져 빛의 통로에 놓이는데 이때에 가능한 같은 cuvette를 사용하여야 하며, 두 개 이상의 cuvette의 굴절률, 반사율, 내부두께 등의 서로 다르면 시료의 흡광도는 그 물질의 농도 뿐만 아니라 이들에 의해서도 달라지기 때문이다. 표준화된 cuvette이란 빛에 대한 굴절률, 반사율 그리고 내부두께 등이 동일한 cuvette를 말하는데 일반적인 기준은 빛의 50%를 통과시키는 용액에 서 cuvette사이에 1%이상의 차이가 없어야 한다. 또한 cuvette는 회전에 의하여 굴절률, 반사율, 내부두께 등이 달라질 수 있기 때문에 흡광도를 측정하는 기구(분광광도계)내에서 cuvette는 정확 한 위치에 있어야 한다. 예를 들면 그림 5에서 보는 바와 같이cuvette의 세로선은 분광광도계 cuvette holder의 세로선에 일치하게끔 놓여야 한다. Cuvette에는 여러 종류의 흠이 있거나 지 문, 용매 등이 묻어 있을 수가 있는데 이들도 역시 흡광도에 영향을 미치기 때문에 잘 닦여져야 한 다. 분자는 원자와는 달리 그림 6에서 보는 바와 같이 광범위한 범위에 걸쳐 여러 파장을 지니는 빛을 계속적으로 흡수한다. 하지만 분광광도 법에 의하여 시료용액 중의 어떤 흡광물질의 농도를 측정하려면 그 물질의 빛을 가장 많이 흡수할 수 있는 빛의 파장, 즉 흡광도가 최대인 파장을 선택 하여야 한다. 왜냐하면 흡광도가 클수록

공학/기술| 2006.01.12| 9페이지| 1,500원| 조회(5,779)

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