1. Title : Bacillus cereus 정량분석2. Purpose : Bacillus cereus 분리 배양3. Theory□ Bacillus cereus의 특성Bacillus cereus는 토양세균의 일종으로 자연계에 널리 분포하므로 농작물을 비롯한 대부분의 식품에 오염되어 있다. 검출되는 비율은 높으나 식중독 발생은 특별한 경우에만 발생하므로 상대적으로 그 발생 빈도는 높아 오래 전부터 주목을 받아 왔으며 최근 우리나라에서도 각종 식품에서 검출되어 규제 대상이 되고 있다.Bacillus cereus는 그람 양성의 대형 간균으로 사슬형태의 배열하며, 편모가 있어 운동성이 있다. 포자를 형성하여 열에 대한 저항성이 강하며, 산소 조건에서 잘 증식하는 호기성 세균이다.자연계(토양, 먼지, 하수 등)에 널이 분포하여 식물에 오염되어 부패, 변패, 때로는 식중독을 일으킨다. Bacillus cereus는 소량 섭취하면 식중독을 일으키지 않는다.식중독을 막기 위해서는 식품에서 이 균(포자)을 사멸시키거나 발아를 억제시키고 증식을 방지해야 한다. Bacillus cereus 포자의 열 저항성은 100℃에서 1.2~7.5분으로 보고되고 있다.□ 식중독 원인 (식품)조리 후 냉각과정동안 수 시간 상온에 방치된 고기, 야채, 쌀, 스프 등에서 포자의 발아로 세균이 증식된다. 특히 볶음밥 등의 쌀밥과 스파게티, 면류 등의 소맥분으로 된 식품류가 주요 원인 식품이다. 보통 음식에는 10cfu/g 이라 가량 존재하므로 질병을 일으키지 않으나 이들 균의 생육조건이 맞으면 106cfu/g 이상까지 증식하여 식중독을 일으킬 수 있는 기회성 식중독균이다. 저온 살균 후의 낙농제품(우유, 치즈 등)에서도 발아 할 수 있다.□ 식중독 증상식중독 증상은 설사형과 구토형으로 구분할 수 있으며, 설사형의 잠복기는 대략 10~12시간, 구토형의 잠복기는 1~5시간이다. 심한 경우 심내막염, 패혈증, 화농성질환등을 야기할 수 있으나 다른 식중독에 비해 증세가 비교적 경미하다. 감염량은 106cfu/g 이상 (오염원에 따라서는 102~104cfu/g)이며, 균의 이상증식으로 발생된 독소가 혈관의 수분 투과율을 상승시켜 설사를 일으킨다.치료방법으로는 항생제, 수액제를 투여하고, 설사가 끝날 때 까지 안정을 취하며, 탈수가 되지 않도록 이온 음료 및 미네랄, 비타민을 섭취하는 방법이 있다.□ 식중독 발생 현황우리나라의 경우 2001~2005년까지 발생 건수는 0~3건으로 건수 자체는 그리 많이 않으나 2003년의 경우 건당 평균 66명의 환자가 발생하여 단체급식이나 대규모 식품업소의 철저한 위생관리가 필요하다 하겠다.미국 CDC애서 1980년에 9건의 집단발생이 보고 되었고, 원인식품으로는 쇠고기, 칠면조 고기 및 멕시칸 요리가 꼽혔다. 1981년에는 8건이 발생하였으며 쌀밥과 조개가 원인이었다. 기타 집단발병이 있었을 것으로 판단되나 Bacillus cereus로 인한 식중독 증상이 황색포도상구균 식중독이나 클로스트리듐 퍼프린젠스 식중독과 증성아 유사하며 실제보다 보고가 덜 되고 있는 것으로 보인다.□ 식중독 발생 사례1993년 7월 21일 미국 버지니아주 로드 페어팩스 보건소에서 두 곳의 보육센터의 어린이와 직원이 점심 급식 후 급성 위장염 증상을 보였다는 보고를 받았다.80명 중 67명이 점심을 먹었으며, 인근 레스토랑에서 만든 닭고기 볶음밥이 주원인으로 밝혀졌다. 닭고기 볶음밥을 먹은 48명 중 14명(29%)이 식중독에 걸렸으나 닭고기 볶음밥을 먹지 않은 16명은 식중독에 걸리지 않았다. 남은 닭고기 볶음밥과 소아 환자의 구토물에서 Bacillus cereus가 검출되었으며, 우유에서는 검출되지 않았다. 스코틀랜드의 한 중국식당에서 8명이 음식을 먹은 지 3시간 이내에 구토와 설사를 하였다, 환자의 분변, 반죽 속의 닭고기, 쇠고기 요리 및 볶음밥에서 Bacillus cereus가 검출되었다. 또 인동식당에서 카레라이스를 먹은 두 사람이 급성구토를 하여 조사한 결과 1명에게서 Bacillus cereus가 검출된 예도 있다.□ 예방법조리 시 충분히 가열살균하고 조리 후 상온에서 장기 보관하지 않도록 하며, 음식 제공시 74℃ 이상으로 재가열하거나 60℃ 이상으로 보은을 유지하여야 한다.대부분의 식중독 사건은 원인식품을 일단 가열조리 한 후 상온에서 보관하였다가 식사 시 재가열하거나 일부 재료를 추가하여 조리 한 경우에 발생하므로, 충분히 가열하고 장시간 보관하지 않으며, 보관이 필요한 경우 냉장 보관하는 등의 기본적인 위생 수칙을 준수하면 어느 정도까지 예방이 가능하다.□ PCR중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)의 약자로서 DNA 중합효소를 이용, DNA의 양을 증폭시키는 기술이다. PCR법은 DNA가 평상시에는 상보적인 이중나선 구조로 되어 있다는 것과, 열을 가하면 이러한 이중나선 구조가 풀려서 외가닥 DNA가 되며 이 상태에서 냉각시키면 DNA가 다시 이중나선을 이룬다는 특성을 이용한 기술이다. PCR법은 DNA가 아주 적은 양이더라도, 우리가 원하는 부분을 엄청난 양과 높은 정확도로 크게 늘릴 수 있다. 또한 장비가 단순하여 현재는 책상 위에 놓을 수 있는 장비로도 간단히 사용할 수 있으며 증폭에 걸리는 시간 역시 2시간 정도로 짧다는 장점을 가지고 있어서, 현대 생물학의 모든 분야에서 가장 중요한 기반 기술로 이용되고 있다. 현대 생물학에서 없어서는 안 될 가장 중요한 기술에 속한다.□ PCR의 원리증폭시키려 하는 주형(template) DNA와 함께 우리가 증폭시키고자 하는 특정 지역에 결합하는 프라이머(primer)와 DNA 중합효소(DNA polymerase), 새로운 DNA를 만들기 위한 재료인 dNTP(Deoxynucleotide triphosphate)를 함께 집어 넣어 준다. 이제 94~96도 정도로 열을 가하면 한 개의 DNA가 두 가닥으로 분리(denaturation)된다. 이후 온도를 50~64도 정도로 내리면 프라이머와 중합효소가 외가닥 DNA의 특정 부위에 결합(annealing)하고, 다음에 합성(elongation)되어 2개의 DNA가 된다. 이것이 1주기가 되며 다시 온도를 올려서 이 과정을 반복하면, 4개, 8개, 16개가 되는 식으로 폭발적인 연쇄 작용을 통해 원하는 DNA의 양이 늘어나게 된다. 여기서 프라이머란 DNA 중합효소가 붙어서 DNA 합성을 개시할 수 있는 15~50 염기쌍(base pair) 정도의 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)를 말한다. DNA 중합효소는 말 그대로 DNA를 합성할 수 있는 효소로서, 개발 초기에는 대장균의 DNA 중합효소를 사용했다. 하지만 고온, 저온을 왕복하는 과정 때문에 고온에서 DNA 중합효소가 변형되어, 매번 새로 넣어 줘야 하는 불편함이 있었다. 이를 개선하여 호열성 세균인 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)에서 얻은 Taq 중합효소를 이용하여 변형 문제를 해결하였다. 하지만 Taq 중합효소는 DNA 중합에 오류가 빈번히 일어난다는 문제가 있기 때문에, 현재는 고세균 Pyrococcus furiosus에서 얻은 Pfu 중합효소와 Taq 중합효소를 혼합하여 PCR법에 주로 이용하고 있으며 다른 중합효소도 널리 이용된다.□ PCR의 역사와 발전PCR법에 대한 발상은 1983년에 캐리 멀리스(K. Mullis)에게서 처음 나왔다. 그는 초창기 생명공학 회사였던 시터스(Cetus)의 연구원이었으며 우연찮게 PCR법을 고안해서 발표하게 된다. 처음 멀리스는 여러 저명한 과학 저널에 PCR법을 투고했으나 채택되지 않았고 실제로 논문은 1987년에 처음 게재된다. 시터스사는 중합효소의 종류를 바꾸는 등, 해당 기술을 개량하고 발전시켜 큰 성공을 거두게 되지만 이후 PCR 기술 자체가 듀퐁(DuPont)사나 로체(Roche)사, 프로메가(Promega)사가 연관된 여러 특허 분쟁을 일으키게 된다. 현재는 1992년에 특허권을 획득한 제약 회사 로체사에 PCR법의 특허가 있다. 개발자 멀리스는 PCR법을 고안한 공로로 1993년 노벨 화학상을 수상한다. 현재는 PCR법도 더욱 다양한 응용 기술이 개발되었다. 이러한 응용 기술로는 역전사 효소(reverse transcriptase)를 이용해서 RNA를 직접 증폭시키는 RT-PCR이 대표적이며, 이외에도 형광 물질을 붙여서 PCR을 진행하며 관측되는 정량적인 변화를 이용하여 원래 DNA나 RNA의 양을 정확히 측정하는 정량적(quantitative) PCR 또는 실시간(real time) PCR, 한 번에 수많은 PCR을 동시에 시행하는 대용량(multiplex) PCR 같은 여러 방법이 있다.□ PCR법의 이용PCR법은 현재 생물학에서 쓰이지 않는 곳이 없다고 해도 과언이 아닐 정도로 광범위하게 사용되는 기술이다. 또한 근래 과학 수사나 친자 감별 등에 자주 이용되는 DNA 지문 분석(DNA fingerprinting) 역시 PCR법을 이용해서 이루어진다. 생물학 쪽에서는 여러 유전병을 판별하기 위해서 인간 유전학에서 사용하는 경우가 있으며, 오래된 고생물이나 멸종 생물의 희소 DNA를 증폭하기 위해서도 이용된다. 분류학에서도 종 간의 DNA 비교를 위해 PCR법을 널리 이용하고 있으며, 분자생물학에서는 DNA나 RNA를 다루기 위해서 반드시 이용되는 매우 중요한 기술로 받아들여지고 있다.4. MethodA.시료 전처리모든 검체는 채취할 때 사용되는 도구 및 용기와 실험 과정에서 이용되는 배지 및 기구는 121℃, 1기압에서 가압 멸균하여 사용하고, 모든 시료는 clean bench에서 무균적우로 처리한다. 채취한 시료는 sterile stomacher bag에 25g을 취하고 225ml 0.85% 멸균생리식염수를 가하여 120초간 stomaching하여 균질화 한 후 이 중 1ml을 시험 검액으로 사용한다.
