1. 올리고당 [ oligosaccharide ]이란?: 단당류가 글리코시드 결합을 한 것.과당류(寡糖類) ·소당류(少糖類)이라고도 한다. 단당 2개로 이루어지는 이당류로부터 단당 10개로 이루어지는 십당류까지의 당류를 총칭한다. 단당류 ·다당류와 함께 그 분자사슬의 길이에 따라서 분류하는 경우에 쓰이는 명칭이다. 구성당이 한 종류로 이루어지는 단순한 것과, 2종류 이상으로 이루어지는 복잡한 것이 있다. 자연계에 유리 상태로 존재하는 것은 주로 이당류가 많은데, 사탕수수에 함유되어 있는 수크로오스, 녹말의 아밀라아제 소화물이며 엿의 원료인 말토오스(맥아당), 포유류의 젖 속에 있는 락토오스(젖당) 등이 있다. 환원말단이 단백질이나 지질과 결합해 있는 당단백질과 당지질도 그 당 성분은 대부분 올리고당류에 속한다.또한, 글리코시드로서도 존재하며, 다당류의 가수분해에 의해서도 생기는데, 셀룰로오스를 가수분해하면 생기는 셀로비오스는 그 대표적 예이다. 삼당류 이상의 올리고당류 중에 잘 알려져 있는 이당류와 공통의 구조를 가지고 있는 것도 있다. 특히 젖 속에 함유되어 있는 대부분의 올리고당이나 강글리오시드 등의 당지질(糖脂質)은 젖당이나 N-아세틸락토사민이 기본구조로 되어 있는 경우가 많다. N-아세틸락토사민은 당단백질의 부분 가수분해물로부터도 얻을 수 있다2. 올리고당의 종류올리고당은 여러 개의 단당이 결합된 것으로 소화흡수가 어려운 당류로서 현재 이용되는 올리고당에는 프락토올리고당, 대두올리고당, 말토올리고당, 갈락토올리고당, 이소말토올리고당, 자일로올리고당, 아가로올리고당 등이 있다.(1) 프락토올리고당설탕을 과당전이효소로 처리하여 제조하며, 소화흡수되기 어려우나 장내에 도달하여 비피더스균의 먹이가 되고 웰츠균의 생육억제 등으로 장내 부패물질을 감소시키며 장내 세균총의 개선효과가 있으며, 난충치성으로 주로 음료, 건강보조식품, 과자류, 제빵 등에 이용되고 있으며 일본의 경우 생산량의 50%를 사료용으로 쓰이고 있다.(2) 대두올리고당농축대두단백질 제조시 대두유청을 추출, 정제하여 제조하므로 생산단가가 높다. 감미도는 설탕의 70%정도이며, 청량감이 있고 비피더스균의 증식효과와 열과 산에 강하여 가공상 장점이 많으므로 음료에 주로 이용 된다. 특히 비피더스균에 대한 증식효과는 다른 올리고당보다 수배 효과가 있어 유아식품 및 분유에 첨가할 목적으로 수요가 늘고 있다.(3) 말토올리고당옥수수전분을 알파아밀라아제, 베타아밀라아제 등의 효소로 가수분해하고 이를 크로마토그라피로 분리하여 얻는다. 최근에는 일정한 크기의 올리고당으로 분해하는 효소가 미생물로부터 발견되어 공업적으로 이용되고 있으며, 감미는 낮고, 얼기 쉬우며, 잘 분해되지 않고 점도가 높고, 보습효과가 있다. 음료, 아이스크림, 빙과류, 카라멜, 분말음료, 분말스프 등의 제조에 이용된다.(4) 갈락토올리고당유당을 베타갈락토시다아제로 전이하여 제조하며 올리고당 중 유일하게 동물성소재를 이용한 것으로 모유 중에서도 존재가 확인되었으며, 특히 열과 산에 강하다.(5) 키토올리고당게, 새우 등 갑각류의 껍질을 분쇄하고 이를 산으로 탈단백하고 알카리로 탈염하여 만든 키틴을 탈아세틸화하여 얻은 키토산을 효소처리하여 얻은 것으로 건강보조식품의 원료로 사용되고 있다. 키토산은 중금속 흡착력이 뛰어나고, 다공질 등이 있어 식품뿐만 아니라 폐수처리에도 이용된다.3. 올리고당 제조(1) 말토올리고당(Maltooligosaccharides) 만들기(가수분해)① 버퍼 준비 (1L)Phosphate buffer (pH 7.0) 0.1 M, 500mL를 만든다.(NaN3 0.02% 첨가)② 기질 준비(100mL)만든 phosphate buffer 20mM 에 Starch를 10% 농도로 현탁해서 열을 가해 starch를 완전히 녹인다.③ 효소 준비(10mL)만든 phosphate buffer 50mM, 10mL에 효소액을 10㎕ 넣어서 희석한다.④ 반응하기기질 20mL에 효소액 (100㎕)을 각각 섞어, 반응기(37℃)에서 반응시킨다.⑤ Sampling5분 간격으로 sampling을 1mL씩 하여 1M NaOH 100㎕ 넣어 반응을 멈춘다.⑥ TLC를 이용하여 각 sample들의 올리고당을 확인한다.(2) 말토올리고당(Maltooligosaccharides) 만들기(산처리)① 4% HCl을 준비 (50mL)② 기질 준비(50mL)Starch를 2% 농도로 물에 현탁해서 열을 가해 완전히 녹인다.③ 산처리 반응하기(20mL)4% HCl 10mL에 2% starch 10mL 혼합하여 100℃ 반응기에 넣는다.④ Sampling5분 간격으로 sampling을 1mL씩 하여 5M NaOH 1mL 넣어 중화한다.⑤ TLC를 이용하여 각 sample들의 올리고당을 확인한다.(3) 아이소말토올리고당(Isomaltooligosaccharides) 만들기(가수분해)① 버퍼 준비 (1L)Citrate-phosphate buffer (pH 5.4) 0.1 M, 500mL를 만든다.(NaN3 0.02% 첨가)② 기질 준비(100mL)만든 Citrate-phosphate buffer 20mM 에 dextran를 5% 농도로 현탁해서 열을 가해 완전히 녹인다.③ 효소 준비(10mL)만든 Citrate-phosphate buffer 20mM, 10mL에 효소을 0.01g 넣어서 녹인다.④ 반응하기기질 20mL에 효소액 (10㎕, 50㎕, 100㎕, 200㎕)을 각각 섞어, 반응기(37℃)에서 반응시킨다.⑤ Sampling5분 간격으로 sampling을 1mL씩 하여 1M NaOH 100㎕ 넣어 반응을 멈춘다.⑥ TLC를 이용하여 각 sample들의 올리고당을 확인한다.(4) 아이소말토올리고당(Isomaltooligosaccharides) 만들기(합성)① 버퍼 준비 (1L)Sodium acetate buffer (pH 5.2) 0.1 M, 500mL를 만든다.(NaN3 0.02% 첨가)② 기질 준비(100mL)만든 Sodium acetate buffer 20mM 에 sucrose를 200mM 농도로 현탁해서 열을 가해 완전히 녹인다.③ 효소 준비(10mL)만든 Sodium acetate buffer 20mM, 10mL에 효소을 1mL 넣어서 희석한다.④ 반응하기기질 20mL에 효소액 (10㎕, 50㎕, 100㎕, 200㎕)을 각각 섞어, 반응기(37℃)에서 반응시킨다.⑤ Sampling5분 간격으로 sampling을 1mL씩 하여 1M NaOH 100㎕ 넣어 반응을 멈춘다.⑥ TLC를 이용하여 각 sample들의 올리고당을 확인한다.(5) 버퍼 만들기① Phosphate buffers0.2M 인산제 1소다(monobasic sodium phosphate 27.8g/1000㎖)용액과 0.2M 인산제 2소다(dibasic sodium phosphate Na2HPO4·7H2O ?53.5g 또는 NA2HPO4·12H2O 71.7g/1000㎖)용액을 다음과 같이 섞고 200㎖까지 희석한다.pHPhosphate monobasic (㎖)Phosphate dibasic(㎖)
1. TLC(Thin Layer Chromatography) 란?TLC는 유기화합물의 순수성을 검사하거나, 반응의 정도를 보기위해서 사용되는 단순하고도 빠른 방법, 이동상은 용매, 정지상은 평평한 지지체에 흡착된 고체로 일반적으로 유리판, 알루미늄박, polyester film 등의 위에 흡착제를 얇은 층으로 붙이고 이것을 고정층으로 하여 PC와 같이 용매로 전개하는 chromatography이다.Spotting a TLC plate with sampleRunning the TLC plate in solvent:TLC의 원리는 다른 column chromatography와 마찬가지로 흡착, 분배, 이온교환 gel 여과 등으로 나눌 수 있겠으나, 주로 흡착 TLC를 이용한다.(1) 흡착제-silica gel, alumina, 규조토, cellulose등이 사용하며 column chromatography용 흡착제에 비해 입자가 매우 가늘다.(2) TLC의 전개 방법-시료를 적당한 용매에 녹여 외경 약 1mm의 유리 모세관을 이용해서 박층에 sopt한다. 일반적으로 한 개의 시료에 대해서 여러 종류의 농도로 spot하여 test를 해본 뒤 실험하는 것이 좋다. spot한 시료의 양이 너무 많으면 전개할 때 spot가 너무 크게 되거나 tailing이 일어나서 좋은 결과를 얻기 힘들다. 일반적으로 물질의 분리 및 정제를 목적으로 TLC를 사용하는 경우에는 시료를 sopt가 아니라 선상으로 banding하고, 전개후 필요로하는 흡착제를 긁어내어 MeOH나 EtOAc 등 용출력이 강한 용매로 용출시킨다(PTLC).TLC의 전개는 위의 그림처럼 전개조를 이용하여 상승법을 행하는 것이 일반적이다. 이 때, 전개조 안을 용매로 충분히 포화시켜 놓기 위해서 전개조는 완전히 밀폐되어 있는 것이 좋다. 전개거리는 보통 10～15cm 정도이며 전개가 끝나면 용매선던의 위치를 기록하고 나서 용매를 증발시킨 뒤, 전개된 spot를 검출한다.형광시약을 함유한 흡착제를 이용하면, 적외선을 흡수하는 물질의 spot가 적외선 lamp하에서 그대로 나타난다. 또, 요오드가 들어있는 상자속에 전개된 plate를 넣으면 대부분의 유기화합물이 갈색의 spot로 검출된다. 이들 방법은 다른 발색시약(vanilline-sulfuric acid, dragendorff, H2SO4)처럼 유기 화합물을 변화시킬 위험이 적기 때문에 검출된 spot를 그대로 긁어내고 용출시켜 다른 분석이나 용도에 사용할 수 있다는 점에서 매우 편리하다.또, silica gel아니 alumina TLC가 유리한 점은 5% 황산이나 묽은 chrome산-황산혼액 등의 시약을 분무해서 100～110℃에서 가열하면 거의 모든 유기화합물을 검출할 수 있다.(3) TLC의 장·단점TLC에 있어서 용질의 Rf치는 PC와 마찬가지로 용매선단의 이동거리가 L이고 용질 spot의 이동거리가 Ls일 때 Rf = Ls / L 로 나타낼 수 있다.Rf=Compound distance from origin(midpoint)Solvent front distance from origin마찬가지로 TLC에 있어서 결점은 Rf치의 재현성이 나쁘다는 것인데 이것은1) 흡착제의 활성화에 있어서의 재현성2) 용매 중기에 의한 전개조의 포화3) 온도4) 시료양의 재현성등에 문제가 있기 때문이라고 생각된다.TLC가 이와 같은 단점을 가지고 있지만 전개시간이 짧고, 시료가 적게 소비된다는 매우 커다란 장점을 가지고 있으며 실험 시간이 짧고, 손쉽기 때문에 column chromatography를 위한 조건을 검토하는 예비실험으로도 이용되고 있다.2. 실험(1) 실험방법① Spotting : 1㎕ 점적한 후 말리고, 그 위에 1㎕를 한번 더 점적한다.② Dry : 헤어드라이기를 이용해서 spot를 완전히 잘 말린다.
1. 발효1) 탄소원과 알코올 발효포도당은 Embden-Meyerhoff-Parnas(EMP)경로를 거쳐 피루빅산염으로 전환되고, 그다음에 트리카르본산(크레보스 사이클)과 시토크롬 산화효소 경로를 거쳐 탄산가스와 물로 바뀐다. 산소가 한정되어 있고 발효성의 탄수화물이 존재하는 상황에서는 발효성 대사가 계속되어 피루빅산염은 아세트알데히드로 탈탄산되고 다음에 알코올로 환원된다. 포도당으로부터 알코올의 글리코시스는 11단계의 효소 반응이지만 과당은 10개의 효소반응을 거쳐 에탄올이 생성된다. 1분자의 단당은 2분자의 알콜과 2분자의 탄산가스가 된다.C6H12O6 → 2CH3CH2OH + 2CO2 + 약 56kcalglucose(fructose) ethanol 탄산가스180g → 92g + 88g + 6g 글리세린, 1g 유기산, 피루빅산, 아세트알데이드등이 생성된다.92g은 최대 나올수 있는 이론치로 51.5%에 해당하는 양이다. 실제는 48%정도의 수율이 된다. 이는 당이 다른 생성물로 전환되거나, 효모 세포에 영양이나 에너지로써 흡수되거나, 또는 생성된 에탄올이 휘발하여 손실되기 때문이다. 당의 총에너지는 673kcal이다. 혐기적 알코올 발효 동안 효모는 거의 증식하지 않고 세포를 만들기 위해 당이나 그밖의 영양물을 소비하지 않는다. 특별히 과즙에 공기를 넣지 않아도 과즙에 포함된 공기를 이용해 발효에 필요한 효모의 세포수는 확보할수 있다.포도과즙에 존재하는 다양한 종류의 당중 이용되는 당은 포도당(glucose), 과당((fructose), 만노스(mannose), 갈락토오스(galactose), 서당(sucrose), 말토스(maltose)를 이용할수 있지만, 리보스(ribose), 키실로오스(xylose)는 이용할수 없다. 초기 단계인 호기적 조건에서 원래 존재하는 초산과 같은 당이외의 탄소원도 이용하여 효모는 증식한다.포도과즙이 17~20%의 다양한 종류의 당을 포함하고 있는 경우 포도당은 다른당보다 빨리 소비되어 발효된다. 포도당과 과당이 거의 동일한의 4~5배정도 질소량을 함유하기 때문에 문제가 되는 경우는 없다. 발효가 완만할때는 인산이암모늄 약 0.06g/ℓ를 첨가한다.3) 발효 온도와 통풍온도는 발효 속도를 결정하는 중요한 인자이다. 과즙의 온도가 13℃ 이하라면, 발효가 좀처럼 시작되지 않는다. 발효온도가 10℃ 오를때마다 발효속도는 2배 빨라진다. 20℃에 이르면 효모는 급속하게 증식하고 발효는 갑자기 빨라진다. 발효가 4~5일 지연되면 곰팡이나 박테리아가 생길 위험이 있다. 반대로 30℃ 이상에서는 초기동안은 발효가 빨라도 발효정지도 빨라서 알코올 생성량은 적어진다. 35℃이상에서는 열 때문에 효모가 약해져 발효를 시작할 수없고, 40℃이상이 되면 대부분의 효모는 사멸하던가 발효력을 잃어버린다.대부분의 최적 발효 온도는 22~27℃사이(품질을 고려하지 않을때)이고 4일 이내에 발효는 종료한다. 알코올 향기성분이나 발효효율의 저하, 생성된 발효부산물에 의한 저해가 있다. 7℃에서 생육한 효모는 25℃에서 생육한 효모보다 세포당 알코올 생성양이 많다. 발효중 0.18~0.65%의 알코올이 증발하여 고온일수록 손실량이 많아진다. 높은 알코올 생성양을 원한다면 아주 낮은 옹도로 발효하는 쪽이 유리하다. 효모가 그이상 재생하지 않고 죽는온도를 특정짓는 것은 어려우나 30~32℃정도면 발효가 정지해 버릴 위험이 있다. 공기의 상태, 과즙의 조성, 효모의 질소원드에 따라 효모가 사멸하는 온도가 다르다. 빛(자외선)이 과즙에 닿으면 효모 세포는 손상을 받아 사멸하는 경우도 있다.산소가 존재하지 않아도 효모는 2~3세대 증식하지만 그후에 생육은 멈춘다. 오래동안 발효시키거나, 높은 알코올 함량을 얻기 위해서는 효모가 끊임없이 재생되야 하고 이를 위해 약간의 양이라도 산소가 공급될 필요가 있다. 산소 부족은 작은 양에서는 알기 힘드나 상업생산에서는 이문제가 발생할 가능성이 있다. 탱크 용량과 비교하여 과즙의 표면이 적어 공기와 접촉하는 면이 부족하기 때문이다. 호기적 조건에서는 에탄올을 형성하진 않지만 충분히 을 측정하거나 알코올 함량, 당함량을 측정하여 발효의 종료시기를 안다. 당 함량이 0.2%이하면 발효가 완료되었다고 판정한다. 발효가능 단계에서 효모를 죽이는 방법은 (1) 과즙을 가열한다.(82~85℃로 1분간 가열후 냉각하거나, 100mg/ℓ의 아황산을 첨가하고 60~63℃로 가열한다.) (2) 다량의 아황산, 그밖의 효모 살균제(사포닌계 효모 살균제)를 첨가한다. 포조 주정을 넣어 알코올을 강화하여 그농도를 17% 이상으로 한다.④ 발효의 도중 정지(stack 발효)모든당이 소비되기전에 발효가 멈추는 현상. 발효온도가 높아 생균수가 적어지거나, 사멸하거나, 또는 질소 성분 부족시 일어난다. 예측의 지표중 하나는 α-아미노산 함량이다. 한번 멈춘 발효를 다시 시작하게 하는 것은 그렇게 간단하지가 않다. 에탄올이 많이 생성되어 있어, 이것이 효모의 작용을 저해하기 때문이다. 해결법은 (1) 과즙의 온도를 낮추던가(20℃) 아니면 과즙의 온도를 올려(25~30℃) 효모의 할성을 높인다. (2) 인산이암모늄을 넣어 질소성분을 증가시킨다. (3) 알코올 내성효모 또는 저온 내성 효모를 새로이 첨가한다.5) 미생물 오염포도주의 부패와 관련된 주된 미생물은 초산균, 유산균, 산막효소이다. 초산균과 산막효소는 공기의 출입이 자유로운 상태일때 포도주의 표면에 생긴다. 유산균은 산소가 적은 포도주에 잘번식한다. 대부분의 박테리아는 중성에 가까운 pH에서 가장 잘 생육하고, 부패균은 pH 5.5 이하에서는 거의 생육하지 않는다.낮은 pH, 알코올, 아황산, 페놀, 탄산가스등 때문에 박테리아 오염의 위험은 적다. 미생물 오염 방지는 전체 청결도 중요하지만, pH, 알코올 농도, 온도, 산소 농도, 첨가한 SO2 농도로 좁혀진다.pH : 유산균〉효모〉초산균알코올농도 : 부패효모, 초산균(아세토박터), 유산균〉포도주 효모SO2 농도 : 유산균〉초산균〉효모순으로 영향을 준다.산막효소와 초산균은 호기성 세균, 유산균은 미호기성세균이다.① 초산균에 의한 오염과 그방지포도주에는 아세토박침전물이 생긴다. 기본적으로 혐깃성 세균이고 꽤 높은 농도의 알코올(12~14%)중에도 번식할수 있지만, 아황산 내성이 상당히 낮아 소량의 유리 아황산이 존재하거나(분자상 SO2 농도 0.8 mg/ℓ에서 저해됨), pH가 낮으면 생육할수 없다. 유산균의 생육은 효모의 생육에 비해 상당히 느리기 때문에 발효중에는 부패가 일어나는 경우가 없다. 발효가 끝난후 남아있는 영양분을 사용함으로써 유산균의 성장이 시작된다.포도주를 냉각 청정화한 후 앙금을 가라앉혀 유산균의 영양원을 적게 하고, 적절한 아황산 처리를 하면 현저히 줄일수 있다.2. 제조 기구와 재료1) 발효 탱크재질은 스텐레스 스틸이 세척 편이, 발효 및 저장에 적합. 높이와 직경비는 3:1, 총용량의 70%이하의 과즙이 실용적. 과즙의 당함량이 1% 소비될때 온도는 약 1.3℃ 올라가므로 온도 관리를 위해 냉각 장치가 필요하고 단열을 하므로써 약 5배의 냉각효과가 있다. 단열은 폴리우레탄으로 피복(10cm)하고 에폭시 수지로 씌우거나 파이버 글라스를 씌우고 폴리에틸렌 시트를 씌운다.2) 효모① 사면배지로부터의 주모의 조제맥아즙 한천의 사면배지에 배양 보존되어 있는 효모를 이용한다. 저온발효선, 아황산내성, 발효력 또는 저휘발산생성성이 중시되어 있고 아황산순화처리가 되어있지 않기 때문에 50~100mg/ℓ의 아황산을 포함한 과즙으로 적응시킨후 사용한다. 멸균 여과 과즙에 순수 효모를 접종할때는 pH 3.5이상이 바람직하고 질소량은 2g/ℓ에 인산이암모늄으로 보충하며 아황산을 첨가해서는 안된다. 오래 보존하면 탈수하기 때문에 정기적으로 배지를 옳겨 배양한다. 일반적으로 포도과즙을 물 50%로 희석하고 150~160℃, 60분 이상 건열 살균된 프라스코에 넣어 오토클레이브 안에서 115℃(약 1.5기압)로 15분간 가압 살균한 후 식힌다. 소량을 사면배지에 넣고 프라스코에 씻어 넣는 작업을 여러번 반복하여 효모를 프라스코로 옮긴다. 이것을 몇일동안 25~30℃에서 배양하면 효모의 생균수는 약 108~1010CFU에의 첨가법, 보존법은 유산균 제조업체의 지침에 따른다. LALVIN EQ54에 경우 발효가 종료된 포도주에 유산균 스타터를 직접 첨가한다. 유산균 스타터 20g(15×109CFU/g)들이 한봉지를 20~30℃의 100~200㎖의 물에 현탁하여 약 20~30℃로 20~30분간 방치한다. 이현탁액을 2,500ℓ의 포도주(14%이하의 알콜, pH 3.2~3.5, 총아황산 농도 50mg/ℓ이하)에 가해서 18~25℃에 두면 7~15일간에 MLF는 종료한다. 포도주에 첨가할 때 유산균 생균수는 107CFU이상이 된다.3. 포도의 처리(1) 파쇄와 제경파쇄의 목적 : 액과(berry=딸기류, 포도등)의 껍질을 찟고, 그내용물을 노출시켜 효모와 접촉시켜 알콜발효를 일으키게 하는것.파쇄와 제경은 시간 간격을 두지 않고 행해진다. 경(줄기)은 포도 품종에 따라 다소 다르나 약 4%정도이고, 발효당은 거의 없으나 폴리페놀과 회분량은 많아 폐기한다.포도가 파쇄된 순간부터 과즙은 공기중의 산소와 접촉하여 폴리페놀 옥시다아제 효소에 의한 폴리페놀의 산화가 일어나 과실향을 파괴하고 색조를 바꾼다. 제조 공정에서 공기를 차단하는 것은 불가능하지만 산화반응을 막는 효과적인 방법은 ① 과즙을 저온(4℃)으로 하고, ②덧붙여 아황산을 첨가하는 것이다. 아황산은 금속이온에 의한 촉매가 있으면, 산소와 직접 반응한다.(2) 스킨 콘택트와 펙틴처리1) 스킨 콘택트압착하기전 몇시간~2일동안, 과일 껍질에서 변종 플레이버를 추출하고, 헤비 스타일의 포도주를 제조하기위해 파쇄한 포도를 그대로 놔두는 경우가 있다. 스킨 콘택트에 의해 쓴맛이나 떫은맛이 증가하거나, 과즙속에 불용성 현탁물량이 0.3~3%이상이 되는등 역효과의 우려 때문에 먼저 포도품종을 고르고 스킨콘택트 시간과 온도를 정한다. 포도주의 향기, 페놀, 칼륨함량은 증가하고, 산도는 감소한다. 지나치게 익은 포도, 건포도, 보토리치스균에 감염된 포도는 당도가 높아진다. 일반적으로 10~20℃로 4시간 넘게 스킨 콘택트해서 제조된 포도주는 그색한다.
