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[생명공학]transformation

Gene ManipulationE. coli Competent Cell을 이용한DNA TransformationIntroduction공여 DNA 분자가 세포막을 지나 수용체 박테리아의 세포질 안으로 들어가는 운동은 에너지를 요구하는 능동적인 과정이다. 이 과정은 투과성 세포벽이나 막을 통한 DNA 분자의 수동적인 확산을 포함하지 않는다. 형질전환은 모든 종의 박테리아에서 자연적으로 일어나는 과정이 아니다. 오히려 이 과정은 배지에 자유롭게 떠다니는 DNA 분자들과 결합하여 세포질 속으로 운반할 수 있는 단백질과 효소적 기구를 소유한 일부 종에서만 일어날 수 있다. 형질전환에 요구되는 8에서 10가지의 새로운 단백질의 합성을 유도하는 작은 단백질인 수용능요소(competence factor)를 분비하는 능력세포(competent cell)만이 오직 형질전환의 수용체로서 능력을 가진다. Competent cell은 커다란 이중나선형의 DNA조각을 박테리아 표면에 있는 특정 수용부위에 부착하고 있다. 한정된 수의 수용체들이 존재하기 때문에 DNA분자들은 서로 이 자리의 결합을 위해 경쟁한다. 결합에 이어, DNA는 막을 가로질러 안으로 이동한다. 이 이동은 에너지를 필요로 하는 능동적 과정이다. DNA 가닥 중의 하나는 막-부착 엑소뉴클리아제에 의해 가수 분해되어, 나머지 DNA 가닥이 막을 통과하는 데 필요한 에너지를 공급한다. 분해되지 않은 DNA 가닥은 수용능 요소에 의해 유도된 막 단백질과 결합하여 막을 통과해서 세포질로 운반된다. 이 단일가닥의 DNA 조각은 DNA-결합 단백질로 둘러싸여지고, 재조합 단백질은 수용체 세포의 염색체 중 상동 지역을 찾아낸다. 다른 재조합 효소들은 공여 DNA의 단일가닥의 삽입을 촉매하여, 수용체 세포의 염색체에서 상동 지역과 교체시킨다. 이 유형의 재조합은 단지 수용체의 세포만이 유전적으로 개조되기 때문에, 한 방향성이며 비상호적이다.1. Transformation의 원리Competnet cell이 확보되어 recombinant DNA를 E. coli 내로 주입하는 과정을 transformation이라 한다. 그 원리를 설명하면 다음과 같다.E. coli 세포를 Ca++과 같은 multivalent ion으로 처리하면 양이온은 E. coli의 세포막에 존재하는 lipid의 negatively charged phosphate와 complex를 이룰 것으로 추정되고 4℃의 낮은 온도는 cell membrane을 응고시켜 charged phosphate의 분포를 안정화하여 cation에 의하여 효과적으로 shield되게 한다. 이 때 recombinant DNA를 가하고 4℃에서 반응시키다가 37~42℃로 heat shock를 가하게 되면 E. coli membrane 내외의 thermal imbalance가 생겨 DNA가 세포 안으로 빨려 들어가게 된다. 이외에 electroporation에 의한 transformation의 경우는, electric charge를 E. coli 세포에 순간적으로 가하고 이 때 세포막 단백질의 교란에 의해 일시적으로 생기는 pore를 통해 recombinant DNA를 세포안으로 넣는 방법이다.2. Transformation의 확인숙주세포로 들어간 recombinant DNA는 cloning vector에 존재하는 selection marker를 이용하여 선별하는데 현재 사용하는 대부분의 cloning vector는 항생제 내성인자를 selection marker로 사용하고 있다. 예를 들어 ampicillin 내성 유전자(β lactamase를 coding하는 유전자)가 포함된 vector plasmid를 사용하였으면 ampicillin이 포함된 LB배지에서 transformation시킨 세포를 도말하여 ampicillin 존재하에서 콜로니를 형성하는 것을 transformant로 1차 선별하고, 선별한 transformant를 다시 배양하여 이들로부터 recombinant DNA를 분리하고, 분리한 DNA의 염기서열을 DNA sequencing을 통해 확인하여 transformant로 최종 분리한다.이러한 내용을 바탕으로 E. coli Competent cell을 사용하여 DNA transformation을 하고자 한다.Materials and Method1. Preparation of Competent Cell1) E. coli 균주가 있는 plate에서 single colony를 2mL Luria-Bertani(LB) medium에 inoculation 한 후 37℃에서 키운다.2) 12~16시간 키운 (보통 overnight) E. Coli 균주를 main culture를 위한 LB medium (50mL)에 옮겨 37℃에서 키운다.3) ABS 600에서 OD가 0.4~0.5 정도 되도록 키운다.4) 키운 cell을 멸균된 centrifuge tube에 옮긴 후 3500rpm (bench top centrifuge)에서 3분간 원심분리 한다.5) 원심 분리 후 상층액을 버리고 ice-cold (미리 차갑게 해둔) 0.1 M CaCl2을 culture medium 부피의 1/5 (10mL)을 넣고 차가운 얼음 속에서 조심스럽게 흔들어 suspension 한다.6) 다시 3500rpm에서 3분간 원심분리 후 상층액을 조심스럽게 버리고 ice-cold 0.1M CaCl2을 앞 단계에서 넣은 양의 1/5 (2mL)에 suspension한 다음 ice에 보관한다. 이렇게 만들어진 competent cell은 250ul 씩 분주하여 -70℃에 급속히 얼려서 보관한다.2. 클로닝 벡터로서의 플라스미드유전자의 클로닝 벡터로 주로 이용되는 플라스미드는 숙주세포의 염색체 DNA와는 별도로 독립적으로 복제된다. 플라스미드는 클로닝 벡터로서 매우 중요한 특성을 지니고 있다.- 크기가 작아서 plasmid DNA를 쉽게 분리하고 조작할 수 있다.- 화학적으로 분리할 때 DNA를 안정하게 하는 환형구조를 가지고 있다.- 독립적인 복제기원(replication origin)을 지니고 있어서, 숙주세포 내에서의 복제는 염색체 DNA와는 별개로 복제 될 수 있다.-다중 복제수(multicopy) 이므로 세포속에서 여러개 혹은 수많은 복제수로 존재할 수 있어서 DNA 증폭이 가능하다.- 항생제 내성 유전자와 같은 선별표시인자 (selection marker)를 가지고 있으므로 플라스미드를 포함하는 클론을 검정하고 선발하기가 용이하다.3. 배양액 : Luria-Bertani(LB)시약정량dW 250mL기준Tryptone10g2.5gYeast Extract5g1.25gSodium Chloride10g2.5gAgar15g3.75gdW1L250mL1) magnetic bar를 넣어놓은 비커에 증류수를 100mL 되게 넣은 후 stirrer를 사용하여 비커 내부 magnetic bar를 돌려서 비커 내부를 고루 섞어준다.2) Tryptone, Yeast Extract, NaCl, Agar를 정량을 비커에 넣고 녹을 때까지 섞어준다.3) 다 녹으면 비커의 내용물을 mass cylinder로 옮겨 100mL로 부피를 맞춘 다음 다시 비커로 옮긴다.4) stirring을 계속 하면서 pH meter기를 사용하여 5N NaOH와 5N Phosphoric acid를 스포이드로 한방울씩 넣으며 pH를 7.0±0.2으로 맞춘다.5) 삼각플라스크로 옮긴 후 호일로 삼각플라스크의 주둥이 부분을 덮고 autoclave 표지용 테잎을 붙인후 autoclave(121~124℃ for 15min)한다.6) 55℃정도의 온도에서 Ampicillin을 1/1000배율로 100ug/mL농도가 되도록 넣어 준 후 (250uL ampicillin /250mL LB broth) Agar에 의해 굳지 않도록 빠른 속도로 배양액을 plate에 부어준다. 20~25mL정도 되게 넣어준다. 이후 배양액을 굳혀주고 아래 그림과 같은 방법대로 실험한다.4. Transformation1) E. coli competent cell(DH5α)을 얼음 위에서 녹인다.- 실제 실험에서는 녹여온 competent cell사용.2) Competent cell을 녹이는 동안 1.5mL tube를 얼음에 꽂아 놓아 차게 한다.- 1.5mL e-tube에 Labeling 한다. (Positive, Negative)3) 녹은 competent cell 20mL를 빈 tube에 옮긴다.4) Plasmid DNA 1uL를 넣고 가볍게 손가락으로 톡톡 5번 정도 쳐서 섞어 준다.*. 주의) 소량이므로 벽면에 묻지 않도록 한다. tube에 competent cell 넣을 때나 tip 내의 DNA를 넣을 때에는 tube의 가장 아랫부분에 넣도록 한다. competent cell과 DNA가 잘 섞일 수 있도록 한다.

자연과학| 2006.09.21| 5페이지| 1,000원| 조회(376)

cell, Coli, 얼음, competent

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