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폐기능측정

생리학 실험 보고서폐기능의 측정1. IntroductionSpirometer 폐활량계폐활량측정은 폐기능 검사 중 가장 쉽게, 가장 많이 사용된다. 폐활량 측정법은 피검자가 시간에 따라 들여 마시고 내쉬는 공기량과 기류속(flow)을 측정하는 검사로서 혈압을 측정하는 것과 같이 일반 건강 진단을 위한 검사 중 하나이다. 폐활량 측정 결과는 병 이환 및 생존과 유의한 상관 관계를 보이며, 또한 개인에게서 폐질환의 존재 유무, 질병의 경중, 그리고 치료의 반응을 측정할 수 있다.Volumes and Capacity● 상시 호흡량 (Tidal volume, TV) : 정상 휴식기의 평균 환기량● 흡기 저장량 (Inspiratory reserve volume, IRV) :상시 호흡량 이상으로 흡기할 수 있는 최대 폐기량● 호기 저장량 (Expiratory reserve volume, ERV) : 휴식기의 상시 호흡량에서 배출할 수 있는 최대 폐기량● 잔기량 (Residual volume, RV) : 최대 호기 후에 폐에 남아있는 공기량● 총폐용적 (Total lung capacity, TLC) : 폐활량과 잔기량을 합한 총폐용적● 폐활량 (Vital capacity, VC) : 최대로 흡기한 후 최대로 배출할 수 있는 총폐기량, 즉 상시 호흡량과 흡기 저장량을 합한 용적● 흡기 용량(Inspiratory capacity, IC) : 휴식기에서 흡입할 수 있는 최대의 공기용량, 즉 상시 호흡량과 흡기 저장량을 합한 용적● 기능적 잔기량 (Functional residual capacity, FRC) : 어떤 힘도 폐에 작용하지 않은 정상적인 호기 후에 폐에 남아있는 공기량2. Materials & MethodsSpirometer, Exercise (Climbing, Bicycle riding and so on), Smoker or Nonsmoker, Male or Female● FVC (Forced Vital Capacity) Test노력성폐활량 검사과정 중 숨을 강하게 내쉬기 시작한 후 1초 동안 또는 3초 동안의 호기량을 1초간 노력성호기량(FEV1) 또는 3초간 노력성호기량(FEV3)이라 하며, 이를 노력성폐활량에 대한 비율을 나타내어 기도의 공기흐름 장애정도를 평가할 때 이용한다.[노력성호기량비율(FEV%)=노력성호기량(FETt)/노력성폐활량(FVC)*100] 노력성 폐활량에 대한 1초간, 3초간, 노력성 호기량의 비율(FEVt/FVC)은 폐쇄성 질환(천식, 폐기종)과 제한성 질환(폐부종, 염증)을 감별하기 위한 목적으로도 이용된다. 정상인의 경우, FEVt/FVC비율이 최소한 80%이상 되어야 하는 것으로 알려져 있으며, 연령증가에 따라 70%까지 감소하기도 한다. 천식과 같이 기도저항이 증가하는 질환에서는 40%, 심지어는 20%까지도 감소한다.방법 : 숨을 최대한 들이쉰 다음 Mouthpieses를 입술로 물고 숨을 최대한 내쉬고 다시 최대한 흡입한다.● SVC (Slow Vital Capacity) test방법 : Mouthpieses를 입술로 물고 평상시 호흡을 세 번 한 후에 최대한 들이쉬고 최대한 내쉰다. 호흡의 시작은 들이쉬는 것으로 한다.[결과 해석]- 1초간 노력성 호기량(forced expiratory volume at one second;FEV1)

자연과학| 2010.06.01| 3페이지| 1,000원| 조회(271)

폐, 생리학실험, 폐기능, 공기량

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현미경조작

미생물학 실험 보고서실험 주제 : 현미경 조작오늘 실험에서는 광학 현미경의 구조와 조작법에 대해 간단히 알아보고 광학 현미경을 통해 세균을 직접 관찰해 보았다.1. 현미경의 구조Ocular lenses (접안렌즈) : 눈을 대고 보는 렌즈. 대물렌즈에 의해 확대된 상을 더욱 확대한다.Nosepiece (대물렌즈 고정장치) : 경통 아래에 붙어 있는 원판을 말하며 이 원판에 보통 4개에서 5개의 배율이 다른 대물렌즈를 끼울 수 있다. 시계 또는 시계 반대 방향으로 돌릴 수가 있기 때문에 배율에 따라 돌리기만 하면 관찰할 수 있다.Arm (손잡이) : 현미경 뒤쪽의 수직 기둥으로서, 위쪽은 앞쪽으로 굽어 경통이 붙어 있고, 아래 앞쪽으로는 받침이, 중간에 재물대가 팔 앞쪽으로 놓여있다. 재물대의 측면 아래에 초점을 맞출 수 있는 조동 나사와 미동 나사가 달려 있다. 현미경을 운반할 때에는 한 손으로 팔의 중앙 부분을 잡고 다른 손으로는 반드시 밑받침을 받쳐들어야 한다.Stage (재물대) : 표본 프레파라트를 놓을 수 있는 네모 모양의 받침대로서, 가운데에 둥글고 큰 구멍이 있고 몸통의 방향에 대해 직각으로 되어 있다.Mechanical stage (재물대 기계장치) : 재물대 위에 있는 프레파라트를 이동시킨다. 재물대 조절 나사인 두 개의 나사를 이용하여 전후로, 좌우로 이동시킨다.Coarse adjustment knob (조동 나사) : 재물대를 위 아래로 움직이며 상을 찾는데에 사용한다. 프레파라트와 대물렌즈 사이를 조절한다.Fine-adjustment knob (미동 나사) : 초점을 정확히 맞출 때에 사용한다.2. 현미경의 배율현미경의 배율은 접안렌즈의 배율 X 대물렌즈의 배율로 구한다. 특히 세균은 보통 1000배로 확대해야 관찰할 수 있기 때문에 현미경의 대물렌즈(oil immersion lense)와 표본 사이에 oil을 한 방울 떨어뜨려 관찰한다. 현미경의 해상도에 영향을 미치는 굴절률이 Air는 1, Oil은 1.515라는 값을 가지기 때문에 immersion oil을 사용하는 전용 렌즈가 더 선명한 해상도를 가지게 된다.*주의점 : oil을 이용하여 관찰할 경우, oil과 맞닿은 렌즈를 깨끗하게 닦아야 한다.3. 현미경 조작 방법1) 조동 나사를 돌려 대물렌즈와 재물대 사이의 간격을 띄우고, 배율이 가장 낮은 대물 렌즈로 맞춘다.2) 프레파라트를 재물대 위에 올려 놓고 접안렌즈를 들여다보면서 광원장치를 조절하여 시야를 밝게 한다.3) 프레파라트가 대물 렌즈에 닿지 않도록 옆에서 보면서 조동 나사를 이용하여 프레파라트를 대물 렌즈에 접근시킨다.4) 접안 렌즈를 들여다보면서 조동 나사를 천천히 돌려 상을 찾은 후 미동 나사로 정확한 초점을 맞추고 관찰한다.5) 프레파라트를 움직여 상이 시야의 중앙에 오도록 한다.6) 고배율로 관찰할 때에는 회전판을 돌려 대물렌즈를 바꾼 후 밝기를 조절하고 미동나사로 초점을 다시 맞춘다.4. 현미경을 이용한 관찰1) 글자 관찰현미경을 이용하여 관찰할 때 상의 방향 변화를 알아보기 위해서 글자를 관찰해보았다.글자를 내가 보는 방향으로 놓고 현미경으로 관찰했을 때, 현미경에서는 180도 회전한, 상하가 뒤집힌 글자가 관찰되었다.2) mouse kidney전체적으로 붉은 색이었으며, 핵이 두드러지게 관찰되었다.3) Bacillus subtilis사실 현미경 조작에 능숙하지 못해서 정확한 균의 모양을 관찰하기가 어려웠는데 조사해본 결과, 옆에 있는 그림과 같이 관찰되어야 했다.4) Escherichia coli전체적으로 파란색으로 보였으며, 하나하나가 막대모양을 이루고 있었다.느낀 점 : 현미경은 자주는 아니지만 중,고등학교 때부터 몇 번 씩 다뤄왔었는데, 막상 조작하는 일이 쉽지가 않았다. 무엇보다 접안렌즈에 눈을 댔을 때, 물체가 안 보이고 속눈썹이 보이는 등 접안렌즈와 눈의 거리가 어느 정도가 적당한지 조절하는 것 조차 어려웠다. 조동나사와 미동나사를 배율에 맞게 돌리는 것도 생각보다 어려웠다. 프레파라트에 떨어뜨린 오일이 대물렌즈와 붙어야 상이 잘 보이는데, 몇 초가 지나면 오일이 대물렌즈에서 떨어져서 정확한 상을 오랫동안 보는 것이 어려웠다. 그리고 세균이 보인다고 생각했는데 알고보니 세균이 아니라 먼지라는 것을 알았을 때도 실망스러웠다. 하지만 교수님께 오늘 실험의 고충을 말씀드리니 앞으로 연습할 기회가 더 많다고 하셨으니까 다음 실습 때부터는 좀더 부지런히 움직여서 현미경을 능숙하게 조작할 수 있도록 노력해야겠다.출처* HYPERLINK "http://imagesearch.naver.com/search.naver?where=idetail&rev=6&query=%C7%F6%B9%CC%B0%E6%20%B1%B8%C1%B6&from=image&ac=1&sort=0&res_fr=0&res_to=0&merge=0&spq=0&start=63&a=pho_l&f=tab&r=63&u=http%3A%2F%2Fblog.naver.com%2Fsys10040503%3FRedirect%3DLog%26logNo%3D110035625649&thumbnail=http%3A%2F%2Fthumbview02.search.naver.com%2Fthumbnails%3Fq%3Dhttp%3A%2F%2Fblogfiles.naver.net%2Fdata25%2F2008%2F10%2F18%2F33%2F%25C7%25F6%25B9%25CC%25B0%25E6_sys10040503.jpg&signature=534531405501&gdid=90000003_00000000000000199EA266B1" http://imagesearch.naver.com/search.naver?where=idetail&rev=6&query=%C7%F6%B9%CC%B0%E6%20%B1%B8%C1%B6&from=image&ac=1&sort=0&res_fr=0&res_to=0&merge=0&spq=0&start=63&a=pho_l&f=tab&r=63&u=http%3A%2F%2Fblog.naver.com%2Fsys10040503%3FRedirect%3DLog%26logNo%3D110035625649&thumbnail=http%3A%2F%2Fthumbview02.search.naver.com%2Fthumbnails%3Fq%3Dhttp%3A%2F%2Fblogfiles.naver.net%2Fdata25%2F2008%2F10%2F18%2F33%2F%25C7%25F6%25B9%25CC%25B0%25E6_sys10040503.jpg&signature=534531405501&gdid=90000003_00000000000000199EA266B1* HYPERLINK "http://blog.naver.com/bijou28?Redirect=Log&logNo=30008460505" http://blog.naver.com/bijou28?Redirect=Log&logNo=30008460505* http://blog.naver.com/bl96321?Redirect=Log&logNo=80072207660* http://en.wikipedia.org/wiki/File:Bacillus_subtilis_Spore.jpg

자연과학| 2010.04.04| 4페이지| 1,000원| 조회(468)

현미경, 미생물학실험, 현미경조작

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lysosome, mitochondria, peroxisome

[세포생물학]Lysosomes, Mitochondria, PeroxisomesLysosomesLysosomes은 막에 한정된 소포로서, 0.2 ~ 0.6 ul의 직경을 갖는다. Lysosomes은 산성의 조건에서 가수분해를 하는 매우 많은 가수분해 효소를 가지고 있다. Lysosome의 4.5 이하의 pH는 proton을 전위시키는 ATPase에 의해 조성된다. ATPase는 proton 농도 구배를 이용하여 ATP합성을 추진하는 mitochondria의 ATPase와 구조적으로 관련이 있으며, lysosome의 막에 위치한다. Lysosome 내에 존재하는 가수분해효소들은 protease, nuclease, glycosidase, lipase 등과 자연적으로 발생하는 고분자들을 충분히 분해할 수 있는 효소들이다. Lysosome에 도달하기 전에 이 가수분해효소들은 활성을 갖지 않는 proenzyme 형태로 존재하다가 lysosome에 도달하면 이미 있는 lysosomal protease들이 proenzyme의 특정 peptide bond를 끊어 활성을 갖게 한다. Lysosomal memberane은 당단백에 의해 덮여있어 가수분해효소들에 의해 분해되지 않는다.lysosome에서 분해된 아미노산이나 당, nucleotide 등은 lysosomal membrane에서 cytosol로 이동한다. 따라서 lysosome의 기능 중 하나는 섭취한 콜레스테롤을 LDL pathway를 거쳐 세포로 이동시키는 등의 영양분을 얻는 것이다. 이 외의 기능은 첫째, phagocytosis를 통해 미생물로부터 방어한다. 또 다른 역할로는 수정이 일어날 때, 정자가 난자로 진입하는 것을 쉽게 하기 위해 효소를 분비하는 역할을 한다. 세 번째로는 같은 cell 내의 구성물을 소화하는 self-eating 과정이다.Lysosome과 관련되어 알려진 40여 가지의 질병들은 유전적으로 결함이 있는 효소들에 의한 것이다. 이러한 질병에는 I-cell disease, Tay- sachs d HECT domain E3는 target으로 이동시키기 전에 ubiquitin과 thioester intermediate를 형성한다. 그 후에 E4가 ubiquitin 세트와 결합한다. Ubiquitination은 cell-cycle progression이나 transcriptional activation, apoptosis같은 다양한 세포내의 과정에서 중요한 역할을 한다. 몇 개의 ubiquitin이 결합한 polyubiquitin은 proteosome에 인식되어 기질 단백질이 작은 peptide로 분해되고, 결과적으로 아미노산이 된다. Ubiquitin과 ubiquitin-related protein은 직접적인 단백질 분해 뿐만 아니라 translation, transcription 인자들과 kinase 활성화, DNA 회복 활성화 등에도 관여한다. Ubiquitin이 제기능을 하지 못할 때에는 암이나 신경관련 질병 등이 나타난다.MitochondriaMitochondria의 주요한 기능은 산화적 인산화 과정을 거쳐 ATP를 생산하는 것이다. 이 외에도 mitochondria는 heme 생합성, iron/surfur cluster 합성, 스테로이드 합성, 지방산 대사, calcium 항상성, 아미노산과 단백질과 탄수화물 대사에 관여한다. 또한 mitochondria는 세포사멸의 중심적인 조절역할을 하기도 한다.Mitochondria는 두 개의 막으로 이루어져 두 개의 공간으로 나뉜다. 가장 안쪽 공간은 matrix라 하고, 두 membrane 사이는 intermembrane space라고 한다. matrix에는 pyruvate, 지방산 산화에 관여하는 효소들과 citric acid cycle과 관련된 대부분의 효소들이 있다. 또한 mitochondria의 genome과 단백질 합성을 위한 ribosome 역시 matrix에 존재한다.ATP Production by Oxidative Phosphorylation미토콘드리아의 가장 중요한 기능은 산화적 인산화P + Pi + 2H₂O →2CO₂ + 3NADH + FADH₂ + GTP + 2H* + CoA-SHCAC에서 생성된 3NADH + FADH₂ 분자와 해당과정에서 생성된 NADH는 이제 미토콘드리아 내막의 전자를 이동하여서 산소를 환원시키고 물을 생성시킬 수 있다. 이것은 chemiosmotic coupling의 시작이다. NADH 또는 FADH₂가 산화되면 H-를 방출한다. H-는 즉시 H+와 높은 에너지의 전자 2e-로 전환된다. 이 과정에서 즉시 53kcal/mol의 자유 에너지가 발생한다. NADH 또는 FADH₂로부 터 산소로의 전자 전달은 미토콘드리아 내막에 있는 4개의 multiprotein complex와 연결된 electron carrier들에 의해 촉진된다. NADH으로부터 나온 전자는 Complex I으로 들어간다. succinate로부터의 전자는 FADH₂를 통해 complex II로 들어간다. 그 후에 전자는 cytochrome c, complex IV로 들어간다. 그 후에 H₂O를 생성하기 위해 산소로 이동한 다. Proton은 matrix로부터 intermembrane공간의 complex I, III, IV로 이동한다. 그리고 이것은 내막의 proton 농도구배를 유발시킨다. Complex V를 통해 Matrix로 재이동하는 Proton은 ATP합성을 가동하기 위해 이용된다. pumping되는 proton은 어떻게 ATP를 합성시키는가? 이것은 Complex V의 ATP synthase에 의해 일어난다. 미토콘드리아의 ATP합성 효소는 membrane에 결합해 있으며 여러 개의 subunit을 가진 효소이다. ATP synthase는 두개의 구성물 F0과 F1로 구성 되어 있다. F0부분은 막에 끼워져 있는 구조이며, F0를 통해 proton이 막을 통과한다. F0는 3개의 다른 polypeptide로 구성되어 있다. 촉매역할을 하는 F1는 5개의 다른 subunit을 가지고 있다. α와 β subunit는 F1의 head에 존재한다이다. 둘째, 미토콘드리아의 단백질 합성은 오직 22개의 tRNA만 필요로 한다. 미토콘드리아의 대부분의 tRNA는 코돈의 세 번째 위치에 있는 nucleotide만 인식한다. 마지막으로 사람의 미토콘드리아 유전자 코드는 보편적인 유전자 코드와 다르다.미토콘드리아 DNA와 세포의 유전자는 몇 가지 차이점이 있다. 사람의 미토콘드리아 유전자는 모성 유전된다. 또한 미토콘드리아 유전자는 배수체이고, 개별적인 세포들은 수백~수천 개의 미토콘드리아 DNA copies를 가지고 있다. 세포분열시, 미토콘드리아와 그 유전자는 어느 정도 무작위적으로 분배된다. 마지막으로 미토콘드리아 유전자는 일반 유전자보다 mutation의 확률이 더 크다.Defects in Mitochondrial Function Can Cause Disease유전적인 제어가 이중적으로 일어나기 때문에 미토콘드리아 관련 질병은 미토콘드리아DNA에 의한 mutation과 일반 유전자로 인한 mutation 두 가지 원인에 의해 발생한다.인류의 질병의 매우 많은 수가 미토콘드리아 유전자의 변이와 관련이 있다. 미토콘드리아 DNA는 모성 유전되기 때문에 이러한 질병들 역시 어머니로부터 유전된다.미토콘드리아 DNA 변이는 규모가 큰 염색체 재배열과 point mutation으로 나뉠 수 있다. 염색체 재배열에 의한 질병에는 Kearns-Sayre syndrome, progressive external ophthalmoplegia, Pearson’s marrow-pancreas syndrome이 있다. Point mutation은 염색체 재배열과 달리 주로 모성 유전되며 미토콘드리아의 mRNA, tRNA, rRNA 유전자의 변이가 일어난다. 미토콘드리아 DNA의 Point mutation에 의한 질병은 Leber’s hereditary optic neuropathy, myoclonic epilepsy and ragged-red fiber disease, nonsyndromic deafness가 있다. 미토콘드리 전구체의 amino기 말단의 sequence는 내막을 통해 translocase of the inner memberane이라는 TIM23 complex와 PAM complex에 도달한다. Matrix로 들어가기 위해서는 미토콘드리아의 내막에서 ATP의 가수분해가 일어나야 한다.내막의 소수성 단백질 carrier는 TOM complex로부터 intramembrane space에 있는 Tim9-Tim10 chaperon complex로 이동한 후에 carrier translocase (TIM22 complex)에 의해 내막으로 들어간다. 이러한 전구체들의 막 통과는 미토콘드리아 내막의 potential을 필요로 한다. Β-barrel 외막 단백질의 전구체는 intermembrane 공간에 있는 Tim chaperones에 의해 TOM complex로부터 SAM complex ( sorting and assembly machinery)로 이동한다.PeroxisomesPeroxisomes은 단일막 구조의 작은 기관이며 크기는 0.1 ~ 1ul 정도이다. Peroxisome은 지방산의 산화과정, purine분해, 콜레스테롤과 담즙산, 지질 생합성 등 많은 물질대사 과정에 관여한다.Peroxisome은 O₂ 존재하에 기질을 산화시키는 여러 효소들을 가지고 있다. Peroxisome이 관여하는 반응의 반응식은 다음과 같다.RH₂ + O₂ → R + H₂O₂Uric acid, amino acid, purine, methanol, fatty acid 등 여러 종류의 대부분의 기질은 이러한 과정으로 인해 분해된다. 이 과정에서 생성된 과산화수소 역시 peroxisome에 있는 효소에 의해 분해된다. 그 과정은 다음과 같다.H₂O₂ + RH₂ → R + 2H₂O / 2H₂O₂ → 2H₂O + O₂Peroxisome의 주기능은 긴 지방산의 β-oxidation이다. 산화과정 외에도 peroxisome은 지질의 생합성에도 관여한다. Peroxisome은 인지질의 한 부류인 plas.

의/약학| 2009.12.09| 5페이지| 2,000원| 조회(372)

세포생물, 산화적인산화, Ubiquitin, lysosome, CITRIC AC..

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Experimental Practice of Biochemistry (Detection of the Gene-specific Products)

생화학 실험 보고서실험 주제 : Experimental Practice of Biochemistry (Detection of the Gene-specific Products)Introduction이번 실험의 목적은 특정 조직에 존재하는 유전자의 산물(mRNA)를 검출하는 것이다. 이번 실험에서 조직은 rat의 liver나 lung을 이용하고, 유전자는 β-actin을 이용한다.실험에서 필요한 mRNA는 구조적으로 불안정하여 RNase에 취약하여 분해가 쉽게 일어나기 때문에 비말 및 타액이 들어가지 않게 주의해야 한다.실험은 크게 세 단계로 이루어져있다.1. RNA extraction from tissue2. 1st stranded cDNA preparation by Oligo dT3. Detection of Gene Products by Polymerase Chain Reaction (PCR)RNA extraction from tissue[ procedure ]Tissue (~10mg) in 0.2 ml of easy-BLUE(TRIZOL) reagentsEasy-Blue는 RNA를 추출하기 위한 페놀 성분이 있는 파란색 시약이다.Add 40µl of chloroform, vortex vigorously for 1min.이 과정에서 세포가 깨지면서 세포 안에 있던 물질들이 밖으로 나오게 되고, 수층과 유기용매층으로 분리된다. 수층에는 RNA가 녹게 된다.Chloroform은 유기용매로써, 비중이 크고, 독성이 크며, 기화가 잘 되는 성질이 있기 때문에 바닥에 떨어지면 바로 기화되어 마취효과를 낸다. 따라서 피펫의 음압보다 중력에 의해 잡아당기는 힘이 더 커서 피펫 밖으로 흘러내리므로 작업동선을 짧게 하는 것이 중요하다.Put the tube at RT for 5-10 min.층이 분리되도록 기다리는 과정이다.Centrifuge at 12000X g for 10 min at 4℃, sup.Once of PCI extraction (same vol of PCI sup. Carefully.Sup에는 아직 유기용매층과 수층으로 정확히 분리되지 않은 물질들이 잔류하고 있다. 따라서 그 잔류물질들을 없애기 위해 상등액만 취해야 한다. 이 때, tube 안에는 (아래에서부터) PCI, denaturated proteins(debris), 수층(sup)로 층이 나뉘어져있다. debris에는 불필요한 단백질, 세포막, 핵 등이 녹아 있으므로 절대 취해서는 안 된다. 그러나 Sup은 가벼우므로 sup을 취하려다가 바로 밑에 있는 debris도 따라 올라올 위험이 크다. 따라서 sup만 취할 수 있도록 세심하게 작업해야 한다.Centrifuge를 할 때에는 균형을 맞춰서 돌리는 것에 주의해야 한다.PCI : DEPC-TE saturated Phenol / Chloroform / Isoamylalcohol (25/ 24/ 1)PCI의 성분인 Phenol과 Chloroform은 핵산에는 영향을 미치지 않으나 단백질과 지방질을 변성시킨다는 공통점이 있다. PCI는 10초 내에 조직을 상하게 만들 수 있으므로 묻으면 바로 씻어내야 한다.Add 1/10 vol. of 3M NaOAc and same vol. of 2-propanol (vol. for the sup.)이 과정은 알코올(Propanol)로 침전하는 단계이다. 핵산에 sodium이 결합할 경우 알코올과 친화성이 높아진다. 알코올은 핵산의 수분을 빼앗아 가므로 핵산끼리 잘 엉키게 되고, 그 결과 핵산은 침전된다. 따라서 Sodium Acetate는 핵산의 침전을 촉진하는 역할을 한다.Mix thoroughly, and then store at RT for 5 min (if necessary, put the tube at -80℃)Vortexing을 이용해서 mix한다. 용액이 뿌옇게 되면 잘 섞였음을 뜻한다. (핵산이 침전되면 뿌옇게 되기 때문이다.)Centrifuge at 12000X g for 10 min at 4℃, ppt.Centrifuge 후에 물과 침전물 층이 분리된다. 는 것은 RNA이기 때문에 Sodium을 제거하는 과정이 필요하다.이론적으로 이 과정에서 층이 분리되어야 하지만 내 것은 층이 분리되지 않았다. 조교님께 여쭤보니 처음부터 pure하게 분리했거나 아니면 처음부터 RNA가 없었거나 이 두 가지 경우라고 하셨는데 이 때부터 예감이 좋지 않았다.Rinse with 0.3 – 0.5 ml of 75% ethanol, mix.Sodium을 없애는 과정이다. Sodium만 제거하려면 물이 필요하지만 25%의 멸균수와 75%의 ethanol의 비율의 용액으로 rinse하는 이유는 물로만 rinse하면 RNA까지 녹기 때문이다.Centrifuge at 12000X g for 10 min at 4 ℃.75% ethanol을 제거하는 과정이다.Remove the extra ethanol completely, ppt,., Dry at RT for 3-5 min.남아있는 ethanol을 제거하는 중요한 과정이다.Add the appropriate volume of RNA grade water.Add 1/10 vol of 10 X DNase I buffer and 1 µl of DNase I, RT 15 min (vol for reaction scale).DNase I treatment목적 : 침전물인 핵산 중에 RNA만을 순수하게 분리하기 위하여 DNA를 분해•제거하기 위해서주의점 : ① 침전물이 보이지 않기 때문에 handling 등을 조심히 하지 않게 되는데 그럴 경우 RNA를 얻기 힘들다.② RNA가 오염되지 않도록 땀, 침 등을 조심해야 한다.③ 원심분리 시 균형을 맞추도록 한다.④ 원심분리를 할 때에는 E-tube의 꼭지가 바깥으로 향하도록 해야 한다. (이 경우에, 원심분리 후, 보이지 않지만 침전물이 꼭지와 같은 쪽에 모이게 되므로, pipetting은 침전물의 반대쪽을 해야 한다.)Pellet + DW (8µl) → 용해 (핵산용액)Pellet 8µl10x DNase I 1µlDNase I 1µl10µl (→1배)* I buffer 구성 : 400mM Tris-HCl (pH 7.5), 80mM MgCl₂ (DNase가 효소작용을 하려면 Mg를 필요로 한다.), 50mM DTT (Dithiothreitol; 일종의 효소 안정제)Add the water or TE buffer up to 0.1 ml.PCI extraction as described as above, centrifuge, sup.DNase를 제거하기 위한 과정이다. centrifuge하기 전에 voltex를 해준다. 상등액을 취하고 버린다.Add 1/10 vol of 3M NaOAc and same volume of 2-propanol.NaOAc를 넣고 pipetting으로 잘 mix해준다.이 과정 후에 용액이 뿌옇게 된다.Centrifuge, 75% ethanol rinse, drying (Do not dry up completely)Centrifuge는 2-3분이 적당하다. Centrifuge 후에 NaOAc, Propanol을 버린다.75% ethanol을 통해 버리고 남은 NaOAc, propanol은 씻겨나가고, 핵산(RNA)는 남는다.Store at -80℃.1st stranded cDNA preparation by Oligo dTcDNA를 만들어야 하는 이유 : RNA는 불안정하여 mRNA와 서열이 같은 cDNA(PCR에 더 적합함)가 필요하기 때문이다. 즉, PCR template로 이용하기 위해 필요하다.[ procedure ]Add distilled water 20 µl and RT Premix to template RNA.RT Premix에는 10x buffer RT 2 µl, dNTP (2.5mM each dNTP) 2 µl, RNasin (ED 30 U/ul) 1 µl, M-MLV RTase 1 µl, oligo dT Primer가 첨가되어있어서 실험을 좀 더 신속하고 간편하게 진행할 수 있다. M-MLV RTase는 원숭이에서 유래한 역전사효소이다.Dissolve the pellet bng PCR machine.cDNA synthesis 45℃, 60 min.RTase inactivation 96℃, 5 min.→ 5M NaOH 2 µl (pipetting으로 잘 섞기): cDNA를 만들었으므로 이제 더 이상 불필요한 RNA를 강염기를 이용하여 완전 분해하는 과정이다.→ 37℃ 10 min in PCR machine, 전량 1.5ml tube로 옮긴다.→ 3M NaOAc 2 µl, 100 µl 75% EtOH (pipetting): 이 단계까지의 결과, total RNA(pallet)에서 DNase I treatment에 의해 RNA가 제거된 상태가 되었다.Centrifuge for 10 min at full speed, ppt.Rinse with 300 µl of 75% Et.OH, centrifuge, ppt.Completely remove the ethanol, dry up.Heating block에 넣고 5분간 기다린다.Resuspend the ppt with 10 µl of water.이 과정을 거치면 cDNA pool이 완성된다. 즉, 서로 다른 여러 종류의 cDNA가 만들어지는데 그 이유는 mRNA의 종류가 여러 가지이기 때문이다. 합성된 많은 cDNA 중에서 우리가 필요로 하는 것은 세포골격단백질인 beta actin의 cDNA이다.cDNA data 측정 결과, 내 cDNA 값은 -0.88 ng/ul가 나왔다. 기계의 오차와 상대적인 농도값을 측정하는 것이라고 감안을 해도 다른 사람들의 sample보다 현저하게 낮은 농도라 매우 속상했다. 실험 초반부에 RNA extraction하는 과정에서 원심분리 후에도 내 tube에는 층이 분리되지 않아서 예감이 좋지 않았는데 아무래도 그 때부터 실험이 잘못 되었던 것으로 추정된다.Detection of Gene Products by Polymerase Chain Reaction (PCR)Beta-actin의 서열을 PCR로 확인하는 과정이다.PCRWater 1.75µlPrimer set

자연과학| 2009.12.05| 8페이지| 3,000원| 조회(292)

biochemistry, polymerase chain rea, RNA ex..

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동맥경화증

동맥경화증: 새로운 관점동맥경화증은 가슴통증과 심장마비 그리고 해마다 암보다 더 높은 사망률의 원인이 되는 뇌졸중을 일으킨다. 어떻게 동맥경화가 일어나는지에 대해 오랫동안 받아들여진 관념이 잘못된 것으로 판명되었다최근 5년 전까지만 해도, 대부분의 외과의사는 동맥경화를 직접적으로 혈관과 관련된 문제라고 자신있게 설명했다. : 지방을 함유한 걸쭉한 액체가 활동적이지 않은 동맥의 표면에서 점차 자란다. 만약 침전물이 충분히 크게 자라면 그것은 언젠가는 그 혈관의 흐름을 막게 되고 혈액이 정해진 조직에 이르는 것을 방해한다.그 이후에 혈액이 결핍된 조직은 죽게 된다. 혈액을 공급받지 못한 조직이 심장이나 뇌의 근육일 때, 심장마비나 뇌졸중이 일어난다.저렇게 꽤 만족스러운 설명을 믿는 사람은 이제는 거의 없다.20년 전부터 시작된 연구들이 동맥은 무생물의 파이프와 유사하지 않다는 것을 증명해왔다.동맥은 살아있는 세포들을 포함하고, 그 세포들은 계속해서 서로서로 또는 주변 환경과 통해져 있다.이 세포들은 혈관벽 위가 아닌, 안에서 발생하는 동맥경화성 침전물의 성장과 발달에 참여한다.게다가, 크게 팽창하는 침전물은 상대적으로 거의 없기 때문에 그것들이 혈류를 막는 것은 매우 소량이다.그보다도, 대부분의 심장마비나 뇌졸중은 덜 튀어나온 침전물에서 유래한다. 이 침전물은 갑자기 파열하여 혈병이나 혈전의 발생을 일으키고, 혈류를 막는다.또한, 그 연구는 동맥경화증에서의 염증의 주요한 역할을 확립했다.이 과정은(베인 상처에서 감염이 일어나 빨갛게 변하고 부풀며 뜨겁고 아픈 것과 같이) 침전물의 생성부터 그것의 성장과 파열에 이르기까지의 동맥경화의 모든 단계의 기초가 된다.미생물이 침입하여 우리를 다치게 하려고 할 때, 염증은(글자 그대로는 불타는 중이라는 뜻을 가진) 병원균의 침입을 격퇴할 수 돕는다.그러나, 동맥경화의 경우, 염증반응은 해롭다.즉 다른 말로 하면, 이것은 류마티스성 관절염처럼 염증성의 질병에서 일어나는 것과 같이 우리 스스로의 방어체계는 우리를 염증으로 공격한치료들이 종종 실패하는지에 대해서-현대사회는 동맥경화를 예방하고, 발견하고, 치료하는 것에 대한 발전을 몹시 필요로 하고 있다.일반적은 인식과는 달리, 심장마비와 뇌졸중은 공업국가에서 암으로 인한 사망률을 뛰어넘었으며, 개발도상국에서 또한 우세하게 증가하고 있다.개관/동맥경화증■ 과학자들은 염증반응이 동맥경화증의 발달을 촉진한다는 설에 인정한다.: 지방이 포함된 침전물의 위험한 축적. 오래된 관점 – 그 지방이 비활동적인 동맥에서 커진다는 관점-은 더 이상 지지되지 않는다.■ 염증은 또한 혈소판의 파열을 일으키기도 한다. 혈병은 혈소판의 파열을 유도하고, 그것은 심장마비나 뇌졸중 같은 합병증을 일으키며 동맥을 폐색시킬 수 있다■ 혈액 속의 과량의 LDL, 또는 “나쁜 콜레스테롤”은 동맥의 염증반응을 유발한다. 그리고 콜레스테롤을 낮추는 요법들-이미 동맥경화증 치료의 기초가 되는-은 동맥의 염증반응을 줄일 수 있다. 염증반응을 막기 위한 다른 방법들 역시 연구 중에 있다.■ 염증반응의 진행을 발견하기 위한 혈액 검사는 오늘날 심장마비나 뇌졸중의 위험을 평가하기 위해 의사들이 채택하는 콜레스테롤 테스트의 보조자로써 유용한 역할을 한다.문제의 발화점세포와 문자들 사이의 상호작용을 묘사할 수 있는 도구가 부족했기 때문에, 염증증상을 처음으로 정의했던 선조들은 그들이 보고 느낄 수 있는 것에 초점을 맞췄다.오늘날 우리는 눈에 보이는 그러한 신호들이 극히 작은 전장에서 일어나는 싸움으로 인한 것이라는 것을 알 수 있다. 미생물의 침입이 시작되었다고 느꼈을 때(옳든 옳지 않든), 특정 백혈구-면역계에서의 최전선수비대하라고 할 수 있는- 언뜻 보기에 위협을 받은 것처럼 보이는 조직에 소집하여 더 이상의 감염을 막기 위한 화학적인 분비물을 분비한다.이 화학물질은 침임자에게 해가 되는 산화체를 포함하고, 방어 세포의 활동을 조직화하는 cytokine이라고 불리는 작은 단백질 같은 분자들에게 신호를 준다.따라서 연구자들은 염증세포와 그들의 조직 내에서의 활동 매개자를 확인함으로써자는 간이나 장에 있는 콜레스테롤을 다른 장기로 옮기는 역할을 한다. 과학자들은 우리 몸이 LDL과 콜레스테롤을 필요로 하긴 하지만 그것이 과량이 있을 때에는 동맹경화를 유발한다고 오랫동안 알아 왔다.하지만 최근까지도 어떻게 과잉의 LDL과 콜레스테롤이 침전물 형성을 유발하는 지는 아무도 설명하지 못했다.지금은 배양된 세포나 동물들을 대상으로 한 실험을 통해서 혈액 속 LDL이 혈류와 가장 가까운 동맥혈관벽인 intima(내막)에 모이면서 문제가 시작된다는 것을 알 수 있다.혈액에서 적절하게 응집된 LDL들은 혈관벽에 정렬되어 있는 외피 기반(연결 조직) 아래쪽에 있는 내피 세포를 주로 구성하고 있는 내막을 통한 출입이 가능하다.At reasonable하지만 LDL이 지나치게 많을 경우, LDL들은 내막 내부와 외부를 자유롭게 이동하지 못하고 점착물이 되는 경향이 있다.LDL들이 축적됨에 따라 LDL에 포함된 지방은 (녹슨 파이프나 부패한 버터와 유사한 과정인)산화 과정을 거치게 되고, LDL에 포함된 단백질은 산화과정과 glycation과정(당과 결합하는 과정)을 거친다.혈관 벽 내에 있는 세포들은 그러한 변화를 위험신호로 인지하고, 체내 방어체계를 강화한다.특히, 내피 세포는 그들이 혈액과 접하는 표면에 부착된 입자들을 보여준다.이 입자들은 평소에는 혈액을 순환하며 monocyte라 불리는 비활동의 염증성의 세포에 velcro와 같이 걸쇠를 건다.이 상호작용은 세포들이 순환과정에서 빠져나와 동맥벽에 부착되도록 한다.또한, 이 변형된 LDL들은 내막에 있는 내피세포와 평활근들이 chemokine이라고 불리는 화학 물질을 분비하도록 자극한다. 이 화학 물질은 monocyte를 유인하는 역할을 한다.이것은 사냥개처럼 그들의 먹이의 냄새를 추적하고, monocyte들은 내피세포 사이를 비집고 드나들며 화학물질이 지나간 흔적을 따라 간다.그 후에, 내피 세포와 평활근에 의해 잘 다듬어진 물질들과 Chemokine들은 monocyte들이 복제되고 활성을 가진 대식세포내막과 평활근으로부터 나온 단백질들의 표면에 scavenger receptor라고 불리는 입자를 붙여준다. 이 scavenger receptor은 변형된 LDL을 잡고, 대식세포가 그것들을 먹을 수 있도록 돕는 역할을 한다.대식세포들은 최종적으로 지방 방울을 많이 함유하고 있기 때문에 현미경으로 봤을 때 거품처럼 보인다.정말로, 병리학자들은 지방으로 가득 찬 대식세포를 foam cell이라고 부른다.동맥 혈관 내막 안에서 monocyte들이 부착된 입자들과 chemokine을 따라가는 것처럼 면역계의 또 다른 부분을 대표하는 T lymphocyte와 백혈구들 역시 그렇다.이 lymphocyte들 또한 동맥벽에서 염증 반응을 증폭하는 cytokine을 분비한다.거품형태의 대식세포와 적은 수의 T lymphocyte는 함께 fatty streak라고 불리며 후에 동맥을 손상시키는 침전물 복합체의 선구물질을 형성한다.불안하게도, 많은 미국인들은 그들이 10대 때는 이 미성숙한 침전물들을 알아채지 못한다.잘 알려진 물질들의 새로운 역할동맥 경화에 관한 보편화된 설명에서는 나쁘다고 알려진 저밀도 지단백질 LDL과 좋다고 알려진 고밀도 지단백질 HDL의 중요성에 대해서는 나타나지 않는다.하지만 (아래 그림에서 절단면이 보이는)이러한 입자들은 과학자들이 한때 생각했던 것보다 더 많은 방면에서 그들의 역할을 이행하고 있다.지단백질은 혈류 속의 콜레스테롤을 이동시킨다.LDL은 콜레스테롤을 간과 장으로부터 다양한 조직으로 이동하고, 조직들은 LDL로부터 받은 콜레스테롤을 이용하여 내막을 수리하거나 스테로이드를 생산한다.HDL은 콜레스테롤의 배출이나 재활용을 위해 간으로 이동시킨다.동맥경화가 어떻게 발전되는지에 관한 고전적인 관점은 과량의 LDL이 혈관벽에 축적되는 상황을 야기함을 함축한다.더 최근의 연구는 LDL이 혈관벽 안쪽에 축적된다는 것을 보고했다. 혈관벽 안쪽에서 LDL은 산화되고 다른 물질로 변한다. 그리고 바뀐 LDL은 점진적으로, 그리고 위험하게 동맥을 변화시키는 로운 연구는 HDL가 LDL의 산화작용을 방해함으로써 동맥 경화증을 막기도 한다는 것을 보여준다..염증의 많은 역할염증반응—지금은 동맥경화증의 가장 주요한 역할을 한다고 알려져있는— 은 특정 백혈구 세포들(일반적으로 최전선 방어역할을 하는)이 조직내로 침입하여 활성화될 때 일어난다.PLAQUE의 탄생1잉여 LDL입자는 동맥벽에 쌓이고, 화학적인 변화를 거친다. 그 후, 변화된 LDL은 혈액 속에 있는 (염증 반응의 중심적인 역할을 하는)monocyte와 (다른 면역계 세포인)T cell과 결합한 입자들이 내피 세포와 부착하도록 자극한다.또한 내피 세포는 동맥 내막에서 다른 물질을 유인하는 chemokine이라는 물질을 분비한다.2동맥 내막에서, monocyte는 활성화된 대식세포로 성숙하게 된다. 대식세포와 T cell은 cytokine(면역계 세포들 사이에서의 신호로 가장 잘 알려진)을 포함한 많은 염증반응 매개 물질과 세포의 분화를 촉진하는 인자들을 생산한다.대식세포는 또한 변형된 LDL을 섭취하는 데에 도움을 주는 scavenger receptor라고 불리는 수용체를 가진다.3대식세포는 지방 방울로 가득 찬 LDL을 먹는다. 이 거품 같이 보이고, 지방을 함유한 대식세포(foam cell이라 불리는)는 T cell들과 지방층을 형성한다. 이 지방층은 동맥 경화 침전물의 가장 초기의 형태이다.침전물의 진행4염증 반응 입자들은 침전물의 성장과 지질의 중심부에 섬유질로 된 뚜껑 형성도 촉진한다. 이 뚜껑은 염증 반응 입자들이 동맥 혈관 중막에 위치한 평활근이 내막의 가장 윗부분으로 이동하도록 유도할 때, 셀과 밀착하는 단단한 섬유질로 된 세포질의 형성과 증식을 일으킨다.이 뚜껑은 침전물의 사이즈를 증가시키지만 또한, 혈액으로부터 안전하게 그것을 에워싸는 역할도 한다.침전물의 파열5뒤에, foam cell에서 분비된 염증성의 물질들은 기질 입자를 소화하거나 평활근에 해를 입힘으로써, 뚜껑을 약화시킨다. 그러는 동안, foam cell들은 잠재적인 응고 촉진제인

의/약학| 2009.10.27| 5페이지| 2,000원| 조회(286)

동맥경화, 동맥경화증, 새로운 관점

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