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Simple staining and microscopy

Simple staining and microscopy1. 실험목적1) 단순염색 방법을 배운다.2) 광학현미경을 이용할 때 염색의 이점을 평가한다.3) 다양한 형태학적 모양과 세균세포들의 배열을 관찰한다.2. 실험원리가. 염색법 종류 및 특성광학현미경으로 살아있는 생물체를 염색하지 않은 상태로 관찰하는 것은 어려운 일이다. 세균은 매우 작아서 유침용 대물렌즈를 이용하더라도 관찰하기 어렵다. 이렇게 잘 보이지 않는 것은 관찰하고자 하는 세포와 명시야의 배경간의 불충분한 대조에 기인한다. 이 문제를 최소화하여 광학현미경에 의한 관찰을 용이하게 하기 위하여 세균세포들을 염색할 수 있다.1) 단순염색(simple staining)세포를 염색하기 위하여 한 가지 생물학적 염료(biological dye)를 이용하는 염색방법 이다. 미생물학에서 사용되는 생물학적 염료는 발색단을 포함하는 약 유기산(weak organic acid)의 염(salt)이다. 만약 발색단이 양전하(양이온)를 띄게 되면 그것은 염기성 염료이고, methylene blue, crystal violet, 그리고 safranin과 같은 염기성 염료들은 일반적으로 세균세포들을 염색하는데 사용된다.세균세포들이 염색되면 크기, 형태, 그리고 세포의 배열 같은 특징들이 쉽게 식별된다. 대부분의 세균은 0.2㎛부터 5㎛, 또는 그 이상의 크기를 나타낸다. 대부분의 세균세포에서 나타나는 모양은 구형(spherical 또는 coccus), 막대모양(rod 또는 bacillus), 나선형(spiral 또는 helical)이다. 그러나 가끔 난형(oval 또는 coccobacillus), 짧게 굽은 형(comma형, vibrio형), 스피로헤타형, 그리고 다 형태(pleomorphic)의 생물체가 관찰되기도 한다. 다 형태 생물체는 한 가지 형태만을 나타내지 않기 때문에 순수배양에서 다 형태 생물체는 여러 가지 다른 세포형태로 동시에 발견된다. Strepto myces 같은 세균은 Penicillium 종과 같은 곰팡 2가지 이상의 생물학적 염료(biological dye)를 사용하는 염색방법이다. 분별염색 기법은 또한 특별한 세포구조물을 염색하기 위해 사용될 수 있다. 이 염색방법은 세포의 형태와 세포배열과 같은 특성의 관찰을 용이하게 하여 세포의 시각화를 증진시킬 뿐만 아니라 기타 특이한 정보도 제공한다. 미생물학에서 가장 보편적으로 사용되는 분별염색 방법은 Gram 염색으로 대부분의 세균세포에서 염색결과는 Gram 양성이나 Gram 음성으로 나타난다. 이 염색방법은 1884년 덴마크의 내과의사 Christian Gram에 의해 처음 발견되었다. Gram 염색반응은 세균 동정을 할 때 제일 먼저 확인하는 특징 중의 하나로서 중요한 의미를 가진다. Gram 염색은 처음에 개발된 방법으로부터 많은 변화가 이루어졌으며 실험실에 따라서도 조금씩 차이가 있을 수 있다. Gram 요오드 용액의 요오드는 매염제로서 작용하며 crystal violet과 함께 화학적 복합체(CVI complex)를 형성 한다. 매염제는 염료(crystal violet)에 의해 염색된 세포들에 대하여 친화력을 증진시킨다. 물은 과량의 Gram 요오드 용액을 씻어내는데, 이 시점에서 모든 세포는 자주색(purple)으로 염색된다. 다음으로 사용되는 시약은 탈색제인 acetone-alcohol이며 세균의 세포벽에 존재하는 지방질을 용해시켜 CVI복합체를 떨어져 나가게 한다. 탈색된 세포들은 염색되지 않았거나 또는 무색으로 세포벽 내에서 지방질이 매우 적거나 또는 완전히 제거되며, CVI 복합체가 남아 있는 세균은 보라색을 유지하게 된다. 탈색을 확인하기 위하여 다음단계로서 역염색(counter staining)을 하는데 염료는 safranin이 사용된다. safranin은 염색과정에서 형성된 CVI 복합체를 가지는 세포에서는 영향을 받지 않지만 탈색된 세포는 밝은 빨간색으로 염색된다.Gram 염색의 결과로 세균세포는 크게 2가지의 주요 형태로 대별된다. 염색방법을 통해 crystal violet을 나타내는cetone-alcohol에 의해 즉시 용해되는데, 이는 탈색된 Gram 음성세균으로부터 CVI 복합체를 떨어져 나가게 한다.3 Gram 양성세포는 세포벽에 지질을 포함하지 않아서 세포벽은 세포로부터 CVI 복합체의 손실에 대한 장애물의 역할을 한다.Gram 염색방법에서 가장 중요한 단계는 탈색단계이다. 탈색제에 너무 오랫동안 노출되면 Gram 양성세포조차도 잘못된 염색결과를 가져오는 수가 있다. 오래된 배양은 죽은 세포를 포함하기 때문에 Gram 염색을 하는 경우에는 어린 세균을 포함하는 배양을 사용하여야 한다. 늙거나 죽은 세포는 CVI 복합체를 유지하는 능력이 없어져 잘못된 염색결과를 나타낼 수 있다.* 연쇄상구균(streptococcus) : 지름 1 m의 구균이 몇 개에서 십수 개가 사슬 모양으로 연결된 균류를 말한다. 그람양성균으로 성질은 젖산균에 가깝다. 자연계에서는 토양 물 우유 등에 존재하며 건강한 사람의 피부 비강 구강 장관 질 등에서도 볼 수 있다. 이 균에는 병원성과 비병원성이 있고 종류도 많으므로 먼저 적혈구를 용혈하는 여부에 딸라 용혈연쇄상구균, 녹색연쇄상구균, 용혈작용이 없는 연쇄상구균 등으로 분류한다. 용혈연쇄상구균은 용련균(溶連 )이라고도 하며 병원성을 나타내는 것은 이 용련균에 많다.나. 현미경실험실에서 사용되는 대부분의 현미경은 복합 명시야 현미경(compoune bightfield microscope)이다. 복합(compound)은 현미경 재물대 위에서 광원에 의해 비추어지는 표본이 두 개의 렌즈장치에 의해 확대된다는 것을 의미한다. 대물렌즈에 의해 형성된 상은 다시 접안렌즈 장치에 의해 확대된다. 명시야란 확대된 물체가 명시야에 대하여 어두운 물체로 나타나는 것을 말한다. 물체를 보기 위해서는 확대된 사물과 명시야 배경 사이에 충분한 대조가 있어야 한다.1)광량과 상의 형성상(image)은 확대에 앞서 광원에 의해 형성되어야 한다. 이것은 현미경의 재물대(stage)아래에 위치한 인공광원(백열전구)의 사용에 의해 성취된다.다. 저배율 대물렌즈(10X)는 적은 양의 빛이 필요하며 고배율 대물렌즈(100X)는 더 많은 빛을 필요로 한다.2)상의 확대적절한 조명에 의해 형성된 상은 눈으로 편하게 볼 수 있을 크기로 확대되어야 한다. 확대(magnification)는 대물렌즈(objective)와 접안렌즈(ocular)의 두 가지 렌즈장치에 의해 이루어진다. 대물렌즈는 비춰진 상을 초기에 확대시켜 실상(real image)을 형성하고 이것은 다시 접안렌즈에 투사된다. 접안렌즈는 더욱 상을 확대시키고 허상(virtual image)을 형성하는데 이것은 망막의 상(retinal image)으로서 눈에 인지된다.미생물학 연구에 사용되는 대부분의 현미경들은 회전 대물렌즈 대(revolving nosepiece)에 삽입된 3개의 대물렌즈를 갖추고 있다. 대물렌즈들은 10X렌즈(16mm).40X렌즈(4mm) 그리고 100X렌즈(1.8mm)이다. 렌즈의 중심으로부터 빛이 모이는 점까지의 거리인 초점거리(focal length)는 각 대물렌즈에 새겨져 있다. 초점거리가 짧아짐에 따라 대물렌즈의 작동거리도 감소된다.각각의 대물렌즈는 그 위에 적힌 수치대로 표본을 확대시키면 형성된 상은 접안렌즈에 의해 더욱 확대된다. 대부분 접안렌즈는 10X렌즈를 사용한다. 따라서 총 배율 (total magnification)은 저배율 대물렌즈를 사용하는 경우에는 100배(10X대물렌즈X10X 접안렌즈), 고배율 대물렌즈에서는400배(40X대물렌즈X10X접안렌즈), 그리고 유침용(oil immersion)대물렌즈에서는 1000배(100X대물렌즈10X접안렌즈)이다.3) 해상력현미경의 유효한 비율은 일반적으로 해상력(resolving power, RP)에 의해 결정된다. 해상력은 미세물질이나 분리된 실체로서 가깝게 위치한 두 물체 간을 구별하는 능력이다. 해상력은 사용되는 빛의 파장과 대물렌즈의 개구수(numerical apertures, N.A.)와 사용되는 콘덴서에 의해 결정된다.복합 명시야 현미경의 해상력을 결정하eam)의 사용으로 2 (angstrom unit, 1 =1Xm) 정도의 해상력을 가질 수 있다.다. 현미경의 종류1) 광학 현미경(LM, Light Microscope) : 유리렌즈를 사용하며, 광원(빛)은 가 시광선을 이용한다. 따라서 칼라로 관찰이 가능하다.1 일반 광학 현미경(light or bright-field microscope)대물렌즈로 1차 확대 상을 대물렌즈로 2차 확대 상을 만든다.2 위상차 현미경(phase contrast microscope)굴절률의 차이를 이용하여 표본(시료)을 관찰하는 방법으로 염색되지 않은 살아있 는 세포를 관찰하는데 유용하나 굴절률이 낮은 일반 염색된 시료에는 부적합하다.3 간섭 현미경(interference microscope)물체가 빛을 지연시키는 현상을 이용하여, 표본을 투과한 물체 광에 광원에서 분리된 간섭 광을 겹치게 하여 광 파장에 대한 간섭현상으로 투명한 표본에서도 그 구조가 뚜렷이 나타나게 하는 원리를 이용한다.4 암시야 현미경(dark-field microscope)이것은 암시야를 이용하는데, 햇빛이 비스듬히 비추는 곳의 거미줄의 경우 창 밖의 밝은 배경을 바라볼 때(배경이 밝을 때)는 관찰이 어려우나, 우리가 시각을 달리하여 어두운 곳을 바라볼 때(어두운 배경을 선택할 때) 거미줄이 오히려 잘 관찰되는 현상과 같은 원리다. 이러한 원리를 이용하여 일반 현미경으로는 관찰이 어려운 혈액속의 작은 지방입자 등의 관찰이 가능하다.5 편광 현미경(polarizing microscope)편광 현미경은 두 개의 편광 프리즘(또는 니콜프리즘)을 이용한 것인데, 자연광에는 여러 진동방향이 섞여있으나 편광 프리즘을 이용하여 특정한 파장만 통과시키는 두 개의 필터(프리즘)가 광선 경로에 서로 90도 각도를 이루어 앞뒤로 나란히 있을 때 어떤 빛도 투과되지 않는 원리를 이용하였다. 두 번째 필터가 그 선택을 바로 통과시킬 수 없을 정도로 첫 번째 필터가 진동 방향을 선택한다. 그 두 번째 필터를 "분해기(analyze된다.

공학/기술| 2005.06.24| 7페이지| 1,000원| 조회(556)

현미경, 단순염색, 연쇄상구균

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효소반응속도론

효소 반응 속도론1. 실험 목적효소는 생태계의 촉매로서 화학변환의 방식을 결정하는 훌륭한 분자 장치이다. 효소는 또한 여러 가지 형태의 에너지의 변환도 매개한다. 효소의 가장 두드러진 특성은 촉매력과 특이성이다. 본 실험에서는 많은 종류의 효소들 중에서 비교적 분석이 쉽고 흔히 구할 수 있는 amylase를 이용하여 녹말을 분해하는 반응으로부터 효소의 활성과 반응속도를 측정하여 보고 각각의 정의 및 개념을 파악하고자 한다.2.실험원리가. 효소 반응 속도론의 기초효소는 복잡한 생명현상을 가능케 하는 생물 촉매이다. 특정유전자에서 발현되어 특정 기능을 수행하는 역할을 하는 생명활동의 근본이 되는 물질이라고 할 수 있다. 최근의 급격한 생명과학의 발달은 새로운 단백질의 발견 및 각종 효소의 발견을 가능케 하였고, 각종 실험을 통해 이들 생체분자들의 활성정도를 측정할 수 있을 뿐 아니라, 이것을 통해 생명현상의 원리를 차츰차츰 이해하기에 이르렀다. 더 나아가 이러한 생체고분자들을 공학적 원리를 도입하여, 공정 등에 이용하고, 최적의 효소를 디자인하는 수준까지 다다랐다. 어떠한 효소를 발견했다고 할 때 그것의 활성정도를 이해한다는 것은 일반적으로 알려져 있는 속도 상수값들로서 알 수 있다. 속도 상수값들은 반응속도에 관한 정보 및 기질과의 친화력에 관한 정보를 제공한다. 급증하는 생물학적 데이터 및 보다 정확한 생체분자의 활성정도측정에 관한 요구로 인해, 정확하고 간편한 속도상수계산 필요성이 대두되고 있다. 특히 최근에 각광받는 단백질공학 분야에 있어서 높은 활성의 단백질을 디자인한다는 요구는 단백질의 구조연구뿐 아니라, 정확한 활성정도 측정을 필요로 하고 있으며, 아미노산 서열이 활성정도에 미치는 과정을 모델화하기 위해서 활성정도 측정의 정확함이 필요하다. 효소반응속도론은 효소의 농도, 기질 생성물 억제제 활성화제 등 결합물질의 농도, pH, 이온세기, 온도 등이 미치는 영향을 분석함으로써 반응 메카니즘에 관한 정보를 얻을 수 있다. 속도상수를 결정하면 이 값으로부터. 아울러 생체 내에서 효소의 활성도가 제어되는 방식을 이해할 수 있다.나. 효소 반응 속도론(Kinetics)효소의 반응 속도론이란 효소가 어떠한 조건에서 어느 정도까지의 생성물을 얻을 수 있는가에 대한 이론적 고찰이다. S(substrates)는 기질, P(product)는 생성물 그리고 E(enzyme)는 효소를 나타낸다. 기질은 효소의 촉매작용에 의해서 생성물을 얻는다.많은 효소들의 경우, 촉매작용의 속도 V 는 그림에 나타낸 것처럼 기질의 농도 [S]에 따라 변한다. V 는 1초마다 형성되는 생성물의 몰 수로 정의한다. 촉매작용의 속도는 기질 농도가 증가함에 따라 정비례하다가 다음에 평평하게 되기 시작하고기질의 농도가 더 커지면 최대값에 접근한다.일련의 기질 농도들에 대해서 생성물의 형성 정도를 시간의 함수로서 결정한다. 그림에서처럼, 각각의 경우, 형성된 생성물의 양은 시간과 더불어 증가한다. 그렇지만 결국에는 S또는 P의 농도에 알짜변화가 전혀 일어나지 않는 시간에 도달한다. 효소는 여전히 활발하게 기질을 생성물로 전환시키고 있으며, 그 반대의 반응도 활발하게 일으키고 있지만, 반응은 평형에 도달하였다.효소의 고정된 농도에서,[S]가 작을 때, V 는 [S]에 정비례하지만 [S]가 클 때는 [S]에 거의 무관하다. 1913년에 Leonor Michaelis 와 Maud Menten 은 이 반응과정의 특성들을 설명하기 위하여 간단한 모형을 제안하였다. 그들이 내세운 논거의 결정적인 특징은, 촉매작용에서는 특이한 ES 복합체가 필수 중간물질이라는 것이다. 이 모형은 많은 효소들의 반응 속도론적 성질들을 설명할 수 있는 가장 간단한 것이며, 식으로 나타내면 다음과 같다. (A)우리는 촉매반응의 속도와 기질 그리고 효소의 농도, 그리고 개개의 단계의 속도들과의 관계를 나타낼 수 있는 식이 필요하다. 우선, 촉매반응의 속도가 ES 복합체의 농도와 k2의 곱과 같다고 생각하자.V = k2[ES] (1)그런데 우리는 [ES]를 알고 있는 양의 항으로 나타내어야ES의 분해 속도 = (k-1 + k2)[ES] (3)간단히 하기 위해서 정류상태라 가정 (steady state assumption) 한다. 정류상태에서는, 출발물과 생성물의 농도는 변하고 있지만 중간 물질의 농도는 변하지 않은 채로 머물러 있다. 이러한 상태는 ES 복합체의 형성 속도와 분해 속도가 같을 때 일어난다. 식(2)와 (3)의 오른쪽을 같다고 놓으면,k1[E][S] = (K-1 + K2)[ES] (4)식(4)를 재배열하면 아래의 식을 얻는다.[E][S]/[ES] = (K-1 + K2)/K1 (5)미카엘리스 상수 (Michaelis constant)라고 부르는 새로운 상수 kM을 정의함으로써 식(5)를 같단히 만들 수 있다.kM = (k-1 + k2)/k1 (6)kM이 농도의 단위를 가진다는 것을 주목해야한다. kM은 효소-기질 상호작용의 중요한 특징이며 효소와 기질의 농도들과는 관계가 없다.식(6)을 식(5)에 삽입하여 [ES]에 대해서 풀면 아래의 식을 낸다.[ES] = [E][S]/kM (7)식(7)의 분자를 살펴보면, 만일 효소의 농도가 기질의 농도보다 훨씬 작다고 하면, 결합하지 않은 기질의 농도 [S]는 전체 기질의 농도와 거의 같다. 결합하지 않은 효소의 농도 [E]는 전체 효소의 농도 [E]r에서 ES 복합체의 농도를 뺀 것이다.[E] = [E]r - [ES] (8)이 식을 식(7)에 있는 [E]에 대입하면 아래와 같이 된다.[ES] = {([E]r - [ES])[S]}/kM (9)식(9)을 [ES]에 대하여 풀면 다음 식을 얻는다.[ES] = ([S][E]t/kM) / (1+[S]/kM) (10)또는[ES] = [E]r[S]/([S]+kM) (11)[ES]에 대한 이 식을 식(1)에 대입하면 아래의 식이 얻어진다.V = K2[E]t[S]/([S]+kM) (12)최대 속도 Vmax 는 효소가 기질로 포화되어 있을 때, 즉 [ES] = [E]r일 때 얻어진다. 그러므로,Vmax = k2[E]r (13)식(13)을 (12)에 대입하면 미) (14)다. 속도 상수의 의미와 중요성기질의 농도가 낮은 조건에서 [S]가 kM보다 훨씬 작으면, V=(Vmax/kM)[S]가 된다. 즉, 속도는 기질의 농도에 정비례한다. 기질의 농도가 높은 조건에서 [S]가 kM보다 훨씬 크면, V = Vmax가 된다. 즉, 반응속도는 최대값을 가지며 기질의 농도에 무관하다. kM이 가지는 뜻은 식 (14)에서 분명해진다. [S] = kM 이면 V =Vmax/2이다. 그러므로 kM은 반응속도가 최대값의 반일 때의 기질 농도와 같다. kM은 효소로 촉매되는 반응의 중요한 특징이고 효소의 생물학적 기능에 대해서 의미가 있다. 대부분 효소의 경우, kM은 10-1M과 10-7M 사이에 있다. 한 효소의 kM 값은 특정한 기질에 따라 결정되고 pH, 온도 그리고 이온의 세기 들과 같은 주위의 조건에 따라서도 결정된다. 미카엘리스 상수 kM은 두가지 의미를 가지고 있다. 첫째, kM은 활성자리의 절반이 채워져 있을 때의 기질의 농도이다. 그러므로 kM은 의미 있는 촉매작용이 일어나는 데 필요한 기질 농도의 척도가 된다. 둘째, kM은 식 (A)로 나타낸 촉매작용의 기구에서 개개의 단계들의 반응속도상수들과 관계가 있다. 즉, kM은 반응 각 단계의 속도 상수들의 조합과 같다.라. 효소의 기질 특이성효소의 활성부위의 입체구조가 일치할 때만 작용하기 때문에 효소는 특정 기질에만 작용한다.마. 효소의 저해제효소의 촉매 작용을 저해하는 것으로 기질과 매우 비슷한 구조를 가진 물질이 효소와 결합하여 효소의 작용을 저해하는 가역적 저해제와 저해제가 기질과 매우 단단히 결합하여 효소가 작용할 수 없게되는 비가역적 저해제가 있다. 가역적 저해제에는 경쟁적, 비경쟁적, 반경쟁적, 혼합(mixed), 기질 저해가 있다.바. 효소의 반응 속도에 영향을 주는 요인들① 기질의 농도기질의 농도가 증가하면 기질과 효소가 결합할 수 있는 확률이 높아져 반응속도가 빨라진다. 그러나 효소-기질의 결합이 포화상태에 이르면 반응속도는 더 이상 증가하지 않는다.② 온 된다. 따라서 효소가 활성화하는 최적의 온도를 유지하는 것이 중요하다. 생체 반응이 일정 온도 이상 올라가면 반응 속도는 떨어진다.③ pHpH가 변하면 단백질의 입체구조가 변한다. 그렇기 때문에 효소 구조가 변하게 되어 반응속도가 떨어지게 된다.④ 단백질의 기능과 변성사. Amylase가용성 녹말이나 글리코겐 등을 가수분해하는 효소. 작용 양식에 따라 α-아밀라아제, β-아밀라아제, 글루코아밀라아제로 분류된다. 논말에 침을 섞어서 따뜻하게 해두면 요오드녹말반응이 나타나지 않는데, 이것은 침 속에 있는 아밀라아제(프티알린)작용 때문이다. 침 1ml중에는 약 0.4g의 아밀라아제가 들어있다. 침과 이자액 속에 있는 아밀라아제는 녹말을 가수분해하여 말토오스를 생성하기 때문에 소화작용에 반드시 있어야 한다. 아밀라아제는 고등동문뿐만 아니라 고등식물·곰팡이·세균 등 자연계에 널리 분포되어 있다. 누룩곰팡이는 배양액에 다량의 아밀라아제를 분비한다. 또 어떤 종류의 곰팡이에 들어 있는 아밀라아제는 녹말을 거의 완전하게 가수분해하여 포도단(글루코오스)을 만들기 때문에 포도당 제조에 이용된다. 아밀라아제는 오래 전부터 연구되어 온 효소의 하나로서,1811년에 밀의 추출액이 녹말을 분해한다는 보고가 있었고 30년대에 침과 맥아의 아밀라아제가 발견되었다. 아밀라아제는 다른 효소와 마찬가지로 단백질이며, 이자액 속 또는 곰팡이의 배양액 속을 막론하고 다른 종류의 다량의 단백질과 섞여 있기 때문에 순수한 아밀라아제를 얻기 위한 노력이 오래도록 계속되었다. 1940년대부터 50년대에 걸쳐 아세톤에 의한 분별침전 등이 성공함으로써 각종 아밀라아제를 결정상태로 얻을 수 있게 되었다. 아밀라아제의 결정은 작기 때문에 육안으로는 명주실을 가루로 만든 것처럼 보이지만, 현미경으로 보았을 때 보리맥아에서 얻은 β-아밀라아제는 사각형, 콩의 β-아밀라아제는 육방정계를 이루고 있는 등 모양이 정연한 아름다운 결정이다. 정제한 아밀라아제의 단백질분자로서의 성질은 자세히 조사해 본 결과 침의 아밀라아

공학/기술| 2005.06.24| 6페이지| 1,000원| 조회(816)

효소, 효소반응속도, 속도상수의 의미, 단백질의 기능과 변성

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미생물의 접종 및 배양 평가A+최고예요

미생물 접종 및 배양1. 실험 목적순수배양법을 익힌다.2. 실험 원리가. 순수배양(pure culture)미생물학의 연구는 자연상태에 널리 분포하고 있는 여러 종류의 미생물들을 광학현미경으로 관찰하는 것부터 시작할 수 있지만 어떤 특정 미생물의 기본형태, 구조, 영양 요구조건, 성장에 적합한 환경, 대사산물, 다른 미생물과의 상호관계 및 병원성 등 여러 가지 성질을 알기 위하여는 우선적으로 미생물을 순수 배양하여야 할 것이다.순수배양이라 함은 다른 종류의 생명체가 섞여있지 아니한, 단일종의 미생물 집단이 있는 상태를 말한다. 자연상태로 부터 단일종류에 미생물을 얻기 위해서는 첫째, 다른 것으로부터 순수한게 분리하여야 하며, 둘째, 순수 분리한 균을 적절한 환경에서 다른 미생물의 오염이 없이 배양(cultivation)하는 두 단계의 과정을 거쳐야 한다.1) 순수분리 및 배양방법미생물의 배양은 시험관이나 플라스크 또는 평판 배양접시와 같은 작은 용기를 사용해도 충분하다. 그러나 이러한 용기들은 사용전 반드시 무균상태이어야 하며, 목적한 미생물 이외에는 어느 생명체도 용기 내부에 오염되지 않도록 특별히 보호되어야 한다. 배양용기에 접종되는 미생물체를 접종군이라 하며, 접종은 멸균된 백금이나 피펫 등으로 한다.미생물의 순수분리는 검체를 최종 희석액 1ml에 한 개의 미생물이 있을 수 있도록 희석함으로 얻을 수도 있으나 대개는 고체배지 위에서 독립된 집락을 형성시키는 것이 보편적인 방법이다. 집락은 고체배지 위에 한 종류의 미생물만으로 형성된, 육안으로 관찰이 가능한 크기의 미생물 모임을 말한다.1천자 배양법(stab culture)반고체 배지, 고층 한천배지 또는 반 고층 한천배지 등에 균을 접종할 때에 백금선에 검체균을 취하여 배지 중앙에 수직으로 천자하여 배양하는 것을 말한다.2획선 배양법(streak culture)사면배지에 접종 배양하는 방법이다. 멸균된 백금선에 균을 취하여 사면배지 가장 밑부분으로부터 한 개의 선을 중앙부 부분에 도말하고 그 위를 사행과 같이 한 번 더 도포 배양한다.3액체 배양법균을 액체배지에 배양할 때는 관벽을 이용하여 소량의 균을 배지 중에 미끄러져 들어가듯이 접종한다. 결핵균과 같이 배지표면 배양의 경우는 균막을 액체배지 표면에 띄우는 것같이 한다.4 희석법(dilution methid)액체배지에서 가장 간단한 분리법이다. 접종원은 멸균한 배지로 연속적으로 희석되며, 배지를 함유한 많은 수의 시험관에는 동량의 연속된 희석액을 접종한다. 이렇게 하는 이유는 일련의 시험관에 미생물현탁액을 희석시켜 접종함으로써 하나의 세포라도 그것이 시험관에 들어갈 확률을 작게 하기 위해서이다. 그러나, 희석법의 단점은 혼합된 미생물 개체균에서 수적으로 우세한 균주를 분리하는 데에만 이용할 수 있다는 것이다. 고체배지에서 자랄 수 없는 큰 미생물들을 분리하는 데에는 이용할 수 없는데, 그 이유는 자연계에서 일반적으로 이러한 미생물은 세균보다 수적으로 미약하기 때문이다. 따라서 희석법의 이용은 한정되어 있다.2)세균의 순수배양 기술의 개발Robert Koch는 한천을 첨가한 고형 배지를 만들어 세균의 순수 배양법(pure culture method)을 개발하고, Ehrlich로부터 슬라이스클라스 상에서 도말 염색법을 배워 세균의 분리 배양법을 1881년에 확립하였다. 그는 탄저균 배양에 성공하였고 1882년에 결핵균을, 1883년에는 콜레라균을 발견하였고 병소에서 분리된 세균이 확실히 그 질병을 일으키는 병원체임을 증명하는 방법론 즉 Koch의 법칙을 확립하였다.Koch의 법칙은 (1) 원인균은 언제나 질병이 있는 동물에서 동일한 균이 분리되어야 한다. (2) 분리균은 순수배양되어야 한다. (3) 순수배양균을 감수성동물에 접종하였을 때 동일한 질병을 일으켜야 한다. 그리고 (4) 실험적으로 감염시킨 동물로부터 동일한 균이 분리되어야 한다는 것이다.Koch는 결핵균 배양액인 튜베르큐린(tuberculin)을 기니픽에 주사하여 Koch 현상을 관찰하여 면역학의 발전에 크게 이바지하였다. 그의 업적에 의해 그후 20년 동안은 세균학의 황금시대라고 할 수 있었고, 1990년까지 세균성 질환을 일으키는 거의 대부분의 균이 규명되었다. 즉 디프테리아균, 가스괴저균, 파상풍균, 이질균, 장티프스균이었다. 그리고 그는 1905년 노벨상을 수상하였을 뿐만 아니라 면역학의 발달사에서 기술될 것인 바 그의 많은 제자들도 노벨상을 받았다. 그를 흔히 세균 기술학의 시조로 부른다.나. 고체배지고체배지란 미생물 성장에 필요한 영양분이 들어있는 배지에 한천이나 젤라틴 같은 고화성분을 넣어준 것으로, 고체배지에서 미생물의 이동이 저지당하기에 고립된 집락을 형성하게 되는 것이다. 미생물을 분리하기 위해서는 미생물의 집락이 형성되어야하는데, 집락이 형성되지 않고 물처럼 되면 쉽게 다룰 수가 없다. 그러나 고체배지는 미생물의 집락을 형성하고 고정함으로써 맨눈으로 볼 수 없었던 미생물을 눈으로도 볼 수 있게 해주었다.고체평판배지를 사용하여 미생물을 순수 분리하는 데는1 도말평판법(steak plate method) : 멸균된 백금이에 분리하고자 하는 미생물의 시료를 묻혀 고체배지의 한쪽에서부터 시작하여 점진적으로 전면에 도말한다. 도말하는 방법에는 여러 가지가 있으나, 한쪽에서 점진적으로 전면에 도말할 때 inoculum(미생물을 배양하기위해 사용된 물질, 배양액)은 차츰 희석되어 마지막 도말부위에 이르게 되면 한 개의 세포가 도말될 확률이 크다.2 주입평판법(pure plate method) : 한천으로 만든 고체배지의 내부에서 독립적인 콜로니를 형성시키는 방법이 있다.다. 열고정모든 도말 표본은 염색전 열고정되어야만 한다. 열고정의 목적은 열을 가함으로써 미생물을 죽이고, 세포 원형질의 고착과 균체 단백질을 슬라이드 표면에 부착시킬 수 있다. 그러나 지나치게 가열하면 미생물의 형태와 구조가 망가질 수 있다. (3회 정도 도말면을 위로 하여 불꽃 통과)

공학/기술| 2005.06.24| 4페이지| 1,000원| 조회(1,221)

배지, 배양, 접종

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