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혈청 내 중성지방, 콜레스테롤, ALP 측정

1. Title : 혈청 내 중성지방, 콜레스테롤, ALP 측정4. Purpose : 혈청 내의 중성지방과 콜레스테롤, alkaline phosphatase의 활성을 측정하고, 그 의마와 관련하여 일어나는 질병을 알아본다.5. Materials? Reagents : [콜레스테롤] - 효소시약, 완충액, 표준액[중성지방 - BCS Triglyceride ] - 효소시약, 완충액, 표준액[BCS alkaline phosphate] - 기질완충액, 정색시약, 표준액? Instrument : pipette, tip, test tube, rack, water bath, vortex, uv측정기6. Methods[콜레스테롤]? 3개의 tube에 각각 0.02ml의 D.W(1), 0.02ml의 표준액(2), 혈청샘플 0.02ml 을 넣는다.? 효소시약과 완충액으로 효소용액을 만든 다음, ?의 (1),(2),(3)에 첨가하여혼합한다.? 37?C에서 5분간 가온한다.? (1)tube-Blank를 기준으로 하여, 파장 505nm에서 흡광도를 측정한다.? 각각의 측정결과를 비교하여 본다.[중성지방]? 3개의 tube를 준비하여, 하나의 tube에는 표준액 0.02ml(s)을, 다른 하나에는 혈청 샘플을 0.02ml 넣는다.? 효소시약 1병과 완충액 1병으로 효소용액을 만든다.? 빈 tube를 비롯한 3개의 tube에 ?의 효소용액을 3.0ml씩 넣는다.? 혼합하여 37?C에서 10분간 가온한다.? (B) - 빈 tube+ 효소용액을 기준으로 파장 550nm에서 흡광도를 측정한다.[alkaline phosphatase]? 기질완충액을 37?C에서 미리 가온해둔다. (2.0ml)? 3개의 tube에 50ulTlr D.W(B), 표준액(s), 혈청샘플을 넣는다.? 잘 섞일 수 있도록 vortex를 한다.? water bath에 37?C에서 15분간 둔다.? 정색시약을 3개의 tube에 넣고, 500nm, 570nm에서 흡광도를 측정한다.7. Results[콜레스테롤]흡광도 - 0.2650[중성지방]농도 - 113.3932흡광도 - 0.1446[alkaline phosphatase]농도 - 7.7099흡광도- 0.1105- alkaline phosphatase 실험에서는 기질 완충액에 3가지 tube의 물질을 혼합하자마자 색깔이 바뀌었다. 변화가 일어난 것은 standard tube와 혈청 sample tube였으며, D.W가 있는 (B) tube에서는 아무런 반응도 일어나지 않았다.변화가 있던 2종류의 tube는 투명한 진한 분홍색으로 변하였는데, standard tube에 비하여 혈청sample의 tube가 그 색깔이 더 연하였다.그리고 3가지 실험 모두 이전의 농도들과는 그렇게 큰 차이가 없었다.8. Discussion(1) 주의사항? tube에 물이 들어가 total volume이 달라지게 하지 않도록 주의한다.? 손에는 단백질을 비롯한 여러 효소가 있으므로 직접 닿지 않게 한다.? vortex 할 때에는 tube의 아랫부분을 잡지 않고, 윗부분을 잡은 뒤, 살짝 눌러주어 적절하게 섞이게 끔 한다.(2) 콜레스테롤? cholesterol이란?혈장과 모든 동물의 조직에 들어 있는 미끄러운 물질로서, 화학적으로 스테로이드계 화합물로 분류된다. 순수한 상태의 콜레스테롤은 흰색의 결정성 물질로 냄새와 맛이 없다. 콜레스테롤은 각각의 세포를 둘러싸고 있는 세포막의 주 성분으로, 체내에서 이 물질을 출발물질 또는 중간물질로 하여 담즙산, 스테로이드 호르몬, 비타민 D 등이 합성된다.콜레스테롤은 혈류를 따라 순환하며 몇몇 기관에서 합성된다. 사람은 음식물을 통해 상당량의 콜레스테롤을 섭취한다. 간에서 합성되는 콜레스테롤의 양은 보상 매커니즘으로 조절된다. 즉 식사를 통해 섭취한 콜레스테롤의 양이 증가하면 간에서의 콜레스테롤의 합성이 감소한다.혈류 내에서 콜레스테롤 수치가 크면 동맥경화의 주요 원인이 된다. 콜레스테롤과 혈액 속을 순화하고 있는 다른 지방성 물질들이 혈관 내벽에 쌓이면, 혈관을 두껍게 하고 경화시켜 결국 혈관을 손상시킨다. 혈관에 쌓인 지방층은 혈관을 좁게 함으로써 혈액의 흐름을 억제하여 심장마비와 뇌출혈을 일으킨다. 혈액 내 콜레스테롤의 수치가 커지면 혈관 내벽에 콜레스테롤이 퇴적하는 속도가 더 빨라진다. 혈액 내 콜레스테롤의 수치가 큰 사람은 관상 심장질환에 걸리기 쉽다.? cholesterol biosynthesis- 콜레스테롤은 4가지 단계를 거쳐서 합성된다.제 1단계에서는 3개의 acetate가 축합해서 6개의 탄소 원자로 된 중간체인 mevalonate가 합성된다.제 2단계에서는 mevalonate가 활성화되어 isoprene단위가 된다.제 3단계에서는 5개의 탄소 원자로 되어 있는 isoprene 단위 6개가 중합해서 30개의 탄소원자로 된 linear의 squalene이 형성된다.마지막 4단계에서는 squalene의 고리화가 일어나서, 스테로이드 핵 4개 고리가 형성된다. 그리고 다시 연속되는 변화(산화와 메틸 기의 제거 또는 이동)가 일어나서 최종산물인 cholesterol이 된다.? 콜레스테롤의 기능-담즙산의 전구물질이 되는데, 담즙산은 십이지장으로 배설되며, 음식물 속의 지질을 유화시켜 그 흡수를 돕는다.- 여러 가지 스테로이드 호르몬의 전구물질이 되어, 당질 대사와 전해질의 조절, 생식기능의 조절 등 생체에서 중요한 기능을 한다.- 비타민 D의 전구체이다.- 생체막, 특히 세포막의 구성성분이고, 세포의 구조를 유지함과 동시에 막의 유동성을 조절하며, 막의 안팎으로의 물질 투과기능에 관여한다.? 콜레스테롤의 증가 혹은 감소로 인한 질병- 150 ~ 270 mg/dl* 고(高)콜레스테롤 혈증- 혈액 속에 들어있는 콜레스테롤이 정상치를 넘은 상태를 말한다.혈액 중의 콜레스테롤 정상치는 인종, 성별, 연령에 따라 다르며, 보통 동양인에서는 혈액 1dl당 약 130~250mg으로 되어 있다. 흔히 네프로제 증후군, 담도폐색, 갑상선 기능저하증, 동맥경화증 등에서 볼 수 있다. 유전성이 있는 것으로는 가족성 과콜레스테롤 혈증이 있으며, 특유한 증세는 없으나 동맥경화증을 일으키기 쉽다.* 저 콜레스테롤 혈증을 보이는 질환- Tangier 병, Bassen-Kornzweing 증후군, LCAT 결손증, 갑상선 기능 항진증, 뇌하수체 기능 저하증, 간경변, 중증 간염, 영양실조, 흡수불량 증후군 등.(3) Triglyceride? 중성지방 (Triglyceride : TG)이란?- 3가 Alcohol의 Glycerol 1분자와 3분자의 Fatty acid의 Ester 결합으로이루어진 지질- 혈청이 뿌옇게 되는 원인 인자- 중성지방 (Neutral Lipid)은 Monoglyceride , Diglyceride , Triglyceride의총칭. 그러나 혈청 중에는 90～95%가 Triglyceride로 존재하기 때문에 통상 Triglyceride와 중성지방은 같은 의미로 사용된다.? 중성지방 (Triglyceride)의 대사경로- 외인성 Triglyceride: 식사 (지방섭취 : Triglyceride) → 장관에서 소화 흡수 → 림프관 → 혈중 → Chylomicron (= 외인성 TG)→┌→ 간에 저장└→ 지방조직에 저장 → 에너지원 부족시 → Free Fatty acid와 Glycerol로 분해 → 혈중방출- 내인성 Triglyceride: Triglyceride 합성 → 지방단백질 (= 내인성 TG) → 혈중방출: 내인성 TG는 주로 VLDL (Pre-β-Lipoprotein)에 포함되어 운반: 내인성 TG의 이상은 주로 포도당 대사이상? 정상치 : 50～150㎎/㎗? Triglyceride 측정법(4) alkaline phosphatase - ALP(혈청 효소 검사)골형성의 지표가 되는 효소로써 골 기질에 활발하게 조골 세포가 축적될 때 많은 양의 효소가 분비된다. 뼈의 Paget's 질병, 전이성 종양, 골육종시 증가된다.alkaline phosphatase는 osteoblast라고 불리는 뼈 형성 세포의 바깥쪽에 붙어 있으면서 뼈 활성도와 증가와 함께 농도가 증가한다. 그러나 alkaline phosphatase는 다른 장기에서도 발견되므로, 정확한 뼈 활성도 측정을 위해서는, 피검사자가 금식하여 지방 음식을 섭취한 후 소장에서 발생할 수 있는 alkaline phosphatase 증가를 없애야 한다. 또, 연구진은 간에 의해 alkaline phosphatase의 양이 증가하는지 알아보기 위해 간 기능도 검사해야 했다. 이런 모든 것을 고려한 끝에 뼈 활성도 증가에 따라 alkaline phosphatase이 농도가 증가했다는 것을 확인할 수 있었다. 일반적으로 이 효소는 1리터의 혈액 30에서 130 국제 단위(international unit: I.U.)정도 존재한다.alkaline phosphatase의 양을 측정하는 검사법은 저렴하고 쉽지만 검사의 성격상 뼈 활성도 증가를 조기에 진단할 수 있는 장점이 있다. 일단 조기에 뼈 손실이 진단되며 많은 여성들이 신경을 쓰게 되어 뼈의 손실을 줄이는 효과가 있다. 일반적으로 폐경기의 여성들은 에스트로젠의 분비가 없어지므로 뼈의 재형성 비율이 증가하고 뼈에서 칼슘이 빠져나가는 현상이 발생한다. 따라서 전문가들은 폐경기의 여성들은 의사를 찾아가 주기적인 혈액 검사를 받도록 충고한다. 일단 alkaline phosphatase의 양이 증가한 것으로 나타나면 골밀도 측정과 같은 더 정밀한 검사법으로 골다공증의 위험성을 판단할 수 도 있다.

자연과학| 2008.05.17| 7페이지| 5,000원| 조회(1,342)

측정, 콜레스테롤, 혈청, ALP, 중성지방

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전기영동

1. Title : 전기영동4. Result : 결과를 maker와 비교해보면 300bp보다 좀 더 위쪽에 위치한다. 수치화로 계산한 결과 약 331bp가 나왔다. (volume 39254/ height 246/ area 345 - 뒤에 사진 첨부)mRNA를 동일한 양을 사용하여 PCR을 하게 되면 이론적으로 동일한 양의 actin DNA가 만들어져야 한다. actin은 house keeping gene으로 세포에서 구성적으로 발현된다.형광밝기를 통해 나타난 밀도를 수치화함으로써 얼마나 잘 발현되었는지 추측할 수 있다. DNA의 수치가 사람들마다 차이가 나는 이유는 먼저 수치가 높게 나온 사람이 RNA를 잘 분리해 냈거나 아니면 다른 사람보다 더 많이 넣었기 때문이다. 수치가 적게 나온 사람은 RNA 추출 과정 중에 RNA가 분해되었다고 예상할 수 있다. RNA발현으로 전사 활성 증가 여부를 예상할 수 있고, actin 단백질이 잘 만들어 졌는지는 해독과정의 증가여부로 예상할 수 있다. 이것은 western blot으로 알 수 있다.5. Discussion1) house keeping gene? house keeping gene이란 모든 세포에 고루 발현되는 유전자를 뜻한다. 이런 유전자 들은 어느 세포에서든지 그 위치나 기능에 상관없이 비슷한 수준으로 발현된다. 반면 이 와 다른 특정 유전자의 경우에는 특정 장기의 특정세포에서만 발현되는데 그 예로 인슐린 을 들 수 있다. 이 호르몬은 특정장기인 췌장 세포에서만 발현된다.좀 더 구체적으로 설명하자면 house keeping gene은 대개의 세포들 사이에서 발현양의 변화가 작은 유전자라 보면 된다. 그리고 세포의 생존에 필요한 기본적인 단백질(구성단 백질, 에너지대사계 효소 등)을 code하는 유전자이기도 하다. 따라서 이런 유전자들은 다 른 어떤 세포에서도 발현이 가능하다. 예를 들어 β-actin, G6PDH, HPRT, β2M, PBGD, ALAS 와 같은 유전자 등이 있다.이런 유전자들은 Northern Blot 이나 RT-PCR, 그리고 microarray 등에서 control gene으로서 자주 사용되는 것들인데 그 이유는 이것들 또한 세포의 생존에 필요한 기본적 인 유전자들로서 세포들마다(그리고 여러 가지 다른 조건에서도) 발현되는 양의 차이가 작기 때문이다.house keeping gene의 하나인 β-actin에 대해서 더 자세하게 설명하자면 다음과 같다.β-actin은 세포의 골격을 이루는 cytoskeleton의 주된 구성요소다. 그리고 대부분의 세 포에서 고르게 발현되며 그 유전자의 성격상 외부조건에 잘 변하지 않고 일정정도의 높은 발현값을 보인다. 이는 특정 유전자의 발현의 차이를 비교하고자 할 때 control로 많이 사용된다. 물론 대개의 경우 그 발현량이 변하진 않지만 특정 조건 즉 예를 들어 Starvation과 같은 상황에서는 actin의 발현량도 변하기 때문에 control로 사용하기 어려 운 면이 있다. 따라서 최근에는 18S rRNA를 그 내부 control로 많이 사용하는데 여전히 actin을 많이 사용하고 있다.

자연과학| 2008.05.17| 2페이지| 3,000원| 조회(435)

분자생물학, 전기영동, house keeping gene

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분자생물학 - RNA 추출 레포트

1. Title : RNA 추출과 RT-PCR, PCR4. Materials(1) Reagents : PBS, Trizol, chloroform, isopropyl alcohol, 70% EtOH, RNase free water, PCR Mixture, RT-PCR Mix 1, Mix 2(2) Instruments : pipette, tip, scraper, e-tube, centrifuge, vortex, PCR 기계, ice, 장갑,kimwipes5. Method[ RNA 추출 ]① 배지를 버린 후, PBS 2ml로 washing을 2회한다.② Trizol 2ml를 첨가 후 scraper로 긁는다.③ e-tube 2개에 1ml씩 나누어 담는다.④ chloroform을 300첨가한 후 vortexing한다.⑤ 12000rpm, 4℃, 10분간 centrifuge한다. (아래와 같은 결과가 나타난다.)⑥ pipette의 tip을 표면 가까이에서 천천히 e-tube에 상등액만 400취한다.⑦ isopropyl alcohol을 상등액과 동량인 400첨가한 후 10분간 정치한다.⑧ 12000rpm, 4℃, 10분간 centrifuge한다.⑨ 상등액을 따라 버린다.⑩ 70% EtOH 1첨가한 후, tube를 up & down 한 후, spin down한다.⑪ 7500rpm, 4℃, 5분간 centrifuge한다.⑫ 상등액(70% EtOH)을 tip으로 살살 긁어내어 제거한다.⑬ kimwipes에 거꾸로 놓아두고 dry한다.⑭ RNase free water 30에 녹인다.⑮ 55℃에서 10분간 boiling한다.? PCR Mixture를 위해 Spectrophotometry을 하여 RNA의 양을 계산한다.(Result에 RNA 양 계산)[ RT-PCR ]soln conc.Used volume/30rxn.mixoligo dT10pmol2.5→ ②RNA2.92→ ③Nuclease Free Water5.58→ ①Total11① Mix 1 ( sub total 11)② tapA를 얻었으면 얼마나 있는가, 얼마나 정제되었는가 (다른 불순물이 없는가) 알 필요가 있을 것이다. Spectrophotometry를 이용하여 이를 알 수 있었다.Spectrophotometry의 원리는 특정 파장의 빛을 액체에 통과시키면 빛의 강도가 감소하는 것이다. 물질에 따라서, 또 파장에 따라서 빛의 강도의 감소정도가 일정하므로 이것으로 특 정 물질의 농도와 다른 물질(불순물)의 농도를 알 수 있다. RNA는 260 nm의 빛을 흡수한다.실험 결과 다음과 같이A260이 1 일때, RNA 의 농도가 38/으로 알려져 있으므로, 이를 이용하여 RNA의 양을 알 수 있다.분리한 RNA 중 5를 정량에 사용한다면,* RNA 의 양 = 0.135 x 200 x 38 = 1.026/가 된다.1.026/x= 3→= 31.026/= 2.92RT-PCR을 하기 위해서 RNA는 2.92의 양이 필요한 것이다.[ 전기영동 ]? 전기영동시 mRNA는 확인할 수 없다. rRNA를 토대로 mRNA가 제대로 나왔는지 추측하는것이다. 전기영동시 왼쪽과 같이 나타난다.? 결과 :7. 실험 시 주의 사항① 모든 기구와 시약에 ribonuclease의 오염이 없어야 한다. (70% ethanol로 소독)② RNA는 vortexing하면 깨지기 때문에 up & down 과 vortexing하는 것을 잘 구분해서 한다.③ pipetting이 중요하므로 집중하여 실험을 한다.④ 반응물 혼합 시에는 tube를 ice 상에 두고서 혼합하여 상온에서의 잘못된 primer annealing에 의한 extension을 방지한다.⑤ DNase 와 RNase free PCR tube를 사용한다.8. RNA 추출 원리? 포유세포는 보통 한 세포 당 10-5ml RNA를 포함하고 있으며 이 중 80~85%가 rRNA, 15~20% 가 tRNA, 1~5%가 mRNA로 이루어져 있다. 리보솜 RNA나 tRNA 등은 일정한 크기와 염기서열을 가 지고 있기 때문에 전기영동, 초 원심 분리 및 크로마토그래피에 의해 용되고 이로부터 원하는 cDNA clone을 분리해 낼 수 있다. 완전한 cDNA를 클로닝하기 위해서는 완전한 크기의 RNA를 추출하는 것이 중요하다. 유전자 발현을 분석하는데 있어서 유전자로부터 전사되어 생성된 RNA의 양과 구조를 규명하는 것이 필요하다.9. RT-PCR? RT-PCR이란 P.Seeburg(1986)에 의해 RNA를 찾고 분석하는데 도입된 방법으로 mRNA(messenger RNA)로부터 reverse transcription 과정을 통해 얻어진 cDNA(complementary DNA)를 PCR로 증폭하는 방법이다. 이러한 방법은 RNA 검사의 sensitivity를 높이고 소량의 RNA로부터 염기서열을 분석할 수 있게 하였다.? 반응조건 : RT-PCR은 통상적으로 다음 세 가지 반응단계로 이루어져 있다.① RNA 분리 과정 (Northern Blot을 하기 전에 시행해야 하는 동일한 과정이다)② cDNA 합성 과정(reverse transcription)③ PCR amplification (Genomic DNA로부터 특정 유전자 부위를 증폭시키는 과정과 같다)위의 세가지 과정으로 진행된다. mRNA로부터 reverse transcriptase를 이용하여 cDNA를 제조하는 방법에는 어떤 oligonucleotide를 primer로 사용하는가에 따라 세 가지 방법 즉,① Antisense primer(3' 쪽 유전자에 특이성을 지닌 primer)를 이용하여 특정 부위 cDNA 제조② Random hexamer를 이용하여 전체 mRNA에 상보적인 cDNA 제조③ Oligo dT primer를 이용하여 전체 mRNA에 상보적인 cDNA 제조가 있다.? PCR에 쓰이는 Taq DNA polymerase는 DNA를 template로 해서 DNA를 증폭하는 효소(DNA-dependent DNA polymerase)이므로 RNA로 부터 직접 증폭할 수 없다. 따라서 RNA를 template로 할 경우는 일단 DNA로 복사한 다음 증폭해야 한다. 그rRNA, tRNA 포함)가 모두 cDNA로 만들어진다.? 반응액의 조성(1) Mg농도 : MgCl에서 Mg는 dNTP와 복합체를 형성하여 효소의 실질적인 substrate를 이용한다. free Mg의 농도는 dNTP 같은 인온 결합 물질의 농도에 영향을 받고, 최적의 실험 결과를 위해서 적절한 MgCl의 농도를 사용해야 한다. 일반적으로 1.5mMd의 농도를 사용한다. Mg는 효소 활성에 영향을 미치고 dsDNA의 Tm값을 증가시키는 효과가 있다. 과다한 Mg는 primer의 비특이적 결합과 background를 증가시킨다.(2) dNTP의 농도 : dNTP의 4가지 요소들은 동일 농도를 사용해야 한다. dNTP의 mixture의 불균형은 polymerase의 fidelity를 감소시켜 error가 증가 될 수 있다. 또 dNTP stock은 thawing/freezing에 민감하여 3~5 차례만 반복하여도 활성이 감소하여 올바른 결과를 기대할 수 없다. 따라서 사용량에 맞게끔 적절하게 배분하는 게 좋다. 높은 dNTP의 농도는 free Mg농도를 감소시켜 효소의 반응을 방해하고, primer의 annealing을 감소시키게 한다.(3) RNasin : 일반적으로 RNA는 DNA를 다룰 때보다 훨씬 까다롭다. 그 이유는 RNA는 DNA보다 enzyme인 RNase에 의해 분해되기 쉽기 때문이다. 특히 RNase의 경우 DNase와 달리 매우 안정하여 열에 의해 끊어진다 하여도 그 활성을 잃지 않고 RNA를 분해하는 경우가 많다. RNase를 최대한 막기 위해 RNasin과 같은 RNase inhibitor를 사용하면 안심할 수 있다.(4) oligo dT : 시료 속에 포함 된 모든 mRNA로부터 cDNA를 얻고자 할 때 oligo dT primer를 사용한다. RT는 맨 먼저 transcriptase로 RNA를 complementary DNA (cDNA)로 역전사하는 것이다. 이때 쓰이는 primer는 downstream primer가 쓰인다. oligo 한다. annealing에 가장 적합한 온도와 시간은 primer의 염기 배열과 그 길이에 따라 결정되지만 일반적으로 55℃에서 30초~1분간 annealing한다.Annealing 온도를 높이면 promer-주형 DNA의 mismatch가 감소되어 반응 특이성이 높아진다. 그러나 혼합 primer 또는 mismatch를 가지는 primer를 사용할 경우는 37~45℃로 annealing 온도를 낮출 필요가 있다.③ 신장반응 (Extension) : 4종류의 기질(dNTP)이 공존하는 상태에서, DNA polymerase를 작용시켜 primer를 신장시킨다. 신장반응에 필요한 시간은 주형 DNA의 농도, 증폭단편의 크기, 반응온도에 따라 좌우되지만 일반적으로는 Thermus aquaticus(Taq) polymerase를 사용할 경우 72℃에서 30초~10분간 처리한다. Taq polymerase에 의한 DNA 합성속도를 고려하여 시간을 설정한다.④ Cycle 수 : PCR의 경우 n회의 cycle로 표적배열은 2n배가 되지만 실세로는 이보다 낮다. 효율이 저하되는 이유는 ① DNA polymerase의 실활 및 증폭단편(주형DNA)의 증가로 인한 효소 분자의 부족, ② 증폭단편간의 annealing 되는 속도가 빨라져서 primer의 anneal과 경합한다. ③ pyphosphate 축적으로 인한 효소 반응 저해 등이 일어날 수 있다. 일반적으로 25~ 35 cycle의 반응이 이루어지지만 증폭 산물이 증가되면 그 자신이 primer가 되어 2차적인 반응이 일어나기 쉬우므로 비특이적인 DNA의 양이 미량일 경우에는 일반적인 경우보다 cycle 수를 늘릴 수 있다.? 반응액의 조성(1) 내열성 DNA polymerase 수 종류의 내열성 DNA polymerase가 시판되고 있는데 반응에 사용하는 완충액의 조성이 다를 수 있으므로 주의가 필요하다. TaKaRa Raq을 사용할 때 DNA합성의 최적온도는 대개 70~80℃이고 그 합성 속도는 60nucleotid.

자연과학| 2008.05.17| 10페이지| 8,000원| 조회(2,810)

PCR, 분자생물학, RNA 추출

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분자생물학-플라스미드추출 레포트

1. Title : Plasmid DNA extraction4. Purpose : plasmid를 추출하는 방법에 대해 알아본다.5. Materials(1) Reagent : sol Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ, 80% ethanol(2) Instrument : centrifuge, vortex, binding column, pipette6. Method① overnight culture sample 1.5ml을 centrifuge(15000 rpm, 4 ℃, 10 min)한다.② 상등액을 버리고, ice-cold sol Ⅰ을 500㎕ 첨가한 후, pellet이 풀릴 때 까지vortexing한다.③ fresh sol Ⅱ 500㎕을 넣은 후, inverting을 한 후 실온에서 5분간 incubation한다.④ 두 개의 test tube에 똑같이 나눈다.⑤ ice-cold sol Ⅲ를 두 개의 test tube에 각각 350㎕ 넣은 후, inverting을 한 후,4℃에서 5분간 incubation한다.⑥ test tube 2개를 centrifuge(12000 rpm, 4℃, 10min)한다.⑦ test tube에 각각 binding column을 끼운 후, centrifuge(12000 rpm, 4℃, 1min)한다.⑧ 아래에 가라앉은 상등액을 버리고, 80% ethanol 700㎕ 넣은 후, centrifuge(13000 rpm, 4℃, 1min)한다.⑨ 10㎕의 elution buffer을 넣은 후 스며들도록 1분간 방치한다.⑩ 마지막으로 centrifuge(12000rpm, 4℃, 1min)한다.⑪ 다음 주 실험을 위해 -20℃에서 보관한다.7. Result? plasmid가 추출되었는지 전기영동을 하였지만, 전기영동의 결과가 깨져 확인 할 수없었다.8. Discussion(1) 실험 시 주의 사항① 정확한 pipette의 사용방법을 익힌다.② vortex와 centrifuge의 사용방법을 익힌다.③ 실험복을 꼭 착용해야 한다.(2) plasmid란?? 세균의 세포 내에 염색체와는 별개로 존재하면서 독자적으로 증식할 수 있는 DNA의 고리 모양인 유전자로 세균의 생존에 필수적인 것은 아니다. 유전자공학에서는 세균 내 플라스미드를 세포 밖으로 빼내고 제한효소로 끊은 뒤, 가령 사람의 인슐린을 만드는 데 관여하는 DNA 조각을 이에 끼워 맞춰 다시 세균의 세포 내로 돌려보내면 이종의 DNA 조각을 가진 재조합 플라스미드는 정상적으로 증식하고 세균이 분열할 때마다 인슐린을 생성하게 된다. 플라스미드에는 약제에 대한 저항성을 가진 내성인자(R인자), 세균의 자 웅을 결정하는 성결정인자(F인자) 등이 발견되고 있다. 세균의 생존에 플라스미드의 존 재가 필수적인 것이 아니며, 또 플라스미드는 다른 종의 세포 내에도 전달된다.이와 같이 플라스미드에 끼워 맞출 수 있는 DNA는 그 근본이 고등생물인 진핵세포의 것으로도 가능하기 때문에 사람이 생성하는 인슐린 · 인터페론 · 생장호르몬 등을 합성 하는 데 책임이 있는 DNA를 이용해서 재조합 플라스미드를 만들 수가 있다. 이와 같은 과정을 유전자재조합 DNA라고 한다.(3) sol Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ의 조성 및 역할은?? Solution I의 제조 : 50 mM glucose +25 mM Tris·Cl (pH 8.0) +10 mM EDTA☞ Solution I에는 EDTA가 있고 다음단계에서 lysozyme을 넣게 되면 세균의 cell wall 이 약해진다. EDTA는 magnesium ion을 chelate하여 그람음성균의 outer membrane이 온전치 못하게 하며 lysozyme은 그람양성균과 그람음성균의 cell wall의 peptidoglycan 을 녹인다. glucose 혹은 sucrose는 삼투압을 유지시켜 세포가 완전히 lysise되는 것을 막아 genomic DNA (plasmid와 chromosomal)가 한꺼번에 빠져나오는 것을 방지한다 (그렇게 되면 지나치게 많은 chromosomal DNA로 오염된다)? Solution Ⅱ의 제조 : 0.2N NaOH +1.0% SDS( Solution Ⅱ는 항상 신선하게 실험직전에 만들어 사용한다. )☞ SDS는 cell membrane에 부분적으로 '구멍'을 내서 chromosome은 그대로 있고 plasmid만 빠져나오게 한다. 높은 pH는 이중나선을 지탱해주는 수소결합을 망가뜨려 released DNA를 변성시키는데 CCC 형태인 plasmid DNA는 이때 완전히 망가지지 않 고 큰 chromosome만 완전한 변성이 일어난다. SDS는 단백질과 RNA와 안정한 침전물 을 만든다.? Solution Ⅲ의 제조 : 5M potassium acetate 60 ㎖ +Glacial acetic acid 11.5 ㎖ +DW 28.5 ㎖☞ NaOH는 pH를 12∼12.5로 만들어 주어 염색체 DNA, 단백질, plasmid를 denaturation시키며, SDS는 균체를 용해시키고 단백질을 변성시킨다.☞ 높은 농도의 salt와 초산에 의해 pH가 중성에 가까워지면 변성되었던 물질들이서서히 원상회복되는데 size가 큰 것 (염색체 DNA)들은 정확하게 회복되지 못하고 엉기게 되며 크기가 작은 플라스미드들은 다시 원래의 모양을 회복한다.☞ 순두부처럼 엉킨 것은 potassium dodecylsulfate(potassium과 sodium이 치환되어 생긴 불용성 물질)가 변성된 염색체 DNA와 단백질과 함께 불용성 복합체를 형성한 것이 다.☞ Sol Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ의 비율은 1:2:1.5이나 1:2:1.6까지도 가능하다. 1.6을 넣는 것은 pH를확실히 낮추어주는 효과가 나온다.? 남아있는 단백질을 완전히 제거할 경우 상등액과 동일한 양만큼 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀알콜 (25:24:1)포화용액을 넣는다.☞ mini prep의 경우는 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀알콜의 양이 동량이 아니어도충분히 단백질을 제거할 수 있다. 위의 경우 동량은 650 ㎕ 인데 이보다 1/3 이하를 써도 충분하다. 페놀은 단지 남아있는 단백질을 제거하는 것이므로 페놀량을 늘인다고DNA purity가 높아지는 것은 아니다.(4) 에탄올을 넣어주는 이유는?? 에탄올은 DNA와 작용하고 있는 물 분자를 빼앗아 물 분자에 대한 친화력을 낮추는 동시에 물 자체의 dielectric constant도 낮추어 DNA의 solubility를 떨어뜨린다. DNA 의 backbone에는 phosphate가 존재하므로 Na+ 이온을 첨가하여 전하를 중화시켜야만 DNA 의 침전이 쉽게 이루어진다.(5) plasmid 추출하는 다른 방법은?1) 소량의 플라스미드 DNA 분리① 알칼리 lysis법 (Mini prep)? 우리가 사용한 실험 방법.2) 다량의 DNA를 준비하는 방법 (Large prep.)① Plasmids 증폭? 1. 30 ㎖의 LB broth에 single colony의 균체를 접종한 다음 late-log phase까지배양한 다음 종균으로 사용한다.2. 500 ㎖ LB broth에 상기한 종균을 접종하고 37℃에서 3시간 정도 심하게 진탕배양한다.3. (Optional) Chloramphenicol을 최종 농도 170 ㎍/㎖이 되도록 첨가 한다.4. 37℃에서 12∼16시간 정도 심하게 진탕 배양한다.② SDS를 이용한 용균(lysis)? 1. 균체를 4℃에서 6,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 회수하고 50 mM Tris/HCl(pH 8.0)에 sucrose를 10% 농도로 녹인 용액 10 ㎖로 균체를 현탁한다.2. 신선하게 제조된 lysozyme (10 g/㎖ in 10 mM Tris/HCl, pH 8.0) 용액을 2 ㎖ 넣는다.3. 250 mM EDTA (pH 8.0)를 8 ㎖넣고 잘 섞어 준 다음 얼음 속에 10분간방치한다.4. 10% SDS를 4 ㎖ 넣고 잘 섞어 준다.5. 5M NaCl을 6 ㎖넣고 잘 섞어 준 다음 얼음속에 적어도 1시간 이상 방치한다.6. 4℃에서 20,000rpm으로 30분간 원심 분리하여 염색체 DNA와 debris를제거한다.7. 상층액을 취하여 동량의 phenol:chloroform 용액으로 한번 extraction하고chloroform으로 한 번 더 extraction한다.8. 상층액을 취해 250 ㎖의 원심분리용 튜브로 옮기고 2 배량의 에탄올을 첨가한다음 실온에 1∼2시간 방치한다.9. 4℃에서 10,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 상층액을 버리고 pellet을취한다.10. 70% 에탄올을 사용하여 pellet을 세척한 다음 ⑨와 동일하게 원심분리한다.11. Pellet을 건조시킨 다음 3 ㎖의 증류수나 TE buffer에 pellet을 완전히 녹인다.12. 좀 더 순수한 DNA를 얻고자 한다면 녹인 DNA 용액을 CsCl를 이용한 초원심분리 하면 된다.③ Alkali를 이용한 용균 (Large prep)? 1. 4℃에서 6,000 rpm으로 5분간 원심 분리하여 균체를 회수한 다음 Solution I(mini-prep 참조) 10 ㎖로 균체를 현탁 한다.2. Lysozyme (10 g/ ㎖ in Tris/HCl, pH 8.0) 1 ㎖을 첨가한다.3. Solution Ⅱ (mini-prep 참조)를 20 ㎖ 첨가한 다음 잘 혼합한다.4. 실온에 약 10분간 방치한다.5. Solution Ⅲ (mini-prep 참조)를 15 ㎖ 첨가하고 잘 섞어 준 다음 얼음속에 10 분간 방치한다. 얼음속에 방치하는 동안 염색체 DNA와 큰 분자량의 RNA, 단백질, membrane 등이 침전된다.6. 4℃에서 12,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 취한다. 이때 원심분리 가 완료되면 절대로 brake를 사용해 rotor를 세우지 않아야한다.7. 멸균된 깨끗한 가아제를 이용해 상층액을 여과하여 다른 멸균된 250 ㎖ 원심분 리용 튜브에 옮긴다.8. 상층액의 0.6배 부피의 isopropanol을 첨가하고 잘 섞어 준 다음 실온에 10분간 방치한다.

자연과학| 2008.05.17| 5페이지| 8,000원| 조회(870)

세포, 플라스미드, Plasmid DNA extracti

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말단소체와 텔로머라제

[ 텔로미어, telomere ]텔로미어telomere는 염색체 말단에 존재하면서 염색체의 손상이나 다른 염색체와의 결합을 방지하는 기능을 가지고 있다. 사람이 늙을수록 체세포의 거듭된 분열에 의해 염색체의 텔로미어의 길이가 필연적으로 짧아진다. 그러나 불멸세포, 암세포 및 배선세포germline cells는 거듭되는 분열에도 불구하고 텔로미어의 길이가 짧아지지 않고 텔로미어의 길이를 유지시켜주는 텔로머라제telomerase의 활성이 나타난다.가. 말단소체telomere와 텔로머라제telomere : 염색체의 말단 복제DNA 중합효소들은 오직 5′→3′방향으로만 프라이머를 신장시키기 때문에 선형 DNA 분자의 5′말단을 복사하는 것이 불가능하다. 결과적으로 진핵 세포에서 선형 염색체의 말단 서열을 복제하는데는 특별한 기전이 필요하다. 말단소체telomere라고 하는 이 서열은 단순한 순차반복배열(tandem repeats)로 구성되어 있다. 말단소체는 독특한 효소인 텔로머라제telomerase의 작용에 의해 복제 되는데, 이 효소는 DNA 주형이 없어도 말단 소체가 합성 되도록 촉매작용을 할 수 있다.텔로머라제는 DNA 중합효소의 한 종류인 역전사효소(reverse transcriptase)이다. 텔로머라제는 말단소체의 반복배열과 상보적인 주형 RNA를 자신의 효소 복합체 일부로 가지고 있고, 이 RNA 주형을 사용하여 말단 소체 반복배열을 다수 복사한다. 그래서 DNA 주형이 없어도 말단소체는 유지된다.텔로머라제의 작용 기전은 1985년에 원생동물인 Tetrahymena 연구에서 처음으로 밝혀졌다. 이 원생동물의 텔로머라제는 3′-AACCCCAAC- 5′서열이 들어있는 159개 뉴클ㄹ레오티드 길이의 RNA와 복합체로 되어있다. 이 서열은 Tetrahymena 말단소체 반복배열( 5′-TTGGGG- 3′)과 상보적이며 말단소체 DNA의 합성에 주형이 된다. 텔로머라제가 이 RNA를 주형으로 사용함으로써 새로 합성된 DNA는 3′말단(선도가닥)에 반복 단위가 하색체 DNA의 3′말단은 돌출(overhanging)한 단사로 남게 되는데, 진핵생물의 염색체 말단에서 이것은 고리를 형성할 수 있다.텔로머라제는 다양한 진핵생물에서 확인되었으며, Tetrahymena, 효모, 쥐 및 인간에서 텔로머라제 RNA를 만드는 유전자 클론이 얻어졌다. 각각의 텔로머라제 RNA는 그 생물의 말단소체 반복배열에 상보적인 서열을 가지고 있다.더욱이 텔로머라제 RNA의 돌연변이 유전자를 삽입한 효모는 염색체의 말단소체 반복배열에서 그에 상응하는 변화를 보였는데, 이는 진핵생물에서 염색체의 말단을 유지하는 텔로머라제의 기능을 직접적으로 증명해준 결과이다.나. telomerase의 활성 : telomere 복구에 대한 기작telomere 지역은 비암호화 지역으로 일정염기가 수없이 반복되어있는 형태를 보이게 된다.이러한 비암호화 지역은 선형 DNA에서 DNA polymerase의 특성상 primer를 필요로 하고, 생체 내에서는 RNA primer를 사용하기에 나타나는 말단의 축소현상(선형 DNA 주형의 5'말단에 RNA primer가 결합한 지역은 이것이 DNA로 대체되지 못하기 때문이다.)이 일어나는데, 이 때 telomere 지역의 이 염기들이 암호화 지역의 서열들을 보호해주며 대신 없어지는 역할을 하는 것이다.그러나 결국 이 telomere 지역도 무한대가 아니기 때문에 지속적인 분열시 없어지게 되고, 그렇게 되면 암호화 지역의 서열들은 손상을 입게 된다. (세포 노화의 기본 원리를 이것으로 설명하기도 한다.)이렇게 telomere 지역이 없어지는 것이 DNA에게 치명적인 손상을 줄 수 있기 때문에 세포는 이에 대한 복구 기작을 갖고 있는데, 이것이 telomerase의 활성이다.telomerase는 일종의 역전사효소로서 DNA사슬을 형성하게 된다.특이한 것은 이 효소는 자체가 주형인 RNA를 갖고 있어 이것을 주형으로 단일가닥의 DNA를 만든다는 것이다. 즉, 외부적으로 현상만을 보면 효소가 단일가닥 사슬을 그냥 형성하는 것으로 보이게 을 하여 이중가닥을 완성하여 telomere지역을 복구하게 된다. 위에서 말했듯이 telomere지역이 일정 사슬이 반복되는 형태를 띄는 이유는 결국 이 복구기작을 보면 쉽게 나타난다. telomerase의 주형이 일정가닥의 RNA이고, 이것이 반복되어 역전사가 되면서 DNA가 재생이 되는 것이기 때문이다.선형 DNA의 말단 보호는 이 telomere 외에 또 한 가지가 기여를 하는데, 말단의 한쪽만 남는 단일사슬가닥(RNA primer가 붙어 있다가 분해되어 없어져 단일가닥으로 남은 부분이다.)이 구조적인 루프를 형성한다는 것이다. 이로 인하여 말단이 자연적으로 변성되거나 분해되는 것이 어느 정도 억제가 된다.telomere 자체에 RNA를 가지고 있으며 그 RNA 는 DNA 말단과 상보적이다.reverse transcription 기능이 있어서 telomerase 의 RNA 를 주형으로 telomere의 3' 말단을 primer로 해서 DNA 를 합성한다.다음의 상보적인 염기서열까지 이동한다.telomerase 떨어지고 reverse transcription 에 의해 합성된 DNA 에 primer가 붙고 복제가 되지 않았던 자리(RNA primer가 붙었던 자리)를 합성할 수 있다.노화(senescence)와 관련되어 telomere의 primer 부분이 복제가 안되면 chromosome이 점점 짧아지고 그 만큼의 유전자가 상실된다. telomerase 활성의 저하가 원인이다.다. Telomerase model① Telomere 가설은 복제노화현상(replicative senescence)과 암세포 불멸화를 이해하는데 중요한 분자생물학적인 기작을 제공하고 있다.② 기작 : DNA polymerase는 복제 후 제거되는 RNA primer를 요구하기 때문에 DNA 복제가 계속됨에 따라 5`-말단부위의 손실이 생기게 되어 결국 telomere의 길이가 짧아지게 되는 염색체 말단 복제의 문제점(end-replication problem)을 나타내게 된다.진핵세포 말단복제 문제점이 나타나게 되어 telomere 길이가 짧아지게 되는 복제 노화 현상이 일어난다. 반면에 암세포에서는 억제되어 있던 telomerase가 활성화되어 telomere 길이가 일정하게 유지되며 세포불멸화를 획득하게 된다.Telomerase는 telomere 길이를 특이적으로 연장시킬 수 있는 효소로써 1985년 Carol Greider and Elizabeth Blackbarn에 의해 제창되었고, 원핵생물중 섬모충에서 telomerase의 존재가 확인되었다.Telomerase는 3'-AACCCCAAC-5' sequence를 포함하는 159-nucleotide-long RNA의 복합체이다. 이런 sequence는 telomeric repeat에 상보적으로 연결되어 있고 telomeric DNA의 합성의 template로써 제공되어진다.Telomeric DNA는 새롭게 합성된 선도가닥 위의 돌출된 3'end를 가진 단순 반복 서열이다. Telomerase는 자신의 RNA 분자를 날라와 효소 복합체처럼 telomeric DNA에 상보적 결합을 한다. telomeric DNA의 돌출된 말단은 RNA에 연결되고 한 번 반복된 unit에 의해 선도가닥확장의 주형으로서 제공된다.라. 텔로머라제와 노화1988년 이후 테트라하이메나 이외의 섬모충과 효모, 개구리, 쥐에서 텔로머라제를 발견하였으며, 1989년에는 예일 대학의 모린 박사에 의해 배양기에서 증식되는 인간의 암세포에서 최초로 텔로머라제를 발견하였다.1990년 블랙번 박사등은 텔로머라제가 변형된 것은 텔로미어가 점점 짧아져 결국에는 세포가 죽게됨을 확인하였다. 이러한 사실은 효모를 대상으로 한 실험에서도 확인되었다. 그러나 테트라하이메나와 효모에 비해 훨씬 복잡한 인간에게는 놀랍게도 텔로머라제가 없다. 이러한 사실은 1980년대 말에 필라델피아의 연구자 그룹이 25년 전부터 해오던 연구에 참여하면서 발견하였다.이러한 사실들로 보건데 인간의 세포는 텔로미어 단위체의 길이가 짧아지는 정도로부터 복제 횟수를 것이다.세포들은 대개 인간 수명이 다할 때까지 필요한 횟수보다는 더 분열할 수 있다. 그렇지만 노화된 인체의 기능은 때때로 일부 세포의 노화에 의해 저하되기도 한다. 예를 들어 상처는 새로운 피부조직을 만들 수 있는 세포의 수가 감소하여 치유가 늦어질 수 있으며, 백혈구 수의 감소는 노화와 관계된 면역성의 저하에 한 원인이 될 수 있다. 또한 동맥 경화증은 대게 혈관 벽이 손상되었을 때 발생하는 것으로 알려져 있다. 반복적으로 손상되는 부분의 세포가 복제능력을 잃어 손상된 상태가 지속되면 동맥경화가 시작된다고 볼 수 있다.마. 암과의 관련성일부 연구자들은 텔로머라제가 없는 세포에서 복제능력을 상실하게 되는 것은 노화를 위한 것이 아니라 암의 발생을 억제하는 수단이 아닌가 생각하고 있다. 암은 여러 유전자에 돌연변이가 일어나 정상적인 복제와 이동에 대한 통제를 벗어남으로써 발생한다. 세포가 통제없이 무한히 증식하면 주변의 조직에 침범하여 손상을 주게 된다. 일부는 여기에서 떨어져나와 다른 부분으로 이동하여 새로 암 조직을 생성하기도 한다.이론적으로 텔로머라제가 결핍된 세포는 계속적으로 분화하면서 텔로미어가 사라지고, 결국 그 세포는 없어지지만, 암세포가 텔로머라제를 만들면 텔로미어를 계속 보유하고 무한하게 분열할 수 있다. 1990년대에 텔로머라제가 암에 중요한 역할을 함이 알려졌지만, 최근까지 그러한 증거는 밝혀진바 없고, 1994년 텔로머라제가 실험실내의 암세포 균주와 인간 난소암에서 활동함이 밝혀졌다.그 후 텔로머라제는 101가지의 암세포 가운데 90가지에서 발견되었고, 50가지의 정상세포에서는 하나도 발견되지 않았다. 이러한 증거들이 나타나기 이전부터 과학자들은 암 발병에 관한 텔로머라제의 역할을 연구했는데, 아마도 성장의 제어 장치가 사라진 이후에 작용하는 것으로 보였고, 인체 종양의 텔로미어는 정상세포의 경우보다 작은 것으로 나타났다.할리 박사는 암세포의 텔로미어가 왜 그렇게 작은지를 설명하기 위해서 세포 분열을 정지시키는 신호를 마비시키는 바이러스

자연과학| 2008.12.17| 9페이지| 8,000원| 조회(699)

텔로미어, 말단소체, 멜로미어라제

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