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미생물의 보존법

Ⅰ. Subject실험 5. 미생물의 보존법2006. 04. 10Ⅱ. Purpose미생물을 취급할 때에는 균주를 변이 없이 장기간 보존하는 것이 실험결과의 재현을 위해서 매우 중요하다고 할 수 있다. 하지만 미생물의 종류, 시험목적 등에 따라 균주의 보존법은 각각 다르다. 보존법에는 일정 기간마다 옮겨 심는 계대배양법과 물 또는 유동파라핀 등으로 산소의 공급을 막는 방법, 동결?건조에 의해서 미생물의 대사 활성을 억제시키거나 정지시키는 방법으로 크게 나눠진다. 실험 5에서는 이러한 보존법에 대해 알아보고 각각의 보존법에 대해 익히는 실험을 하게 될 것이다.Ⅲ. Introduction1. 계대배양법계대배양법은 일정 기간마다 새로운 배지에 옮겨 심어 배양하면서 보존하는 방법이다. 이 방법은 오래 전부터 이루어지고 있는 기본적인 보존법이나, 배지가 건조해지기 때문에 수개월에 한 번씩 이식해야하는 번거러움과 보존 중에 잡균에 의한 오염의 위험, 그리고 이식을 반복함으로서 돌연변이에 의해 병원력, 포자형석 능력의 저하 등의 돌연변이를 일으키기 쉬운 결점이 있다.세균은 보통 한천(Nutrient agar), 감자한천 혹은 가용 pepton 감자한천 사면배지에 배양하나, 이들 배지의 고층에 천자배양하여, 수일 후에 5～10℃의 방으로 옮겨 보존한다. 사상균은 보통 감자한천 사면에 배양하여 균총이 사면 전체에 퍼진 때에 5～10℃의 방으로 옮겨 보존한다.보존온도는 보통 5～10℃가 알맞으나 균의 종류에 따라서는 실온이 알맞은 것도 있다. 또 보존실은 습도가 높으면 솜마개에 곰팡이가 자라기 때문에 건조상태를 유지해야 하며, 솜마개 대신 고무마개 또는 실리콘 마개를 사용하면 건조나 곰팡이를 막을 수가 있으며 이식회수도 1년에 1회 정도로 줄일 수 있다. 보존 중에 응애가 솜마개를 통해서 들어가 실패하는 경우를 대비하여 이중 고무마개나 실리콘 마개를 하여 응애의 침입을 방지하는 것이 좋다.2. 유동파라핀 중층법병원균이 배양되고 있는 시험관에 유동 파라핀을 넣어 균에 산소 공급은 차단하고 균의 대사 활성을 억제시켜 보존하는 것인데, 세균, 방선균, 사상균의 보존에 이용되고 있다. 특히 세균의 보존에 널리 이용되고 있다. 또 사상균에 대해서도 좋은 결과를 나타내고 있다.사면 혹은 고층배지에 이식하고, 균이 전면에 생장하고 있을 때에 살균한 유동파라핀을 피펫으로 무균적으로 배양상에 중층을 만든다. 깊이는 사면배지에는 배지의 상단부터, 고층배지에는 배지표면에서 1㎝ 정도의 높이로 한다. 중층한 후에는 5～10℃가 유지되는 장소에 보존하나, 균의 종류에 따라서는 실온이 알맞은 것도 있다. 보통 1년～수년간은 보존할 수 있다.유동 파라핀은 질이 좋은 것(중성, 비중 0.8～0.9)을 택하고 120℃에서 1～2시간 고압 살균한 후 110～170℃에서 1～2시간 건열하여 수분을 증발시킨 후 사용한다.3. 물 보존법살균수 속에 세균 혹은 사상균을 현탁시켜서 실온에 보존하는 것이다. 방선균, 효모, 사상균의 대부분은 증류수로 현탁하여 두면 실온에서 수 년간 보존할 수 있다고 보고되어 있다. 널리 쓰이고 있지 않으나 식물의 풋마름병균(Pseudomonas solanacearum)의 보존법에 적용되어 좋은 결과를 얻고 있다.세균의 사면배지에 6～7㎖의 살균 증류수를 넣고, 잘 분산시켜 현탁액을 만든 후, 이것은 살균 시험관에 옮겨 밀봉하고 실온에서 보존한다.4. 동결 보존법동결 보존법은 동결에 의해서 세포의 활동을 정지시켜 보존하는 것으로서 냉동실 보존법, 드라이아이스 보존법, 액체질소 보존법 등이 있다.① 냉동실 보존법(동결법)건열 살균한 소시험관(15× 15㎚)에 분산매(스킴 밀크 10g, 글루타민산 나트륨 1.5g, 증류수 100㎖) 2㎖를 분주하고 121℃에서 15분간 고압 살균한다. 공시세균을 사면배지 위에 1～2일간 적온에서 배양하고 1사면분의 균체를 백금이로 긁어내서 분산매 속으로 옮기고 보텍스 믹서(Votex mixer)로 가볍게 흔든 후 솜마개를 한다. 솜마개를 파라필름(Parafilm)으로 싸서 냉동실 안에 보존한다.파라필름은 보존 중에 수분이 증발하는 것을 막기 위해서 사용한다. 사용할 때에 23～25℃의 물에 담가서 녹이며 실온이 높을 때에는 그대로 두어도 된다. 녹인 세균 현탁액을 1～2 백금이 취하여 배지에 옮겨 배양한다. 사용 후에는 시험관을 냉동실에 넣어 다시 동결시켜 보존한다. 세균의 종류에 따라서는 생존율이 다르나 세균에 따라서는 20여 회 반복해서 사용할 수 있다는 보고도 있다.② 액체 질소 보존법액체 질소에 의한 초저온(-196℃) 처리는 녹병균 포자의 반영구적 보존법으로서 널리 사용되고 있다. 녹병균 포자는 앰플에 봉입하면 깨질 위험성이 있으므로 플라스틱 소관을 사용하는 것이 좋다.채집한 포자를 플라스틱제 소관에 넣고 소관에 붙어 있는 봉합제로 소관의 아래위를 막은 다음 봉합기로 밀폐시켜 액체 질소 용기의 작은 통에 넣어 보존한다.접종을 위해서 액체 질소 용기에서 꺼낸 플라스틱 소관은 40～50℃의 온탕에 2～5분간 담갔다가 광유로 포자 현탁액을 만들어, 기주에 분무 접종한다.5. 동결 건조 보존법세포를 동결하여 대사 활성을 완전히 정지시킨 다음 진공상태로 얼려 물을 승화에 의하여 없애고, 진공상태로 보존한다. 동결?건조 과정에서 세포는 여러 가지 장애를 받으므로 이것을 최소한으로 막기 위해서는 적당한 보호제의 존재 아래에서 동결 건조가 이루어진다. 이 방법은 세균의 보존법으로서는 가장 널리 이용되고 있으나 사상균이나 효모에 있어서는 아직 시험 단계이다.공시세균을 한천사면(보통 감자한천, Nutrient agar)배지 등에 배양하고 대수기～정상기에 성장하는 균을 쓴다. 분산매로서는 스킴 밀크 10g, 글루타민 나트륨 1g을100㎖의 증류수에 녹여 사용한다. 분산매 약 10㎖를 시험관에 분주하고 솜마개 혹은 실리콘마개를 해서 121℃에서 20분간 고압 멸균하고 , 30℃에서 2～3일간 두어 멸균을 확인한 후에 사용한다.

공학/기술| 2009.01.03| 3페이지| 1,500원| 조회(1,271)

계대배양법, 유동파라핀 중층법, 물 보존법, 동결 보존법, 동결 건조 보존법

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닌히드린방법 결과 및 고찰

나) 실험 재료와 방법1. 소모성 재료① 글리신 0.1% 수용액② Ninhydrin Reagent Solution : Ninhydrin : 0.35g Add ethanol to 100㎖2. 실험 방법① 시료와 Ninhydrin 용액을 혼합한다. paraffinfilm으로 Test tube를 막는다.② 약하게 voltexing하고 100℃에서 5분간 끓인다.③ 상온에서 식히고 A에서 측정한다.④ 각 표준용액의 농도를 구한다.⑤ 표준검량선을 그린다.⑥ 표준검량선에 의해서 미지시료의 농도를 구한다.다) 실험 결과Tube시료시료(ml)증류수닌히드린농도(mg/ml)A57010.1%글리신02.50.50020.1%글리신0.22.30.50.0040.21630.1%글리신0.42.10.50.0080.35740.1%글리신0.61.90.50.0120.50950.1%글리신0.81.70.50.0160.54660.1%글리신11.50.50.020.63370.1%글리신1.21.30.50.0240.6458미지시료11.50.50.0110.3789미지시료11.50.50.0070.29210미지시료11.50.50.0090.336▶계산식- Tube 8 미지시료 : 0.378 = 26.411x + 0.0982∴x = (0.378 - 0.0982) / 26.411 = 0.011㎎/㎖- Tube 9 미지시료 : 0.292 = 26.411x + 0.0982∴x = (0.292 - 0.0982) / 26.411 = 0.007㎎/㎖- Tube 10 미지시료 : 0.336 = 26.411x + 0.0982∴x = (0.336 - 0.0982) / 26.411 = 0.009㎎/㎖라) 고찰이번 실험은 아미노산의 정성 ,정량 실험을 하는 것이다. 생물체를 건조시키면 수분이 빠져나가 탄소, 산소 그리고 수소가 서로 결합되어 형성된 단백질, 탄수화물, 지방 그리고 핵산만 남는다. 이것들이 서로 결합하여 생명체의 기본 단위인 세포를 형성하는 것이다. 이 중에서 단백질 분자는 분자량이 인슐린과 같이 5,000에서부터 담배모자이크 단백질과 같은 4,000만에 이르는 것도 있다. 단백질은 아미노산이 펩티드결합에 의하여 서로 결합되어 있는데 경우에 따라 탄수화물, 지방, 핵산 그리고 햄 등이 결합하여 복합 단백질을 이루고 있다. 단백질은 20여 가지의 아미노산들이 무한히 다양하게 결합되어 있고 단백질의 크기, 구조 그리고 물리적 특성의 다양성을 보여주고 있기 때문에 각 단백질 분자는 각각 특수한 기능에 맞는 화학적 성질을 갖고 있는 것이다. 따라서 단백질처럼 생체의 여러 가지 기능을 수행 할 수 있는 다양성을 지니고 있는 물질은 없다. 특히 단백질은 생체막이나 세포기관의 중요한 부분, 효소, 호르몬 그리고 항체 등을 형성하고 있다. 이와 같은 생물학적 중요성 때문에 단백질을 잘 알아두어야 한다.아미노산은 한 분자 안에 아미노기와 카르복시기를 가지는 유기화합물이다. 단백질을 완전히 가수분해하면 암모니아와 유리 아미노산이 생성되는데, 아미노산은 모든 생명현상을 관장하고 있는 단백질의 기본 구성단위이다. 단백질에서 분리된 아미노산은 대개 아미노기와 카르복시기가 같은 탄소원자에 결합하여 R-CHNH2-COOH의 일반식으로 나타낼 수 있는 α-아미노산이다(R은 지방족·방향족·헤테로 고리의 치환기를 나타낸다). 이 밖에 아미노기가 차례로 이웃하는 탄소원자로 옮겨감에 따라 β-아미노산·-아미노산·δ-아미노산 등으로 부른다. 흔히 아미노산이라고 하면 α-아미노산을 가리킨다.처음 발견된 아미노산은 아스파라긴으로 1806년 프랑스의 과학자 보클랭과 로비케가 아스파라거스의 싹에서 새로운 결정을 분리시켜, 이것을 아스파라긴이라고 명명하였다. 단백질의 가수분해물에서 처음으로 아미노산을 분리시킨 사람은 브라코노이다. 그는 1820년 아교·고기·양털 등을 황산으로 분해하여, 아교로부터는 글리신을, 고기와 양털로부터는 류신을 단리시켰다. 그 후, 1935년 W.C.로즈의 트레오닌 발견에 이르기까지 약 100년에 걸쳐 22종의 주요 아미노산이 발견되었다. 이 밖에 자연계로부터는 펩티드와 특수한 단백질의 구성성분으로서 각종 아미노산이 발견됨으로써 그 수는 약 80종 이상에 이르고 있다.아미노산은 글리신을 제외하고 일반적으로 광학이성질체를 가지는데, 단백질 속에 있는 모든 아미노산은 α-탄소에 관하여 카르복시기와 아미노기의 배치 관계가 같고 L형이다. 그러나 D-아미노산도 또한 천연으로 존재하며, 미생물의 세포벽에 많이 함유되어 있다. D-아미노산을 함유하는 펩티드는 강한 항균작용 또는 독성을 보이는 것이 많은데, 그라미시딘이나 바시트라신 같은 폴리펩티드성 항생물질은 그 한 예이다.아미노산의 중심 탄소는 네 개의 가지에 각각 다른 잔기를 가지고 있어서(glycine 제외) 거울상과 같은 관계를 갖는다. 이런 거울상을 손대칭이라하며 중심 탄소를 입체중심이 된다(α-carbon). 아미노산은 하나 이상의 입체중심을 가지고 있어서 입체이성질체를 만든다. 아미노산의 위치에 따라 입체 중심의 왼쪽에 아미노산이 있으면 L-form (Laevus, 왼쪽), 오른쪽에 아미노산이 있으면 D-form (Devor, 오른쪽)이라한다. 자연 상태에서 아미노산은 L-form으로 존재한다.단백질을 구성하는 주요 아미노산은 글리신·알라닌·발린·류신·이소류신·트레오닌·세린 ·시스테인·시스틴·메티오닌·아스파르트산·아스파라긴·글루탐산·디요드티로신·리신·아르기닌·히스티딘·페닐알라닌·티로신·트립토판·프롤린·옥시프롤린의 22종이다. 이밖에 자연계에 존재하는 비교적 중요한 아미노산으로는 β-알라닌·-아미노부티르산·오르니틴·시트룰린·호모세린·트리요드티로신·티록신·디옥시페닐알라닌이 있다.일반적으로 아미노산은 백색 결정으로 비교적 안정된 물질이며, 녹는점이 높으나 분해가 수반되어 명확한 녹는점을 알기는 어렵다. 시스테인·티로신은 물에 잘 녹지 않으나, 프롤린·히드록시프롤린은 물에 아주 잘 녹지만 알코올에는 잘 녹지 않는다. 그 이외의 것은 일반적으로 물에 잘 녹는다. 녹는점이 명확하지 않은 점과 극성용매에 대해서 보이는 아미노산의 난용성은 아미노산이 양쪽성 이온이라는 증거이다. 아미노산은 알칼리를 첨가하면 수소이온을 잃고, 산을 첨가하면 수소이온을 포착한다. 그 때문에 아미노산의 수용액은 pH의 변화에 저항하는 완충작용을 가진다. 아미노산은 카르복시기와 아미노기에 특유한 모든 반응 외에, 각 분자 내에 있는 반응기에 특유한 반응을 보인다. 닌히드린반응

공학/기술| 2009.01.01| 4페이지| 1,500원| 조회(1,085)

정성, 아미노산, 닌히드린, 정량

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TLC에 의한 탄수화물의 분석 예비 평가A좋아요

실험 6- TLC에 의한 탄수화물의 분석가) 실험 이론과 원칙원리박층 크로마토그래피(TLC)는 탄수화물 혼합물들을 빠르게 분석할 수 있는 기술로서 매우 유용하게 사용되는 간단하고 신속한 방법이다. 많은 종류의 고정상과 수많은 용매가 함께 광범위한 탄수화물들의 분리를 위한 검출 방법을 위해 사용되어 왔다. 그러나 단일 시스템은 가능한 모든 탄수화물 혼합물을 분리할 수 없기 때문에 유용하지 않은 것은 분명하다. 가장 좋은 방법은 적합한 시스템이 발견될 때까지 가능성이 있는 시스템을 사용해 보는 것이다.미세결정상의 셀룰로오스와 실리카겔은 고정상으로 특히 유용하게 쓰인다. 셀룰로오스는 본질적으로 액체-액체 분할에 의해 분리되며 당은 이동상과 물이 결합된 셀룰로오스 사이에 분포된다. 여기서 물이 결합된 셀룰로오스는 용리액(eluent)에서 당의 용해도에 의존하며 혼합물이나 고정상의 구조에 쉽게 들어갈 수 있다. 후자의 능력은 복합체의 크기와 입체적 배열에 의해 결정된다. 일반적으로 셀룰로오스 TLC는 용출시간이 짧고 감도가 증가된다는 장점에 있어서 종이 크로마토그래피와 같은 특징을 갖는다.실리카겔은 흡착제가 첨가된다는 것을 제외하고는 셀룰로오스와 같은 원리에 의해 분리한다. 종종 무리염류들(예를 들어 인산, 아황산, 구연산)을 담가 겔을 포화시킨 다음 판을 코팅하고 건조시키거나 슬러리 용매에 넣는다. 이런 경우에 무기염류의 선택은 대체적으로 탄수화물 분석에 영향을 미친다. 또한, 무기염류의 선택은 그것의 농도와 이온형태에 의해 결정된다. 사용할 때에는 용리액의 구성에 따라 염의 구배가 이루어진다.박층 판은 실험실에서 만들 수도 있고 고정상으로서 코팅된 셀룰로오스, 실리카겔 또는 포화실리카겔을 사용할 수 있다. 실험실에서 제작한 박층판은 100℃ 오븐에서 건조시켜서 사용할 때까지 건조기에 보관해야 한다. 일반적으로 미리 코팅되어 있는 판이 만들어 사용하는 판보다 더 효과적이다. 왜냐하면 그것은 뛰어난 재생력과 보호 시약에 대한 높은 민감도를 갖기 때문이다. 그리고 미리 코팅된 판은 강한 결합력 때문에 여러 번 전개시킬 수 있고 표면의 손상 없이 시약을 사용할 수 있다. 간단하고 저렴하게 현미경 슬라이드에 코팅하여 깨끗하게 건조시킨 후 뚜껑이 있는 비커에서 전개시킨다.만일 매우 단순한 당 혼합물 분리를 위한 TLC를 하기 위해서 적당한 용매를 선택하는 것은 쉬운 일이 아니다. 초기 선택은 참조된 용매의 시스템들 사이에서 의거한다. 그러나 만일 이러한 모든 것들이 불충분하다고 판명되면 문헌을 참조하여 적합한 용매계를 선택할 수 있다. 그러나 주목할 것은 1차원적 전개에서는 최적의 조건에서 최고 약 10개의 탄수화물의 분석되지만, 만일 적당한 2차원 시스템이 적용된다지 않는다면 탄수화물의 상대적 R값이 약 5% 이내에 분해될 수 없다. 용매는 일반적으로 2차, 3차, 4차 용매이고 항상 부피의 10～20%정도의 수용액을 포함한다. 혼합물의 구성에 있어서 작은 변화도 탄수화물의 상대적 이동과 분리능에 예상치 못한 결과가 초래된다. 예를들면 전개순이 그루코오스, 만노오스, 갈락토오스의 순서가 변할 수 있다. 그러므로 특히 실험실에서는 R또는 R글루코오스 값이 항상 일정한 변수로 간주되지 않는다. 이러한 R나 R글루코오스 값은 온도, 습도, 코팅 변화한다. 따라서 문헌의 값들은 단지 참고 목적으로 사용될 수 있다. 일반적으로 만일 탄수화물이 더욱 소수성이거나 분자량이 더 작다면 더 높은 R값을 갖는다. 그러나 이런 규칙에 예외적인 것들도 많다.용매계의 예1. 에틸아세테이트/피리딘/물 - 에틸아세테이트 100㎖, 피리딘 35㎖, 물 25㎖를 혼합한다. 이 용매는 세 개의 연속적인 전개를 사용한 셀룰로오스에서 헥소오스, 디옥시헥소오스, 이당류의 TLC와 종이 크로마토그래피(PC) 분석에 적당하다.2. 부탄올/피리딘/0.1M HCl - n-부탄올 50㎖, 피리딘 30㎖, 0.1M HCl 20㎖(물 114㎖에 농염산 0.1㎖를 넣어서 만든다)를 혼합한다. 이 용매는 당단백질의 가수분해에서 얻어진 단당류인 갈락토오스, 만노오스, 푸코오스, 글루코사민, 갈락토사민을 분리하기 위해 셀룰로오스에서 TLC와 PC를 사용하는 것이 적당하다.3. 프름산/에틸메틸케톤/3-부탄올/물 - 포름산 30㎖, 에틸메틸케톤(2-부탄올), 3-부탄올 80㎖, 물 30㎖를 혼합한다. 이 용매는 요산을 포함한 식물 추출물에서 얻어낸 탄수화물의 분석을 위해 셀룰로오스에서 TLC와 PC를 사용하는 것이 적당하다.4. 아세토니트릴/물 - 아세토니트릴(HPLC grade) 85㎖, 물 15㎖를 혼합한다. 이 용매는 실리카판 위에서 다음의 연속적인 3단계를 거치며 사용하기에 적합하다. 이 실리카판은 10M sodium meta-bisul-fite를 판 위에 뿌린 다음 pH 4.8인 0.009M의 구연산나트륨 완충용액을 뿌리고 말린다. 마지막으로 1시간 동안 100℃에서 말리고 사용하기 전까지 건조한 상태를 유지시킨다.5. 2-프로판올/아세톤/0.1M 젖산 - 물 20㎖에 젖산 148㎎을 용해시킨다. 여기에 2-프로판올 40㎖와 아세톤 40㎖를 첨가한다. 이 용매 시스템은 인산을 포함시킨 실리카겔 판에서 사용하는 것이 적당하다. 이 시스템은 요소와 프라스마(즉, 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스)의 인산적 분석에서 얻어진 많은 보통 이상의 구성요소를 분리한다. 포화된 판은 다음과 같이 얻는다.① 인산염으로 활성화된 미리 입혀진 실리카겔 판을 준비한다.② 0.5M 인산수소나트륨(NaHPO) 또는 인산수소칼륨(KHPO) 코팅 실리카겔 현택액을 준비한다.(물 250㎖에 인산수소나트륨(NaHPO2HO) 19.5g을 용해시킨다).③ 미리 입혀진 판에 인산수소나트륨(NaHPO) 0.5M을 축축할 정도로 뿌린 다음 건조시킨다.6. n-부탄올/피리딘/물 - n-부탄올 100㎖, 피리딘 30㎖, 물 30㎖를 혼합한다. 이 용매는 당단백질에서 얻은 탄수화물의 PC분석에 적당하다. 실온에서 약 25시간 전개시킨다. 크로마토그램은 검출시약 사용 전에 약 4시간 동안(단지 n-부탄올의 희미한 흔적만 남도록)후드 내에서 건조시킨다.7. n-부탄올/n-프로판올/0.1M HCl - 이 용액은 셀룰로오스에서 당단백질로부터 얻은 시알산(sialic acid)의 PC와 TLC 분석에 적당하다.검출방법탄수화물의 검출을 위해 많은 분무용 시약이 사용되고 있다. 여기에 제시한 두 가지(A,B)는 대부분의 분석에 사용된다. 그것들은 탄수화물의 종류에 따라 각기 다른 색깔로 나타난다. 그리고 그것들은 혼합물에서 구성성분의 확인과 확인되지 않은 탄수화물의 겹쳐짐에 있어서 유용하다.검출시약1. 디페닐아민/ 아닐린/ 인산① 분무용 시약 용액을 준비한다.- 아세톤80ml에 디페닐아민을 4g을 용해시킨 다음 전체 용액이 100ml가 될 때까지 아세톤을 더 넣는다.- 아세톤 96ml에 아닐린 4ml을 넣어 잘 섞는다.- 85% 인산 20ml를 준비한다.사용하기 전에 위의 세가지 용액을 혼합한다.② 이 혼합액을 판에 뿌려 공기 중에서 건조시킨 후 10분 동안 100℃로 가열한다. 2~4분 후면 색이 나타난다. 이 분무 시약은 알도오스, 케토오스, 디옥시당, 올리고당, 요산에 사용할 수 있다. 그리고 분무용 시약은 셀룰로오스와 실리카 박층판에 사용된다.③ PC를 에틸아세테이트 25ml에 디페닐아민 0.15g을 용해시킨 시약에 담근다. 여기에 아닐린 08ml와 에틸아세테이트 75ml를 첨가한다. 마지막으로, 물 1.0ml와 농인산 10ml를 첨가한다. 시약은 사용하기 바로 전에 만든다.④ 건조된 크로마토그램을 시약에 넣어 적시고 건조시킨 다음 배경색이 희미한 회색이 될 때까지 95~100℃ 열로 가열한다. 분무용 시약과 비슷한 결과를 주는 일반적인 목적의 좋은 시약이다.2. 나프토레소르시놀/ 에탄올/ 황산① 95% 에탄올 100ml에 나프토레소르시놀(나프탈렌-1,3-디올)0.2g을 녹여 용액 A를 준비한다. 배경색을 엷게 하기 위해서 디페닐아민 0.4g을 첨가한다.② 사용하기 바로 전에 9ml 용액 A에 농황산 40ml를 조심스럽게 첨가하여 분무 시약을 만든다.③ 준비한 시약을 판에 뿌린 다음 100~150℃에서 5분간 가열한다.④ 이러한 분무 시약은 알도오스, 케토오스, 요산, 디옥시당, 글리코사이드, 올리고당에 사용된다. 이것은 실리카 얇은층 판에만 사용할 수 있다. 이것은 탄수화물 종류마다 구별되는 다양한 색을 갖는다. 알도오스는 파랑색 또는 보라색 점으로 나타나고 케토오스는 분홍색 또는 붉은색 점으로, 요산은 독특한 푸른색 점으로 나타난다. 민감도는 0.1㎍(L-소르보오스)와 4㎍(D-글루코오스)사이이다.다당류 분석의 일반적 방법다당류는 단당류가 글리코시드 결합에 의해서 이루어진 고분자로 크기도 다양하고 선형, 가지형, 환상형, 또는 이러한 모양의 조합으로 구성되어 있다. 또한, 단일한 종류의 당으로 이루어진 호모다당과 두 개이상의 서로 다른 당으로 구성된 헤테로다당으로 나누어진다. 자연계에 존재하는 다당류는 일반적으로 생체의 골격을 유지하는 것이 주기능이지만 당의 조성과 구조에 따라 화학적, 생화학적 성질이 달라질 수 있다. 예를 들어 수산화에틸전분이나 베타 글루칸황산은 치환기의 분포 양상에 의해서 생물학적 성질이 영향을 받는다. 따라서 다당류와 그 유도체들의 구조적 분석은 매우 복잡한 일이다. 요오드와의 정성반응이 균일다당류(전분-푸른색, 글로코겐 및 덱스트린-적색, 셀룰로오스 및 이눌린-무색)의 유무를 알려줄 수 있으나, 다당류의 정량은 우선 가수분해시켜 각 구성당을 유리시키는 것이다. 이것은 보통 60℃에서 농염산으로 30분간 가수분해시켜 적당한 방법으로 단당류를 정량한다. 그러나 이러한 방법은 당의 부분적인 파괴를 가져올 수 있기 때문에 초산이나 약산(0.1~2.0M)이 사용되곤 한다. 대표적인 방법으로 메타놀리시스(methanolysis)는 휘발성의 메틸글리코시드를 만들어 가스-크로마토그래피에 의해 분석을 할 수 있다. 효소의 기질에 대한 특이성을 이용하여 올리고당이나 다당류의 구조 분석을 쉽게 한다. 때때로 다당류는 비탄수화물이 공존할 수 있기 때문에 우선 제거해야 한다.

자연과학| 2009.01.01| 4페이지| 1,500원| 조회(822)

TLC, 탄수화물, 분리법

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미생물의 순수분리,배양 및 접종

2006. 04. 03Ⅰ. Subject미생물의 순수분리?배양 및 접종Ⅱ. Purpose미생물의 연구에 있어서 미생물을 순수하게 분리, 배양하는 일이 가장 중요하다. 목적으로 하는 균을 거의 순수하게 얻을 수 있으나 대개의 경우는 목적하지 않는 다른 미생물과 혼재하고 있다. 이럴 경우 잡균으로부터 분리를 해야 하는데 순수배양을 얻기 위해 분리배양법을 사용한다. 그래서 이번 실험에서는 미생물의 순수분리와 배양법에 대해 알아보고 그 실험을 직접하는 데 목적이 있다.Ⅲ. Introduction순수분리 및 배양법(Isolation and pure culture method)미생물은 최적의 영양물질을 함유하고, 최적의 환경조건(온도, pH, 호기성, 또는 혐기성 등)하에서 생장 증식한다. 그러나 같은 종류의 미생물이 같은 장소에서 생육하고 있는 것은 드물기 때문에 이것만을 순수 분리하여야 한다.1. 집적배양(Enrichment culture)어떤 시료에서 목적으로 하는 미생물은 혼재하고 있는 다른 미생물보다 빨리 다량으로 얻은 후에 순수분리를 한다. 목적하는 미생물에 적합한 배지에 시료의 소량(멸균수로 희석한 것)을 넣고, 적온을 유지하여 목적하는 미생물의 생장번식을 왕성하게 하고 잡균을 억제한다.① 집적배양용 배지목적하는 미생물과 해당 배지를 예로 들면 다음과 같다.일반세균 : 육즙펩톤수효모균 : 맥아즙사상균(곰팡이) : 국즙, 맥아즙② 도태배양법미생물의 특별한 성질을 이용하여 목적으로 하는 미생물만을 생장번식 시킨다.a. 가열에 의한 배양법시료를 배지에 넣고 일정시간 열처리(Heat shock, 80℃에서 15분간 처리)하면, 아포가 없는 균체, 내열성이 적은 아포 등은 죽고 목적균의 아포(포자)만 살아남아서 번식한다(아세톤, 부타놀균, 토양 고초균류).b. 화학적 방법목적하는 미생물의 내산성, 내알코올성,내당성, 내항생물질성 등과 같이, 어떤약품에 대한 저항성을 이용하여 잡균의 생장을 억제하거나 제거하고 목적으로 하는 미생물만을 얻는 방법이다. 예를 들면 pH의 변화로 효모(pH 5～6), 곰팜이(pH 5～6), 세균(pH 7～8)이 배양된다.c. 동물통과법병원균에 많이 쓰는데 결핵균을 몰못에 이식하거나 폐렴쌍구균을 흰쥐에 접종하는 방법인데 동물체를 배지로 이용하는 방법이다.2. 호기성 세균류의 순수분리 및 배양법① 평판 배양법(Plate culture)a. 코호평판배양법(Koch pour plate culture)멸균한 무균작업대에 건열멸균한 petri dish 3장을 넣는다. 한편 고체 배지가 들어있는 시험관 3개를 더운 물 냄비 속에서 굳지 않게 하고 집적배양한 시료와 함께 면전은 화염멸균을 하고 버너는 승홍수로 살균하여 함께 무균작업대에 놓는다.멸균한 백금이로 시료에서 한 백금이를 제 1의 시험관배지(40～45℃)에 넣어 잘 섞는다. 이 배지에서 다시 멸균한 백금이로 한 백금이를 제 2시험관배지에 넣어 섞고 또 멸균한 백금이로 한 백금이를 제 3의 배지에 넣는다. 이 3개의 시험관을 다시 잘 흔들어 미리 준비하였던 petri dish에 부어 냉각응고를 시키고 거꾸로 하여 배양기에 넣는다. petri dish를 거꾸로 하는 것은 배양기 속에서 물방울이 petri dish의 위쪽에 떨어져서 오염되는 것을 막기 위한 것이다. 이 방법에 따르면 제 1, 제 2, 제 3으로 희석됨에 따라 현탁되는 균수가 적게 되고 그만큼 순수한 집락을 만들게 된다. 이상의 평판들은 배양기에서 세균은 1～3일, 곰팡이는 5～7일 후에 집락을 만든다. 고립된 집락을 다른 배지에 이식(transper)한다. 검경 후 순수분리 되었다고 인정되면 사면배양 또는 천자배양을 하여 보존한다.b. 평판도말 배양법(Streak plate culture)약 10㎖의 고체배지를 만들어 무균작업대 속에서 prtri dish를 왼손에 쥐고 시료를 백금이로 채취하여 평행곡선을 그어간다. 도말이 끝나면 거꾸로 하여 배양기에 넣고 1～3일 후에 집락이 생기면 앞의 방법과 같이하여 보존 배양한다.② 현미해부법(Micromanipulation)이것은 많은 세포 중에서 원하는 것을 가려내는 방법으로 쓰인다. Zeiss사의 제품은 3차원으로 움직이는데 두?폰브루네사의 제품은 한개의 핸들이 기압작용으로 편리하게 움직인다. 앞의 각종방법에 의하여 얻은 순수분리 미생물은 순수배양을 하여 다음의 연구에 쓴다.③ 고체배양법a. 사면배양법(Slant culture)사면배지의 제조법은 앞에서 설명하였다. 이 배지에 분리한 미생물을 백금선을 사용하여 한천표면의 아래서 위로 선을 긋는다. 이때 한천표면에 구멍이 파이지 않도록 주의한다. 이것을 적온의 배양기 속에 넣어 1～3일이 되면 집락이 발생한다.b. 천자배양법(Stab culture)혐기성미생물의 보존에도 많이 사용된다. 균을 백금선에 채취한 후 이것을 응고한 한천배지의 위에서 아래로 수직으로 찌른 후 가만히 빼서 적온의 배양기에 넣는다. 가스를 발생하면 구열이 생기고 젤라틴을 사용하여 균의 용해성의 유무를 조사한다.④ 액체배양법(Liquid culture)생태?생리의 관찰, 발효생산 화합물의 분석 및 미생물 균체의 다량수확을 목적으로 할 때에 액체 배양을 하는데 다음과 같은 4가지 방법이 있다.a. 정치배양법[Static culture (시험관내 액체배양법)]시험관에 멸균된 액체배지를 10㎖정도 넣고 한 백금이의 미생물을 이식하여 적온의 배양기에서 배양한다. 이 방법으로 증식의 유무, 균개, 피막, 침전물 형성의 유무, 가스발생, 생산물검출반응, 배양액 혼탁도 등을 관찰한다.b. 액체내 통기배양법(Aerated culture)산화발효를 시킬 때, 산화세균, 효모 등의 균체를 다량으로 수확할 목적으로 배양할 때에 통기배양법을 쓴다. 간단히 통기배양을 할 때에는 면여관(솜을 넣어 멸균한 유리관)을 써서 흡인(수류펌프, 진공펌프) 또는 압입(콤프렛서)하여 공기를 무균공기로 하여 배양액을 통과시킨다.c. 진탕배양법(Shaking culture)각종 배양병에 배지를 넣고(500㎖의 배양병에 배양액은 100㎖이하) 이식 후 배양기에 설치된 진탕기에 얹어 배양한다. 진탕기에는 왕복진탕기(120～140rpm), 회전진탕기(150～300rpm) 등이 보통이다. 주의할 점은 진탕 중 면전에 배지가 묻으면 오염의 원인이 되므로 묻지 않도록 하여야 한다. 또 면전을 너무 단단하게 하면 안되고 접종량을 다량으로 하여야 한다.d. 통기교반 액침배양법(Aerated submerged culture)발효수조(Jar fermentor)를 사용한다. 그 구조에 따라 멸균준비 후, 멸균하여 면여관을 닫고 균을 이식한다.⑤ 고체배지상의 배양소견고체배지상에 미생물의 집락이 형성되는 속도는 미생물의 종류에 따라 차이가 있다. 그러나 보통 세균은 37℃, 24시간, 곰팡이류는 27℃, 5～7일 이면 육안으로 구별할 수 있는 크기로 된다.a. 집락의 육안적 관찰표면집락의 투명도, 크기, Form, 융기도, 광택 , 색, 주변부의 형상, 점조도, 심부 집락의 형상, 내부구조, 그리고 생리적인 특징 등이 각균의 종류에 따라 다르다.b. 집락의 주변형상 관찰petri dish의 뚜껑을 열고 돋보기나 실체 현미경의 50～100배로 주변부의 형상을 관찰한다.c. 젤라틴의 액화고층젤라틴배지에 천자배양하여 21℃에서 7일간 배양하여 관찰한다. 세균의 종류에 따라 천자선을 따라 용해되어 젤라틴이 액화부위 모양이 다르게 나타난다.3. 혐기성 세균의 분리 및 배양법① 기계적으로 산소를 제거하는 방법(중층법)a. 고층한천혼합 배양법배지를 15～20분 끓여서 배지 안에 있는 산소를 내보내고 45도로 식혀 접종 재료와 혼합한 후 급속히 식혀 굳힌다. 그 위에 한천 배지 또는 유동 파라핀을 중첩시킨다.

공학/기술| 2009.01.01| 5페이지| 1,500원| 조회(1,016)

평판도말 배양법, 현미해부법, 사면배양법, 천자배양법, 정치배양법

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미생물의 염색법 원리

2006. 05. 04Ⅰ. Subject- 미생물의 염색법 원리Ⅱ. Purpose- 일반적으로 대부분의 미생물은 무색 투명하여서 이들의 세포를 현미경으로 세밀하게 관찰하기 위해서는 염색과정을 거치는 것이 좋다. 일반적으로 염색은 염료가 세포에 부착이나 흡수되는 것에 의한 물리적 방법과 염료와 세포구성물 사이의 전기적 전하와 화학적 친화력에 의해 염색되는 화학적인 방법이 있다. 염색은 염색체에 대한 친화성의 차이에 의한 형태 관찰과 함께 세균분류에 사용된다. 염색의 의의는 다음 세가지로 말할 수 있다.첫째로, 세균의 분류와 동정에 필수불가결한 방법이다.둘째로, 검체의 세균유무와 균량을 간단히 알 수 있다.셋째로, 대충 어림으로 세균형태를 보아 균종이 추정되며, 세균 감염증 진단에 도움이 되며, 또한 조기에 항생물질의 선택방침을 결정할 수 있다.Ⅲ. Introduction세균 염색법과 색소세균 염색에 사용하는 염색제의 대부분은 aniline색소이고 염기성 색소와 산성색소가 있다. 염산염, 나트륨염, 칼륨염 등의 염 형태로 시판되고 있다.염기성 색소는 해리되어 양(+)이온 으로 하전되는 색소분자를 유리하며, 산성 색소는 그 반대로 음(-)이온으로 하전되는 색소분자를 유리한다.methylene blue+ Cl: 염기성 색소eosin+ Na: 산성 색소세균의 균체에는 핵산이 다량 함유되어 있고 그 인산기는 음성하전이므로 양성하전의 염기성 색소와 잘 결합하여 염색된다. 한편 조직세포의 세포질은 양성하전이므로 산성 색소로 염색된다.염기성 색소는 methylene blue, basic fuchsin, crystal violet, safranin O, bismark brown 등이 있고 염색성을 높이기 위하여 염색촉진제로서 석탄산, 수산화칼륨, 초산 등이 첨가된다. 그리고 매염제로서는 탄닌산, 피크린산, 명반, 황산 제1철 및 요오드 등이 사용된다. 세포성분과 색소와의 결합력에는 강약이 있어서 목적 이외의 것에도 염색되는 일이 있으므로 일단 염색한 것을 선택적으로 탈색하는 방법이 채택되었다. 탈색제로는 alcohol, acetone, 1-3% sulfuric acid, 3% HCl alcohol 등이 쓰인다.염기성 색소에 잘 염색되는 세포를 호염기성, 산성 색소에 잘 염색되는 세포를 호산성이라 부른다.염색의 종류단순염색 (simple stain)- 세균의 형태 : cocci, bacilli, spirilli- 배열 관찰 : chains, clusters, pairs, tetrads감별염색 (Differential stain)- 미생물 그룹의 분류 : Gram stain, Acid fast stain- 특수 구조의 관찰 : Flagella stain, Capsule stain, Spore stain, Nuclear stain염색시약의 조제염료의 화학적 조성은 다양하여 용매에 따라 용해도의 차이가 있으며 미세한 분말로 되어 있어 용매에 용해되는 염료가 있는가 하면, 단단한 결정체로 이루어져 막자와 막자사발 등으로 분쇄해야만 용해되는 것이 있다. 또한 염색 시약의 조제순서를 제대로 지키지 않음으로 해서 용해되지 않는 경우가 있다.염색시약의조제방법과 보존방법 등의 주의사항을 잘 준수하는 것은 염색 기술 못지않게 중요한 사항이다.① 갈색병에 넣어 실온해 보관하는 염색시약Fuchcin 원액, Crystal violet 원액, Methylene blue 원액, Rhodamine 색소, Malachite green 색소, Lugol's 액, Potassium permanganate 수용액② 가능한 신선용액을 사용하는 염색시약Hucker's crystal violet 색소, Neisser's A, B 혼합액, Albert's A, B 혼합액, Leifson's 편모염색시약단순염색(simple stain)단순염색이란 한 가지 염색액으로 세포를 염색하는 것으로 세포내 구조물을 더 뚜렷하게 볼 수 있다.이번 실험에서는 세균의 도말, 고정 및 단순염색을 실시하여 세균의 형태를 관찰하고자 한다.세균의 형태학적 관찰은 세균의 생사와 관계없이 가능한 것이지만 살아있는 세균의 현미경적 관찰은 대단히 한정되어 있으므로 균을 사멸 고정시켜 염색 후에 경검함이 원칙이다. 세균은 염색전에 도말하고 열로 고정하는데, 여기서 도말이란 깨끗한 슬라이드 글라스 위에 세균 부유액을 펴서 공기 중에서 건조시키는 것을 말한다. 건조시킨 도말 슬라이드를 3-4번 불꽃 위를 통과시키면서 가열하는 과정을 열고정이라 한다. 열고정은 세균의 효소를 변성시켜, 자가융해가 일어나지 않도록 한다. 또한 열처리는 슬라이드 글라스에 부착성을 좋게 해준다. 단순염색 표본에서는 세균의 모양과 배열은 볼 수 있으나 세균의 세포벽, 아포, 협막과 같은 구조는 염색되지 않는다.단순염색에 주료 사용하는 염색 색소는 강한 염기성 색소인 methylene blue이다. 이 염색에서는 산성인 세균체 내의 염색체와 이염과립이 짙게 염색된다. 그리고 Corynebacterium diphtheriae를 동정하기 위한 인후도말 표본을 염색하는데 사용한다.생체염색(Vital strain)생체염색은 Crystal violet, Methylene blue 같은 염색액으로 미생물을 살아있는 채로 염색하는 방법이다. 배양액과 염색액(1:1)을 섞어 슬라이드에 놓고 그 위에 커버글라스를 덮어서 현미경으로 관찰한다.감별염색법(Differential stain)1. 그람염색법(Gram stain)감별염색법으로 가장 널리 이용되는 방법이며, 그람 염색반응은 계통발생학 적으로 서로 연관성이 있는 균종들 사이에 여러 가지 형태학 적 특성과 서로 긴밀한 관련이 있으므로 세균분류 지표가 된다.이 방법으로 염색하면 대부분의 세균은 크게 두 군으로 분류되는데, 탈색액에 전항이 있는 세균은 crystal violet의 청색 또는 보래색으로 나타나고 대조 염색액으로 염색되지 않는다. 이를 그람 양성균이라 부르고 crystal violet가 탈색된 세균은 대조 염색액인 safranine으로 염색되므로 분홍 또는 붉은색으로 나타난다. 이런 세균을 그람 음성균이라고 한다.그람염색반응의 정확한 기전은 아직 불명이지만 구조가 온전하고 세포벽이 존재해야만 제대로 나타나며 세포벽의 투과성과 밀접한 관계가 있다고 한다. 염색 기술이 미숙하면 잘못 판단하기 쉬우므로 숙련될 때 까지 많은 연습이 필요하며 또 세균의 배양조건에 따라 그람 양성균이 음성균으로 나타날 때가 많으므로 주의를 해야 한다.2. 항산성 염색결핵균이나 나균과 같은 Mycobacteria속에 속하는 균들은 유지질로 된 두꺼운 왁스성 외포로 싸여 있어 염기성 색소에 의하여 일단 염색이 되면 산이나 알코올로 처리하여도 탈색되지 않는 특징이 있다. Ziehl-Neelsen법이 가장 많이 이용되고 있으며, 항산성균은 청색 배경에 적색으로 염색된다. 항산성균의 염색에는 이 밖에 여러 가지 변법이 있지만, 기본으로 하는 것은 1882년 Ehrlich가 Koch의 결핵균발견 직후에 고안한 방법이다.특수염색법1. 편모염색(Flagella stain)편모는 대단히 작은 것으로 광학현미경으로 보이지 않는다. 그러나 세포를 탄닌산염 같은 불안정한 콜로이드상 부유액으로 처리하면 세포벽과 편모 위에 두꺼운 침전물이 생기기 때문에 편모의 존재와 배열을 증명할 수 있다. 이 방법에 의하면 외견상으로는 편모의 직경이 증대하므로, 계속해서 염기성 푸크신으로 염색하면 광학현미경으로도 관찰된다.2. 아포염색아포는 가장 간단하게는, 염색되지 않는 세포 부유액 중에서 굴절성의 세포내 소체로 관찰될 수 있고, 또 보통염색법으로 염색한 세포 중에서도 무색의 영역으로 관찰될 수 있다. 아포벽은 비교적 비투과성이지만, 표본을 가열하면 색소가 침투하게 된다. 한번 염색되면 알코올 처리에 의하여 탈색되지 않는다. 그래서 탈색된 영양세포에 대하여 대조염색을 하게 된다. 아포의 염색에는 보통 malachite green 또는 석탄산 푸크신이 사용된다.

공학/기술| 2009.01.01| 5페이지| 1,500원| 조회(1,334)

그람염색법, 항산성 염색, 아포염색, 협막염색, 편모염색

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