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PCR(예비).

◆ 실험 목적polymerase chain reaction을 이용하여 DNA에서 원하는 부분만을 증폭하고 그 원리를 이해한다.◆ 실험 방법1) 10 x Taq polymerase PCR buffer와 dNTP(10mM), Primer(10pmol/㎕)를 미리 얼음 위에서 녹인다.2) 증폭하고자 하는 target 유전자를 포함한 DNA를 준비한다.3) 멸균된 PCR tube에 준비된 재료들을 넣고 섞어 반응액을 만든다.4) 준비된 반응액에 Taq polymerase를 첨가한다.5) Thermo cycler의 program을 setting하고, PCR 반응을 시작한다.6) PCR 반응이 완료되면 전기영동을 실시하여 PCR product band를 확인한다.7) PCR product purification kit 또는 agarose gel elution kit를 이용하여 정제한다.◆ 실험 원리◇ PCRThe polymerase chain reaction(PCR).Polymerase chain reaction(PCR) technique은 1980년대 중반 K. Mullis에 의해서 고안된 기술이다. 이 PCR techinique은 유전자를 연구, 분석하는 분자유전학에 혁신을 일으켰다. 유전자를 분석하고 연구하는데 있어서 가장 큰 문제점은 복잡한 전체 genome중에 연구하고자 하는 유전자가 희귀하다는 것인데, PCR은 특정 DNA Sequence의 copy수를 기하급수적으로 증폭시킬 수 있다.PCR은 DNA polymerase에 의한 DNA 복제의 특징을 이용한다. 일반적으로 증폭반응은 Thermus aquaticus로부터 정제된 DNA polymerase I에 의해 수행된다. 이 생물체는 온천에서 서식하고 있고, Taq polymerase를 포함하는 많은 효소들이 thermostable하다. 이것은 그들이 열처리에 의한 변성에 대해 저항성이 있다는 것을 의미한다. Taq polymerase의 thermostability는 PCR methodology에서 필수적인 요 해서 상보적인 DNA를 합성한다. 이러한 외가닥 DNA는 두가닥 DNA를 끓임(denature, 변성)으로써 간단하게 얻을 수 있다. 그리고 primer들이 새롭게 합성된 가닥을 포함하여 각각의 위치에 혼성화 되도록 하기 위해 냉각시킨다. DNA polymerase가 DNA합성을 시작하게 위해서는 시작부위가 두 가닥 DNA로 되어 있어야한다. 따라서, 증폭시킬 DNA sequence의 양 끝에 상보적으로 결합할 수 있는 작은 DNA조각(oligonucleotide primer)을 함께 넣어주면 이 primer가 특정 DNA sequence의 양 끝에 가서 결합(anneal)해 DNA polymerase가 DNA 합성을 시작할 수 있도록 해준다. 일단 primer가 결합한 후에는 DNA polymerase의 작용으로 DNA 합성이 반대편 끝까지 진행(extend)된다. 이렇게 1)denature, 2)anneal, 3)extend가 한 cycle이 된다. cycle을 반복 수행한다(대개 25-30번). cycle에서 original DNA와 새로 합성된 DNA가 분리되어 외가닥 DNA 주형이 된다. 따라서, n cycles 후에, 이론적으로 2n의 두 가닥 DNA가 존재하게 된다. 그 결과 증폭된 DNA 단편의 수많은 copy들이 합성된다. PCR실험의 마지막 단계에서, 반응 혼합액 시료를 agarose gel electrophoresis에 의해 분석한다. 단편이 증폭되어 생성된 충분한 양의 DNA를 EtBr염색 후에 band로써 확인할 수 있다. 이것은 그 자체로, 증폭된 DNA부위에 대한 유용한 정보를 제공할 수 있다. 또한 PCR산물은 정상적인 방법으로 조작된 plasmid 또는 bacteriophage vector내로 삽입되어 DNA sequencing같은 표준 기술에 의해 분석될 수도 있다.DNA를 변성시키면 DNA polymerase 도 같이 변성되므로 매 cycle마다 DNA polymerase를 넣어주어야 했었다. 그러나, Thermus aqua다.◇ primerPCR에서 증폭시킬 위치에 보합하여 DNA복제를 유도하는 짧은 인조DNA.일단 primer는 DNA 복제 시 염기가 시작하는 부분(10~ 15개의 염기 정도)에 붙어서 DNA polymerase가 거기에 염기들을 이어 붙일 수 있게 하는 역할을 한다. primer가 없으면, DNA의 합성이 일어나지 않는다. primer의 종류는 매우 다양한데 진행하는 실험에서 쓰는 DNA 시료에 맞는 primer를 골라주어야만 DNA의 합성이 일어난다.DNA 시료의 염기서열에 대한 정보를 참고하여 primer를 고르도록 한다.◇ DNA polymeraseDNA의 복제에는 DNA polymerase(Dpase)가 관여한다. 오늘날 세종류(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)의 Dpase가 알려져 있다. Dpase Ⅰ은 아마 1100개의 아미노산으로 된 1본의 polypeptide로 되었고, 1956년에 Kornberg에 의하여 발견되었다.Kornberg의 DNA polymerase(오늘날의 DNA polymerase Ⅰ)는 DNA를 주형에 DNA를 합성하여 만들어진 DNA의 조성이나 nucleotide 배열은 주형 DNA의 그것과 유사하다. 이 효소는 대장균당 약 1만 분자가 존재하고 있을 것으로 생각한다. 네 종류의 dXTP를기질로 하여 primer DNA, 주형(template)DNA, Mg2+ (또는 M2+)존재하에서 이 primer에 nucleotide를 연결하여 DNA를 합성한다. 이 반응은 다음과 같다.+ primer DNA → DNA ―+ (n1+n2+n3+n4)PPi이 효소에 의하여 합성된 DNA는 2중 나선 구조를 가져 그 염기조성은 가해진 주형 DNA의 염기조성과 일치하여 A=T, G=C의 관계를 만족시킨다. 또 인접 nucleotide의 출현빈도(보기로서 dA32PPP를 사용하여 DNA를합성하여 적당한 nuclease로 5‘ 측을 끊으면 dA의 3’측의 dX에 32P가 붙어 이것을 분석하면 dA의 이웃에 어느 염기가 오는 가의 빈도를 알 수 있다. 마찬가지로 dG,여한다고 생각되는 만큼 늦은 것으로 합성된 DNA는 분지된 곳이 많으므로 이 효소가 참으로 복제를 하는 가는 의문점이 있다.오랫동안 1969년에 De Lucia와 Cairns는 DNA polymerase Ⅰ결손 Ⅰ의 대장균 돌연변이 균주를 분리하였다. DNA polymerase Ⅰ이 세포 내에서 일어나는 DNA합성의 실체에 관여하는 것이라면, 이 효소에 결손 돌연변이 균주는 생존하지 않는다고 한다. 이것이 생존되지 못하는 것은 polymerase Ⅰ이외에도 polymerase가 존재하는 것을 나타낸다.그 이후 새로운 polymerase가 알려져 1970년에는 DNA polymerase Ⅱ가, 또 1971년에는 DNA polymerase Ⅲ가 발견되었다. Richardsons 등의 연구에 의하면 Ⅰ,Ⅱ를 결손한 대장균 돌연변이균주는 생육한다고 한다. 그러면 생육에 필수인 것은 DNA polymerase Ⅲ라는 것이다. 이에 기술한 것은 Ⅰ,Ⅱ결손의 세포 중에 T4, T7, λφX174, fd 등의 phage는 증식한다는 것이다. 따라서 이들 phage는 Ⅲ를 이용하고나, 또는 자신이 만드는 DNA polymerase를 이용하는 것으로 생각된다. 그런데 Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ는 고초균에서도 증명되어 있다. Ⅱ,Ⅲ도 Ⅰ과 마찬가지로 deoxynucledside triphosphate에서 DNA를 합성한다.※DNA polymerase Ⅰ과 Ⅱ의 역할Dpase Ⅱ는 세포당 400분자 정도 존재하며 몇가지 성질은 Dpase Ⅰ과 다르나, 그 효소의 생리적 의의는 불명으로 이 효소를 없에도 대장균은 생장되었다. DNA합성속도는 in vitro에서 DPase Ⅰ보다 늦다. DPase Ⅲ은 대장균에 대하여 필수적이고, 세포당 10분자 정도만 있으나, in vitro에서의 합성속도는 복제에 맞먹는 속도로 정상인 DNA를 복제하는 것으로 알려져 있다. 이 DPase Ⅲ도 promer DNA, 주형 DNA와 Mg2+ 가 필요하다. DPase Ⅱ와 Ⅲ도 5‘→3’방향으로 DNA를 합성한다. 현재 이 사실로부터 DNA polymerase Ⅰ(대부분 Ⅱ도)은 DNA 장해의 수복에 작용한다고 판단된다. 그러면 DNA polymerase Ⅰ의 작용은 부차적인 것이 되나, 최근에 이르러 polA recA(B, C)라는 결함을 가진 균주는 생존하지 않는 것을 알았다. DNA polymerase Ⅰ도 또 생존에 어떤 역할을 하는 것으로 된다. 그렇다면, 그 역할은 무엇일까? DNA polymerase Ⅰ 표품은 DNA 합성등 이외에, 5‘쪽에서 3’쪽으로 절단하는 exonuclease 활성, 3‘쪽에서 5’쪽으로 절단하는 exonuclease활성도 같이 가진다. 이것들이 관계하고 있는 것도 알려져 있다. DNA합성 저해체도 있다.더구나 DNA polymerase Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ를 만드는 유전자의 염색체 위의 자리는 온도감수성 돌연변이 균주를 써서 연구되어 dna A(pol A), dna B(pol B), dna E라고 이름지었다.DNA합성에 관계되는 유전자는 이외에 dna C, dna D, dna F, dna G등이 있고, DNA합성의 개 시 때문의 유전자, ribonucleoside diphosphate reductase 유전자 등으로 증명되어 있다.◇ PromoterRNA polymerase가 DNA와 결합하는 장소가 promoter이다. Represser의 경우와 달리, 보통의 RNA polymerase에서는 특이성이 없다. 따라서 RNA polymerase로 보호하고서 DNA 분해 효소로 처리하는 방법으로는 , 각종 promoter의 혼합물이 채택된다. 그래서 promoter의 수가 적은 phage DNA 를 이용해서 연구가 이루어져, promoter영역은 A-T pairing이 많다고 보고가 되어 있다. 최근 Aller등은 GTCGAC 또는 GTTAAC인 배열을 함유한다고 하고 있으나, 아직 확인되지 않는 것이 많다.Lac operon 에서 promoter는 operon 당 1개로, 더욱 operon의 한 끝에 있다. 그러나 최근 예외가 몇 개 발견되었다. .

공학/기술| 2009.05.31| 7페이지| 1,000원| 조회(529)

PCR, DNA, PCR methodology

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plasmid분리(예비).

◆ 실험 목적기본적인 bacteria culture 방법 및 단백질 정제 방법을 익힌다.◆ 실험 재료? LB broth실험실에서 가장 흔히 사용되는 배지이다.균 배양 실험에 가장 흔히 쓰이는 LB배지는 Luria - Bertani media 에서 머리글자만 따온 것이다. 배지를 구성하는 물질 조성비율은 tryptone 10g/liter, NaCl 10g/liter, yeast extract 5g/liter 인데, 간단히 LB배지에는 트립톤과 이스트, 염화나트륨이 함유되어 있다고 보면 된다.LB배지는 이 세 가지 물질을 증류수에 넣어 녹여 만드는 것인데, 요즈음에는 이 시료들을 따로 양을 재서 섞고 만들지 않아도 된다. 이미 약품회사에서 완제품을 판매하고 있기 때문에 그 것을 증류수와 섞어주기만 하면 된다. LB가루를 물(오로지 증류수만 쓴다)에 섞을때는 물 1L에 가루 25g이라는 철칙이 따른다. ( 1L = 1000ml ) 성분 950 ml를 증류수에 녹인 후 pH를 7로 맞추기 위해 5 N NaOH를 첨가(약 200 μl)하고 증류수로 1 liter로 채운다음 autoclave한다.평상시에는 promoter 직후에 있는 operator에repressor가 binding 해 있어서 RNA polymerase가 binding을 못하는상태입니다. 하지만, inducer가 cell 내로 들어오면 repressor와 결합하면서repressor를 operator로부터 떼어 냅니다. 그러면 RNA polymerase가binding site에 binding하면서 transcription 이 시작되고, mRNA가만들어지면서 translation이 되어 protein이 만들어 지는 것이지요. 그러나,basal level induction 또는 expression이 일어나는데, 이는 repressor의operator에 대한 결합은 가역적인 것이기때문에 확률적으로 떨어져 있는 경우가 있기 때문입니다. 이때 RNApolymerase가 결합하면 transcription이 되면서 소량의 protein이 만들어질수도 있습니다. cell 내에서 안정한 protein의 경우 basal levelinduction에 의해서도 상당한 양이 축적될 수도 있지요.pET vector의 경우 T7 promoter를 사용하지만, T7 promoter직후에 lacoperator가 있기 때문에 역시 lac repressor에 의해서 조절이 되게 됩니다.이 경우도 IPTG induction을 하면 repressor가 inducer인 IPTG와 결합하면서repressor로서의 역할을 못하게 하여 expression이 되게 됩니다. T7system의 경우 lac (tac, trc) promoter를 이용하는 vector에 비해서transcription에 의해 생성되는 mRNA의 수는 대략 8배 정도 많기 때문에basal level expression에 의해서 발현될 가능성이 더 큽니다.그래서 lac operator를 T7 promoter에 붙여서 더 강력하게 조절되도록 한것입니다. Novagen에서 제공하는 pET System Manual에 보면 자세히 나와있는 내용이니까 Novagen에서 자료를 받아보거나, 아니면 Novagenhomepage에서 찾아보세요.◆ 실험 원리◇ Plasmid DNA의 특징세균의 세포 내에 염색체와는 별개로 존재하면서 독자적으로 증식할 수 있는 DNA의 고리모양인 유전자. 염색체 밖에 존재하는 DNA (extrachromosomal small circular DNA) 이다.세포의 핵에 있는 유전자와 달리 세포질에 존재하며 약제에 대한 저항성을 가진 내성인자 (R인자), 성결정인자 (F인자) 를 가진다. 세균의 생존에 필수적인 것은 아니고 다른 종의 세포 내에도 전달될 수 있다. 다른 DNA 단편을 자기의 DNA에 연결해서 분열하고 받아들인 DNA를 증가시킬 수 있기 때문에 벡터로 흔히 사용되며 생명공학에서 유전자 재조합에 주로 이용한다.⇒1. 세포내에서 염색체와는 독립적으로 존재- 염색체 밖에 존재하는 DNA2. Double strand로 닫혀진 환상형의 DNA3. 세균의 항생제에 대한 저항성은 세균이 갖고 있는 플라스미드가 원인이 된다.4. 복제개시점(origin of replication)이 존재- 세포내에서 세균의 염색체와 독립적으로 존재한다.5. 작은 플라스미드는 복제시에 Host의 효소를 이용- 큰 플라스미드는 자체의 복제 효소를 가지고 있다.6. 어떤 플라스미드는 세균의 염색체 속으로 플라스미드를 삽입시켜 복제될수 있다.- 세포가 분열해도 안정적으로 유전됨7. 플라스미드 1kb-250kb이상 까지 크기가 다양하다◇ Plasmid DNA의 여러 가지 변성방법1. Ultra - centrifuge- Size를 이용한 분리방법- upper solution을 첨가 후 초원심분리 실시- 세 개의 층이 분리됨 ( 위: protein 중간: DNA 아래: RNA )2. CsCl - EtBr의 밀도 구배 원심분리법- CsCl의 농도에 따라 linear DNA, Plasmid에 결합하는 EtBr 양의 차이를 이용한 방법- cccDNA가 linear DNA보다 밀도가 증가해서 원심분리 후 아래쪽에 모임3. Mini - prep1) Alkaline lysis- pH 변화에 따라 염색체 DNA의 부정확 재생능을 이용하여 plasmid DNA를 분리하는 방법.alkaline lysis procedure(Bimboim, Doly, 1979)은 가장 일반적으로 쓰이는 분리방법이다. Plasmid DNA는 plasmid을 지니고 있는 bacteria에서 적은 양의 배양으로 분리될수 있다. Bacteria는 sodium dodecyle sulfate(SDS), NaOH를 함유하는 용액으로 처리하여 용균되어 진다(여기서 SDS는 bacterial proteins을 변성시키며 NaOH는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 변성시킨다). 다음 potassium acetate를 첨가하여 혼합액을 중성화시키는데 이것은 covalently closed plasmid DNA를 빠르게 reanneal 시킨다. chromosomal DNA와 bacterial proteins의 대부분은 침전되며(SDS는 potassium과 화합물을 이룬다) 침전물은 원심분리로서 제거할 수 있다. plasmid DNA는 상등액에 남아있게 되고 ethanol precipitation으로 집중시킬 수가 있다.2) Boling miniprep- plasmid는 열에 의해 깨지고 chromosomal DNA와의 원심분리에서 상층액을 회수 및 추출Plasmid를 지닌 bacteria는 lysozyme, Triton(a nonionic detergent), 열처리등으로 깨어질수 있다. chromosomal DNA는 세포막에 결합된 상태로 남아있게 되고 원심분리로서 침전시켜 모을수 있으며 plasmid DNA는 상등액에서 isopropanol(Holmes and Quigley,1981)로 침전시켜 분리할 수 있다. boiling miniprep는 적은 양의 plasmid를 분리할 때 쓰이는 방법이지만 분리된 plasmid DNA는 alkaline lysis miniprep 보다 quality가 떨어진다.3) Lithium miniprep- Alkaline lysis와 유사- 가장 빠르게 plasmid DNA를 분리하는 방법Plasmid DNA는 평판 또는 액체배지에서 배양되는 E.coli로부터 획득할 수 있는데, Bacterial cells은 Triton X-100/LiCl과 phenol/chloroform을 처리하여야만 한다. 이것은 plasmid DNA의 가용성화와 chromosomal DNA, cellular debris등에 침전을 일으킨다. debris는 원심분리를 통해 제거할 수 있다. 이러한 분리절차로 chromosomal DNA 등을 제외한 plasmid DNA만을 얻을 수 있다.◇ Alkaline lysis method (이번 실험에서 사용)( 위 설명에 덧붙여서 )- Miniprep 라고 부르는 이 방법은 plasmid DNA를 소량 분리하는 방법- 가장 보편적으로 사용되며 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 구분하여 분리- chromosomal DNA는 분리 과정에서 linear 형태가 되고 크기가 상당히 크다는 차이 이용◇ Neutralization and plasmid DNA adsorptionto the DNA-spinTM column membrane위의 방법으로 변성 단계가 끝나면 lysate를 고염도와 acidic한 환경으로 노출을 시켜 neutralized가 되도록 한다. 전기 영동할 때 쓰는 acetic acid와 boric acid는 ionic strength를 부여하는 역할을 한다. 전기영동은 chare를 띠어야 하므로 ionic strength가 있어야 한다. 약산을 포함시켜 이런 효과를 얻어내는 것이다. 경험적으로 TAE와 TBE를 전기영동에 써 왔으며, TAE가 좀 buffer 능력이 적어서 자주 갈아주거나 buffer exchange를 해야하는 단점이 있지만 더 싸고 더 일반적으로 agarose gel EP에 많이 쓰인다.Salts와 SDS가 complex를 이루면서 변성된 protein과 chromosomal DNA등이 모두 침전이 이루어지며, 반면에 plasmid DNA는 lysate solution 안에 남아 있게 되고 침전된 불순물은 원심분리를 하여 제거 한 후 순수한 plasmid DNA만을 취하도록 한다. 이렇게 RNA와 단백질을 제거하지 않으면 나중에 제한효소 처리나 sequencing 반응이 제대로 되지 않는다. 또한 이러한 high salts와 pH 조건은 plasmid DNA가 membrane에 binding이 잘 되도록 돕는 역할을 한다.

공학/기술| 2009.05.31| 6페이지| 1,000원| 조회(313)

증류수, plasmid 분리, T7 promotor, RNA polymeras..

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plasmid분리(결과

◆ Abstract지난 시간, transformation 과정까지 완료하고 colony를 배양해 낸 것을 하나씩 따내어LBA(liquid) tube에서 37℃로 12hr동안 배양한 것을 이번 실험에 이용.→ Plasmid DNA 분리? 원심분리 하여 cell만 모았다.? solution 1, 2, 3 을 차례로 넣어주었다.? 원심분리 하고 membrane column에 걸러주었다.? 원심분리 하고 에탄올이 들어있는 buffer로 washing해 주었다.? 원심분리 하고 UPW를 넣었다.? 최종으로 원심분리 하였다.? 분리된 DNA, buffers, enzymes, UPW를 적당 비율 혼합하여 37℃에서 1hr 배양하였다.우리가 분리해내려 했던 plasmid DNA는 750bp 였다.◆ Introductiontransformation 시킨 e.coli를 배양 하였는데, 여기서 몇 가지 단계를 거쳐 plasmid DNA를다시 분리해 낼 수 있다.bacteria cell을 깨어 RNase A 용액 존재하에 NaOH와 SDS에 의해 용해시키고 lysate를 고염도와 acidic한 환경으로 노출시킨다. 침전된 불순물은 원심분리를 하여 제거 한 후 순수한 plasmid DNA만을 취해 washing, elution을 시켜주면 plasmid DNA의 분리 단계가 끝나는 것이고 enzyme 처리 후 이를 배양시켜 전기영동 하면 원하는 DNA가 분리되었는지 눈으로 확인할 수 있다.위 실험을 통하여 유전공학에서 가장 많이 사용되는 미생물인 대장균 배양, plasmid DNA를 분리에 대한 지식과 기술을 습득할 수 있다.◆ Material? LB broth실험실에서 가장 흔히 사용되는 배지이다.균 배양 실험에 가장 흔히 쓰이는 LB배지는 Luria - Bertani media 에서 머리글자만 따온 것이다. 배지를 구성하는 물질 조성비율은 tryptone 10g/liter, NaCl 10g/liter, yeast extract 5g/liter 인데, 간단히 LB배지에는 트립톤과 이스트, 염화나트륨이 함유되어 있다고 보면 된다.LB배지는 이 세 가지 물질을 증류수에 넣어 녹여 만드는 것인데, 요즈음에는 이 시료들을 따로 양을 재서 섞고 만들지 않아도 된다. 이미 약품회사에서 완제품을 판매하고 있기 때문에 그 것을 증류수와 섞어주기만 하면 된다. LB가루를 물(오로지 증류수만 쓴다)에 섞을때는 물 1L에 가루 25g이라는 철칙이 따른다. ( 1L = 1000ml ) 성분 950 ml를 증류수에 녹인 후 pH를 7로 맞추기 위해 5 N NaOH를 첨가(약 200 μl)하고 증류수로 1 liter로 채운다음 autoclave한다.? solution 1EDTA는 세포벽의 integrity를 유지하는 데 필수적인 calcium ion을 제거하여 세포벽이 군데군데 무너지게 한다. 이때 glucose는 삼투압을 유지시켜 세포의 외형을 유지시켜 준다.이 과정에서 실험상 vortex를 해야 하는데 이때 세포가 완전히 깨지게 되면 chromosomal DNA가 잘게 깨지게 되어 plasmid DNA와 구분할 수 없게 된다. 따라서 세포를 유지시켜가면서 세포벽만 깨는 것이다.? solution 2SDS는 ionic detergent로 세포막을 깨는 일을 한다. NaOH는 DNA를 denaturation시킨다. Chromosomal DNA가 잘게 부서지지 않게 조심스럽게 처리한다.? solution 3Renature시키는 산성용액. 이렇게 해서 Chromosomal DNA는 SDS와 potassium과 함께 엉기게 된다.◆ Result분리 하고자하는 plasmid DNA가 제대로 분리되었는지 전기영동을 해 보았다.우리가 분리하고자했던 Insert는 약 750b, vector는 약 6kb 정도이다.전기영동 결과 상 위에 넓게 나타난 밴드가 vector, 아래에 나타난 밴드가 insert라고 볼 수 있겠다.vector 밴드가 매우 넓게 나타났는데 이것은 분리된 양이 많은 이유 때문이라 추측된다.같은 원리로 ladder를 제외한 다섯 번째 lane의 insert 밴드는 매우 약하게 나타났는데이것은 insert 양이 많이 분리되지 않아서 일 것이다.◆ Discussionplasmid DNA를 삽입한 재조합 대장균을 배양하고 그것에서 다시 plasmid를 분리해 보는 실험을 하였다.LBA 배지에서 생성된 colony를 하나씩 따내어 LBA liquid tube에서 37℃, 12hr 동안 배양 하였다. tube는 뿌옇게 흐려진 것은 배양이 되었다는 의미이다.cell들을 down 시켜 cell만 모아야했다. 총 부피가 3ml라서 tube의 크기 특성상 1.5ml씩 나누어 원심분리 했다. cell들이 가라앉고 위의 상등액은 그냥 쏟아서 버렸는데, 피펫을 사용할 경우 오히려 cell들이 피펫에 따라올라가 버려질 가능성이 있기 때문이었다.실험할 때 알콜램프 같은 소독 과정을 생략했기 때문에 실험을 되도록 신속하게 진행 하였다.solution1에는 RNAase가 들어있다. solution1을 넣음으로써 세포벽이 군데군데 무너지게 할 수 있다. EDTA가 세포벽의 integrity를 유지하는 데 필수적인 calcium ion을 제거하기 때문이다. 이때 glucose는 삼투압을 유지시켜 세포의 외형을 유지시켜 준다. solution을 넣고 pipetting을 해주는데 외형적으로 보았을 때도 분리되어있었던 cell층과 solution층이 합쳐져, 뿌옇게 한 층만을 형성하는 것을 볼 수 있었다. pipetting을 하는 데 있어서 세심한 요령방법이 요구되는데, 실험자들이 pipetting에 익숙하지 않아 거품이 나는 경우에 주의해야 했다.이 과정은 cell을 풀어주는 역할을 해 준다.다음으로 solution2를 넣어주었다. solution에 들어있는 SDS는 ionic detergent로, 세포막을 깨는 일을 한다. NaOH는 DNA를 denaturation시킨다.solution3까지 넣어주게 되면 높은 염농도와 낮은 pH의 환경조성이 이루어진다. 용해된 buffer를 약하게 inverting 해주었다. 이렇게 환경조성이 되니, Chromosomal DNA는 SDS와 potassium과 함께 엉기게 되고 위로 떠올랐다. 그래서 용액은 투명해지고 plasmid DNA가 고루 soluble 되어있는 상태가 만들어졌다. 실험은 무조건 신속하게 진행되는 것이 관건 이었다. 원심분리를 10분 진행하고 tube를 기울여 상등액을 제거했다. 불순물은 실험에 매우 영향을 미치므로 얻고자하는 것이 소량 버려지더라도 상등액을 모두 제거하도록 노력 하였다. 원심분리가 끝나고 membrane column을 이용하여 필요 없는 여분을 걸러내었다. membrane column은 positive charge를 띠기 때문에 DNA의 negative charge를 띠는 인산기와 binding 한다. 이렇게 DNA가 걸러지자 투명하고 끈적거리는 상태가 되었다. 이 상태는 DNA가 분리되었음을 보여주는 상태라 할 수 있다.다시 원심분리를 1분 해주고 에탄올이 들어있는 buffer로 washing을 해주었다.pH와 높은 salt농도를 제거해주는 단계이다. 이 과정을 수행하지 않을 경우 다음 실험에 영향을 미치므로 이 정제과정은 매우 중요하다고 볼 수 있겠다. ethanol의 건조를 위해 다시 1분 원심분리 하였다. 결국 membrane에는 plasmid DNA만이 남았고 이것을 UPW에 녹였다. 우리 실험에서는 UPW를 사용하였지만, TE buffer를 사용하는 경우도 있다. TE buffer는 효소 로부터 DNA를 보호하여 장기보관에 유용하다는 장점이 있지만 우리는 DNA를 장기보관하지 않을 뿐더러, TE buffer에는 EDTA가 들어있어 DNA를 중성화시켜 잡고있기 때문에 buffer 조성을 망가트리고 enzyme처리를 할 때 방해한다. 그래서 우리는 UPW를 사용하였다. membrane을 tube에 꽂고 UPW 40㎕를 피펫으로 최대한 DNA에 가까이 하여 한 번에 눌러 뿌려주었다. DNA가 UPW에 녹아 나오는 시간 약 1분정도를 기다리고 나서 최종적으로 원심분리를 해주었다. 실험에서 원심분리는 13000rpm으로 총 다섯 번 해주었다. 이렇게 정제된 DNA를 4㎕, 10xBuffer 1㎕, 10xBSA 1㎕, Nhe1 0.2㎕, BamH1 0.1㎕, UPW 3.7㎕ total 10㎕로 하여 37℃에서 1hr동안 효소반응 시켜준 후 전기영동 해보았다.

공학/기술| 2009.05.31| 6페이지| 1,000원| 조회(517)

미생물, DNA, plasmid 분리, 대장균 배양

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PCR&유전자조작(결과).

◆ Abstract1. polymerase chain reaction을 이용하여 DNA에서 원하는 부분만을 증폭.- template DNA, primer(F/R), DNA polymerase, dNTP, Buffer, UPW 혼합했다.- 94℃에서 주형 DNA를 denaturation 시켰다.(ddDNA의 base pairing(hydrogen binding)를 파괴시켜 ssDNA로 바꾸어준다.)- 53℃에서 oligo nucleotide primer(약 10~20bp)를 target template에 annealing 시켰다.- 72℃에서 primer에서부터 template에 대응하는 nucleotide를 extension 시켰다.- 25cycle 반복했다.(2의 x제곱의 개수만큼 유전자가 증폭된다.)- 전기영동 하여 증폭결과 상태를 확인하였다.→ 위쪽엔 희미하게 template, 600bp 근처에 증폭된 DNA가 나타났다.아래쪽 primer가 보일 수 있는 자리에서 primer는 보이지 않았다.우리 조는 얻어진 양이 많았으며 끌림 현상이 보였고 다른 조에 비해 DNA가 살짝 아래부분에 위치했다.2. 재조합 DNA 분자를 제조하기 위해 vector와 insert를 같은 제한효소 enzyme으로 절단.- enzyme, DNA(insert, vector), 10xbuffer, 10xBSA, enzyme(Nhe1, BamH1), UPW 혼합했다.- 37℃에서 오랜 시간 반응을 시켰다.- 전기영동으로 DNA의 절단유무를 확인.3. 제한효소 처리된 DNA에 ligase를 처리하여 최종적으로 재조합 DNA 분자를 제조.- DNA(insert, vector), 10xbuffer, T4 ligase, UPW 혼합했다.- 혼합된 것을 상온에서 4시간, 4℃에서 overnight, 15℃에서 4~15시간 효소반응.- 전기영동으로 ligation 유무 확인.4. Transformation, 재조합 DNA를 보유한 숙주세포 선별.- plasmid DNA를 숙주세포인 competeerial? Taq & pfu polymerasePCR에 이용되는 polymerase.온천에 사는 Thermus aquaticus라는 박테리아로부터 분리해 낸 것으로 최적 온도는 72도.하지만 95도에서도 어느정도는 견딜 수 있어 PCR에 사용가능하다.Taq의 발견이후 여러 온천에 사는 박테리아로부터 다양한 polymerase들이 계속 만들어져왔고 대개 Taq의 약점으로 꼽히는 1) PCR 에러수정기능이 없는 것과 2) 긴 product를 만들지 못하는것을 보완한 polymerase들이 나왔다.대표적인 것이 pfu이다. 이외 각 회사마다 High fidelity (Proof reading 기능이 포함, 즉 PCR 에러 수정기능), Long PCR product들을 만드는 polymerase들이 있다. Pfu는 taq 사용시 많이 만들어지는 A-overhanging PCR 산물이 거의 나오지 않기 때문에 TA 벡터를 이용한 클로닝에는 사용하지 못하는 점에 유의해야 한다. 이러한 polymerase들은 대개 95도정도의 높은 온도에서도 taq에 비해 상대적으로 매우 강한 효소 활성도를 보여주기 때문에 실험에서 높은 온도가 오랫동안 필요한 경우라면 이러한 polymeras를 이용하는 것이 유리하다.? Insert DNAplasmid DNA의 MCS자리에 끼워넣을 DNA. TRAIL을 사용하였다. 약600bp? Vector DNAMultiple cloning site(MCS)이 부위는 제한효소로 잘릴 수 있는 부위를 한꺼번에 모아놓은 부분이다. 제한효소로 잘라서 다른 DNA를 삽입시킬 때 중요한 부분들이 같이 잘리면 안 되기 때문에 다른 부분은 절대 잘리지 않고 이 부분에만 잘릴 수 있도록 열 몇 가지 제한효소 절단부위를 인위적으로 조작해 놓은 것이다. 이 MCS 부위는 길어야 100 - 150 bp 정도이며 앞 뒤 부분에 SP6, T3, T7 promoter 등이 붙어있게 된다. 이런 부위는 RNA를 시험관에서 만들거나 단백질 발현을 시킬 때, 그리고 DNA seq에는 buffer가 이용된다. (10xBam H1, 10xBSA)? T4 ligase유전자 재조합 과정에 주로 사용되는 DNA ligase이다. 현재 많이 사용되는 ligase는 T4 DNA ligase와 E. coli DNA ligase이다. T4 DNA ligase는 cofactor로 ATP를 필요로 하고, E. coli ligase NAD+를 필요로 한다. 이들 두 ligase는 blunt-ended DNA, cohesive-ended DNA, nicked DNA등에 모두 작용할 수 있으나 E. coli DNA ligase 는 T4 DNA ligase와 비교할 때 blunt-ended DNA에 작용하는 힘이 약하므로 일반적인 유전자 재조합 과정에서는 T4 DNA ligase를 더 많이 사용하는 경향이 있다? competent cell (반응능 세포)형질전환 시킬 때 E.coli가 외부의 DNA를 받아들일 수 있는 상태로 만들어 준 후에 열 충격(heat shock)이나 전기 충격을 주어 이루어지게 된다. 이렇게 E.coli가 외부의 DNA를 받아 들일 수 있는 상태로 만들어 준 세포를 competant cell(반응능 세포)라고 한다.cell wall을 흐물흐물하게 만들어주어 외부 DNA가 cell 내로 쉽게 들어가도록 해준 상태의 세포를 말하는 것이다.◆ Results전반적인 과정 : ① 유전자 증폭② insert ＆ vector 같은부위 절단③ 유전자, vector에 ligation④ vector, e.coli에 삽입 (transformation)① 유전자 증폭표.1 반응액의 구성번호구 분농 도양1template DNA100ng/㎕(8kbp)0.1㎕2Primer F/R10p mole/㎕2㎕3DNA polymerase5unit/㎕0.2㎕4dNTP2.5 mM/L4㎕5Buffer10배 농축5㎕6UPW37.8㎕합 계50㎕→ total 50㎕. 각 구성물을 너무 많게 혹은 너무 적게 넣으면 결과에 영향을 미친다.primer는 많이 넣게 되면 그들 끼리 엉겨 붙㎕)DNA303010xBSA5510xBuffer55BamH10.3750.3Nhe10.750.6UPW8.8759.1( * 단위계산은 이미 예비보고서에서 숙지 )③ 유전자, vector에 ligation혼합물의 구성번 호구 분양1vector5㎕2insert1㎕310xBuffer2㎕4T4 ligase0.4㎕5UPW11.6㎕합 계20㎕혼합물을 상온 4시간, 4℃에서 overnight, 15℃에서 4~15시간 효소반응 시켜주었다.vector의 양 x insert site (kb) / vector site (kb) x3/1 = insert의 양100ng x 0.6kb/6kb x3/1 = 30ng260, 280nm 파장에서 DNA의 흡광도를 측정하면 DNA의 농도와 순도를 알 수 있는데,실험에서는 흡광도를 직접 측정하지 않고 전기영동 결과에서 ladder와 비교하여 vector와 insert의 농도를 결정하였다. ( A260 = 약 1 )④ vector, e.coli에 삽입 (transformation)vector : insert 의 비율을 약 1 : 3 으로 하였다.이 비율은 vector와 insert의 크기 차이를 고려해주어 결정하였다.ligation mixture를 competent cell과 반응시키고 (transformation), recovery, cell down,plate에 spread 단계까지 진행시켰으나 colony의 생성을 관찰하지 못함.◆ Discussion유전자 cloning 과정을 4주동안 실험하였다.우선 유전자를 증폭시키는 과정부터 진행하였다. PCR을 하는 과정에서 시료의 양을 정하거나 시간을 정하는 문제는 꼭 이론적인 지식을 따르는 것이 아니라 경험에 의한 것을 참고하여 결정 되었다. 시료의 양이 너무 많거나 적으면 실험의 실패요인이 될 수 있었고 PCR의 시간도 마찬가지였다. PCR이 끝난 것을 전기영동을 통하여 결과를 관찰하였다.예상대로 증폭된 유전자가 600bp 부근에 가장 두꺼운 밴드로 나타났고 위 쪽엔 희미하게 template의 밴드ky end보다 더 어렵다. 따라서 sticky end는 sticky한 pair들끼리 붙어서 ligation을 할수 있는 확률을 높여주는 것이다. 우리 실험의 경우 양쪽을 서로 다른 enzyme으로 처리해 주었기 때문에 방향성 또한 가진다고 볼 수 있다. 이러한 장점 때문에 실험에서 sticky end를사용하는 것으로 여겨진다.이렇게 제한효소 처리한 것을 붙여주어야 한다. ligation 단계에는 T4ligase가 쓰였고 효소반응 단계는 세 가지 온도에서 각각 다른 시간으로 진행되었다. 상온같은 경우에서는 enzyme의 activity가 가장 활발한 온도이기 때문에 4시간 정도만 반응시켰고 약 4℃에서는 가장 긴 시간인 overnight동안 반응시켰다. 다시 15℃에서 4~15시간 반응시켜 주었다. 온도가 낮을경우에 activity는 매우 떨어져 반응 속도가 매우 느려지게 된다. 그래서 온도가 낮아질수록 시간이 길어지는 양상을 띠게 된다. 그러나 온도가 낮으면 base pairing이 잘 된다는 이점이 있다. ligation 과정에서 시간을 정해주는 것도 PCR때와 마찬가지로 이론과 경험적인 요소에 근거하여 시간을 결정하였다.그 다음 최종 단계로 ligation 시킨 재조합 plasmid 분자를 e.coli에 집어넣어 transformation을 시켜주어야 한다. 이때 그냥 e.coli를 쓰는 것이 아니라 plasmid를 잘 받아들일 수 있게 변형을한 후에 반응을 시켜준다. XL1-Blue 방법으로 e.coli를 변형시켰는데 이렇게 실험에 효율을 위해 변형시킨 상태가 competent cell 이다. 이는 세포벽이 약화되어 plasmid 분자를 받아들이는데 어려움을 감소시켜준다. 이렇게 만들어진 competent cell에 ligation mixture를 더해주었다. cell은 10의 7~8제곱개 정도 사용되었고 ligation mixture는 농도를 고려하여 3㎕정도가 쓰였다. 여기에는 vector와 insert가 1 : 3의 비율 정도로 되어있다(개수). 다.

공학/기술| 2009.05.31| 9페이지| 1,000원| 조회(367)

PCR, 증폭, 유전자조작, 전기영동

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FACS(예비) 평가A+최고예요

▣ 실험 목적FACS의 원리, 사용법을 익힌다.세포의 관찰 및 형태학적 특성을 이해한다.▣ 실험 재료- E.coli, Yeast, 동물세포- PBS(0.1% BSA) buffer? PBS는 phosphate buffer silane으로 생리식염수에 인산을 녹여만든 buffer이다.위에 완충액이라 하시는 게 바로 이것이지요. 이것은 세포가 자람에 있어서 생성되는 불순물(대사산물)을 제거할때 비싼 배지를 쓰지않고 이것으로 세척하는 용도로 쓰여진다.더불어 세포의 삼투를 유지하여 세포의 파괴를 방지하는 역할을 한다.- FACS, 원심분리기? 실험용 원심분리기는 실험에 사용되는 물질을 분리, 정제, 농축 할때 쓰는 원심분리기로 상대적으로 크기가 작아 미량원심분리기라고 부르기도 한다.▣ 실험 원리■ 유세포 분석의 배경유세포 분석은 수많은 세포를 fluid column안에서 single flow로 형성하여 laser beam을 통과하면서 각 세포의 크기, 구조 및 과립도 등을 측정하므로 다양한 세포의 특징을 분석할 수 있는 방법이다. 극히 미량의 형광물질도 인지할 수 있어 정확도와 민감도가 높고 다양한 혼합세포군에서 소수의 아형군을 측정 혹은 분리가 가능하다.1930년대에 capersson이 핵산측정에 처음으로 이용한 이후 오늘날은 약 0.1ul의 크기 particle 까지, 또한 하나의 염색 물질당 1000개 이상의 분자까지 측정 가능한 유세포 분석기로 발전해 왔다. 현재 임상에 이용되는 분야는 단일클론 항체를 이용한 백혈병 marker 검사 등 세포 표지자 검사, 세포의 DNA량 측정에 따른 성장 주기 분석, 망상적혈구수 측정, 호중구 기능검사, 항 혈소판 항체 검사 및 망상 혈소판수 검사, 종양단백 검출과 기타 연구목적의 검사 등 무수히 많다.■ FACS의 원리와 특징사람을 포함한 동물의 세포나 입자를 형광색소로 염색하여 세포 내 DNA의 양이나 표면의 특성에 따라 분석하거나 분리할 수 있는 장비.Flow Cytometry란 유액상태(Single Cell Suspen 따라 세포를 분류 또는 숫자를 세어주는 장치이다. 측정하고자 하는 세포집단의 세포들을 각각 하나씩 측정하여 분석하는 특징을 가지고 있다.유액상태의 입자나 세포를 감지하기 위해서는, 일정 파장을 띄는 형광이 표지된 항체 같은, 형광염색소의 표지가 필수적이며, 형광을 감지하는 방법으로는 광원인 레이저광원을 통한 형광의 발광작용을 이용한 다감지부에서 Blue laser가 조사되어 세포의 숫자를 셀 수 있고 레이저의 분산량으로 크기도 알 수 있다.세포분리가 필요할 경우에는 형광 색소에 단일 클론 항체(Monoclonal antibodies)를 부착하여 선택적 분리를 수행할 수도 있다. 형광염색소(Fluorescent dye)와 단일 클론 항체(Monoclonal antibodies)를 사용하여 세포의 표면 및 내부가 갖는 면역상태를 파악하고 세포 혹은 핵 내부의 DNA 양 분석을 통해 종양의 성격을 파악할 수 있는 있다.■ FACS의 구성유세포 분석기는 크게 세 개의 중요한 부분으로 나누어지는데 첫째는 검체의 처리즉, flow cell과 fluidics, 둘째는 빛의 감지 즉 광원, optics, 빛의 산란과 형광의 감지,셋째는 signal processisng으로 데이터의 처리과정이다.(1) fluidics일정압력의 isotonic 액체가 flow sheath 로 유입되어 일정방향 (laminar flow)의 액체기둥(fluid column)을 형성하여 10m/sec의 속도로 흐른다. 이를 sheath fluid라 한다. 검체가 sheath fluid 중앙을 통과하면서 액체 기둥 안에 또 다른 검체액체기둥이 coaxial하게 흐르는 sample core stream이 형성된다. 이 sheath fluid와 sample core stream은 섞이지 않고 sheath stream의 hydrodynamic 한 압력에 의해 검체 액체 기둥 안에 세포는 일정하게 흐르고 laser beam이 세포를 통과하면서 분석하게 된다.얼마나 휼륭한 검사를 하는가는 resolution 광원과 beam의 모양광원은 argon(488nm) 혹은 Helium-neon(633nm) 등이 이용된다.많은 세포가 정확히 laser beam의 중심을 지나기 위해서는 beam의 모양이 매우 중요하다. 원형 beam 경우는 인접한 두서너개의 세포가 동시에 beam의 중심을 통과할 수 있으며, 너무 elliptical 할 경우는 하나의 세포도 완전히 laser 중심을 통과하지 못할 수 있다. 따라서 렌즈로 laser beam이 세포의 흐름에 대하여는 좁게, 넓이에 대하여는 넓은 모양의 beam을 만드는 것이 이상적이다.(3) Signals세포가 laser beam을 통과하면서 두가지 현상이 나타나는데 “light scatter”과 “emission of fluorescence light” 가 생긴다.1) light scatteringlaser beam의 직선방향으로 일어날 경우 forward angle scatter (FS)라 하고 직각으로 분산되는 것을 90? light scatter 혹은 side scatter (SS)라 한다. FS (빛의 회절, diffraction)는 laser beam통과 지점에서 2-13? 사이로 분산되며 주로 세포의 크기를 측정하고, 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별한다. Side scatter (빛의 굴절, refraction)는 세포내 입자와 관련되어 림프구, 단핵구, 과림구를 구별하는데 도움이 된다.Gating이란 FS, SS에 따라 histogram에 분포된 세포중 분석하고자 하는 특정세포를 선택하는 작업이다.2) fluorescence light형광염색시약이 laser 빛을 흡수 후 긴 파장의 빛을 방출하는데 서로 다른 파장에서 excitation과 emission을 한다. 임상에서 주로 사용하는 유세포 분석기는 주로 488nm의 argon laser로 이 파장 보다 긴 파장에서 excitation되는 형광물질이 사용된다. 또한 extinction coefficient가 높아야 하는데 이는 하나의 photon이 빛을 흡 분석에 따른 cell cycle분석세포 표면 단백질의 분석, 세포내의 단백질 분석, 혈소판 측정, 세포의 분류, 세포내 칼슘이온의 검출 및 이동변화, 염색체 분석, RNA 분석, 효소반응 분석, 약리학적 분석, 세포 자살 반응의 연구, 미생물의 검색 등■ E.coli의 유용성대장균을 유전 연구할때 많이 사용하는 이유는 번식속도가 빠르기 때문이다.번식속도가 빠르면 실험을 빨리 수행할 수 있다.대장균의 유전자 조성이 반수체(n상태)입니다. 2n상태인 다른 생물에 비해 아무래도 유전자 조성이 간단하다. 그래서 대장균의 유전자가 대부분 밝혀져서 연구하기가 더더욱 좋아지게 되었다. 그리고 시험관 안에서 여러 개체를 키워서 연구할 수 있기 때문에 통계적인 표본처리에 유리하며, 인공적으로 바이러스에 감염시키는 일도 가능하다. 또한 돌연변이 출현도 자주 일어난다.박테리오파지를 이용한 실험에서 대장균은 숙주의 역할을 합니다.대장균에 들어간 파지는 바이러스의 일종인데 바이러스는 자신이 가지고 있는 효소가 없기 때문에 대장균의 효소를 이용하여 증식하고 생활하게 된다.■ Yeast효모는 균류 중 단세포 형태로 fission이나 budding의 방법으로 무성생식 할 수 있는 종류를 지칭하는 일반적인 용어로서 분류학적으로 효모를 명확하게 구분할 수는 없다. 효모로 분류되는 많은 종들이 균사형태로도 생활할 수 있으며 환경에 따라서 효모형태와 균사형태로 전환해가며 dimorphic growth를 할 수 있다.효모는 자낭균류와 담자균류에서 발견되며, 크게 5개의 분류군으로 나누어 볼 수 있다. 자낭균류에 포함된 효모는 Schizosaccharomyces pompe를 포함한 Archaeascomycetes, Saccharomyces cerevisiae를 포함한 Hemiascomycetes로 크게 나누어 볼 수 있으며, 담자균류의 경우 Urediniomycetes, Ustilagomycetes 그리고 Hymenomycetes로 나누어 질 수 있다. 그러나 각 분류군이 계통분류학적으로 mono이 지나면 혼합물을 밀도 차에 따라 분리해 낼 수 있다. 혼합물끼리 밀도 차는 혼합물을 분리해주는 힘인 중력이 강해질수록 커지므로 인위적으로 중력을 크게 해주면 침전현상을 가속할 수 있다.중력대신 원심력을 이용하면 쉽게 침전현상을 가속시킬 수 있는데 이런 과정을 원심분리라 한다. 원심분리기는 원심분리의 원리를 이용해 성분이나 비중이 다른 물질을 분리·정제·농축하는데 쓰이는 기계이다.물체가 원운동을 하면 관성의 원리에 의해 원의 중심방향에서 원 바깥 방향으로 나가려는 힘이 원심력이다. 원심력의 크기는 질량*반지름*각속도의 제곱이므로 각속도를 조절하면 원심력의 크기를 조절할 수 있다. 원심분리기는 원심력의 크기를 조절하여 물질간의 상대적 밀도차를 조절한다. 원심분리기에서 각속도는 분당 몇 바퀴 회전하는 가를 나타내는 단위인 rpm이라는 단위로 표기된다. 원심 분리되는 물체가 놓여지는 장소인 로터의 위치에 따라 원심분리되는 물질의 회전 반지름이 달라지므로 rpm대신 각속도와 회전반지름을 고려한 G라는 단위가 주로 사용 된다 (1G는 중력과 같은 힘으로써 10G는 중력 10배의 힘에 해당한다.) 실제로 원심분리에 이용되는 힘을 계산할 때는 반지름과 각속도, 원심 분리되는 대상물질의 질량 이외에 물질의 점도, 밀도, 반지름, 부력이 함께 계산된다.■ 원심분리의 방법1. 편차 원심분리 (differential centrifugation)원심분리를 할 때 가장 큰 입자가 먼저 침전되고 질량과 밀도가 같을 때는 보다 구형의 입자가 비대칭형 입자보다 빨리 침전된다. 그리고 원심분리의 속도나 시간을 증가시키면 상대적으로 작은 입자들도 침전된다.편차원심분리는 크기에 따라서 뿐만 아니라 같은 질량의 밀도가 큰 입자와 작은 입자를 분리할 수 있다. 이러한 특성은 크기는 비슷하지만 밀도가 다른 입자를 분리하는데 유용하다. 이 방법의 가장 큰 문제점은 튜브의 위쪽에 있는 큰 입자가 침전되는 동안 아래쪽에 있는 작은 입자와 함께 침전된다는 점이다. 이러한 동시침전을 개선하는 방법은 침전물

공학/기술| 2009.05.31| 8페이지| 1,000원| 조회(1,342)

혈소판, FACS, 항체 검사

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