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mouse골수에서의 cell 분리

mouse bone marrow에서의cell 분리1. Titlemouse골수에서의 cell 분리2. Introductionbone marrow는 soft sponge tissue로 뼈 안에서 발견된다. hips, breast bone, spine, ribs, skull에 있는 bone marrow의 cell은 body의 blood cell을 생산한다.Young embryo에서는 lymphocyte precursor가 처음엔 omentum에서, 나중엔 fetal liver와 yolk sac에 의해 만들어진다. older fetus와 adults의 경우에는 bone marrow가 lymphocyte의 major source를 제공한다.adult의 bone marrow는 세 가지 기능을 한다. lymphocyte를 포함한 모든 blood cells의 원천을 제공할 뿐만 아니라 많은 mononuclear phagocyte를 포함한다. 그리고 blood에서 particulate antigen을 제거한다. 이 antigen은 antibody생산을 자극하고 bone marrow는 antibody의 major source 기능을 한다. bone marrow는 hematopoietic 부분과 vascular 부분으로 구성되어 있다. 이 두 부분은 분리되어 있는데 hematopoietic area는 macrophage와 lymphocyte뿐만 아니라 blood cell의 precursor도 가지고 있다. vascular 부분은 endothelial cell에 의해 line된 blood sinus로 이루어져 있고 reticular cell과 macrophage와 cross되어 있다. 아래 그림은 bone marrow 이다.bone marrow는 body의 secondary lymphoid의 가장 큰 mass이다. 만약 antigen이 intravenous하게 주어진다면 liver와 spleen뿐만 아니라 bone marrow에서도 많이 trap된다. 그러나 primary immune response동안 spleen과 lymph node로부터 antibody는 유도되어 만들어졌었다. response의 end에 따르면 memory cell은 spleen을 떠나 bone marrow에 colonize한다. antigen이 second로 주어질 때, bone marrow는 많은 야의 antibody를 만들어내고 이는 adult rodent에서 IgG antibody의 major source이다. some antigen에 대한 antibody의 생산이 70% 이상 bone marrow로부터 유도된다.3. Materials and methodsmouse : 생후 4주된 C57BL/6핀셋, 해부용 가위petri dish, culture dish, pipette, 1ml 주사기, tube, cell strainerPBS(phosphate-buffered saline), 70% EtOH, alpha MEM(1) mouse에서 femur과 tibia bone 분리1) 경골을 탈골시킨 후 mouse를 alcohol로 소독한다.2) femur과 tibia의 조직을 잘라내고 skin을 제거한 후 근육을 떼어낸다.3) 무릎이 꺾이는 반대 방향으로 꺾어 tibia bone 분리한 후 EtOH에 washing, 그리고 PBS에 담근다.4) femur과 tibia 사이의 연골을 제거하고 femur의 근육을 제거한다.5) 골반에서 femur bone을 탈골시키고 역시 EtOH에 washing 후 PBS에 담근다.(2) cell 분리1) cuture dish에 alpha MEM(세포배양액)을 15ml정도 따른다.2) 1ml 주사기에 세포배양액을 채운 후 tibia bone은 발목 쪽 끝부분을 자르고 무릎 쪽에 있는 연골에 바늘을 찔러 넣어 bone marrow를 빼낸다. femur bone은 골반 쪽 끝부분을 자르고 무릎 쪽 연골에 바늘을 찔러 넣어 bone marrow를 빼낸다. 바늘을 찔러 세포배양액을 bone에 넣으면 세포배양액에 밀려 bone marrow가 빠져 나오게 된다.3) bone marrow가 담긴 세포배양액을 tube에 옮기고1500rpm, 15min 원심분리 한다.4) 원심분리 후 sup은 버리고 적혈구를 터뜨리는 Gey's solution 8.5ml을 pellet에 넣는다. pippeting 후 1500rpm, 5min 원심분리 한다.5) sup을 버리고 alpha MEM을 넣어 뭉친 cell을 풀어준다.6) cell strainer로 macrophage보다 큰 것은 거르고 culture dish에 cell을 깔아준다.4. Results/Discussionmouse를 C57BL/6을 사용하였는데, lab mouse 중 inbred strain에 속한다.이 strain은 아마도 인간질병의 모델로써 사용되기 위해 유전적으로 변형시킨 가장 널리사용되는 유전적 자원일 것이다. 이 strain은 검정색에 가까운 진갈색의 털을 가지고 있다. 실험실에서 가장 널리 사용되는 품종으로 선천적으로 유용한 품종이고, 쉽게 기를 수 있고, 튼튼하며 면역적으로 사람과 비슷하며 번식력이 강하고 수명이 짧아 이번 실험과 같은 실험에 잘 사용이 된다.lab mouse의 다른 strain을 알아보면 다음과 같다.이와 같은 자료를 통해 굉장히 많은 strain이 있고 실험의 목적마다 각각 다르게 쓰인다는 것을 알 수 있었다.직접 bone에서 bone marrow를 추출해 보았는데 bone이 bone marrow의 적혈구 때문에 붉게 보이는 것을 볼 수 있었다. bone marrow를 밖으로 빼내고 나니 bone이 투명해져서 신기했다. 처음 bone 분리 과정에서 PBS(phosphate buffered saline)의 역할은 조직의 해리나 세포의 세정, 분산을 하는 역할을 한다. 그럼으로써 bone을 좀더 깨끗하게 만드는 것이다.평소에 bone marrow를 bone marrow이식으로 접해왔다. 백혈병, 재생 불량성 빈혈 등과 같은 병을 치료하는 방법에 흔히 bone marrow 이식 방법을 사용한다. bone marrow에 있는 조혈모세포가 필요한 것이다. 조혈모세포는 혈액을 만드는 줄기세포를 말한다. 제 기능을 하지 못하는 bone marrow의 조혈모세포를 대치하기 위하여 조혈모세포를 주입해주는 과정으로 방법은 수혈과 비슷하다. 이식된 조혈모세포는 bone marrow 에 정착해서 정상적인 혈액을 만들게 된다. 이식적에 화학요법, 방사선 요법, 그리고 기타 치료방법을 통해 환자의 병든 bone marrow를 모두 파괴시킨 후 환자의 면역체계를 억제한 상태에서 시도된다. 예전에는 주로 엉덩이 뼈의 bone marrow에서 조혈모세포를 채집해왔기 때문에 bone marrow 이식이라고 불려왔으나 요즘은 제대혈액(태반혈액)이나 말초혈액에서도 조혈모세포를 채집하여 이식하기 때문에 조혈모세포 이식이 더 적당한 이름이라고 할 수 있다.우리 몸의 방어체계에는 병을 일으킬 만한 이물질을 찾기 위해 끊임없이 온 몸을 돌면서 감시하는 백혈구들이 있다. 이들 세포들은 자기 것이 아닌 이물질로 판단된 것에 대해서는 결사적으로 대응한다. 따라서 다른 사람의 조직을 이식하면 얼마 되지 않아 파괴된다. 그래서 유전적 동일성 혹은 조직 적합성이 중요한 문제가 된다.일부 백혈구세포는 자기것 이외의 다른 조직을 인식하고 거부할 수 있는 구조를 세포 표면에 가지고 있습니다. 이러한 것을 인간 백혈구 항원(HLA)이라 하고 HLA는 A,B,C,D 등의 항원으로 구성되어 있으며, 공여자와 환자사이에 이 항원이 모두 일치해야 가장 성공적인 bone marrow이식이 된다. 항원이 일치하는지를 알기 위해 HLA 검사와 혼합 임파구 배양검사(MLC)가 필요하고 이 두가지 검사를 하는데는 소량의 피만 있으면 된다. 공여자의 피에서 얻은 세포와 환자의 세포를 함께 5일간 배양하여 결과를 판정하게 되는데 세포들이 죽거나 두 종류의 세포사이에 교차반응이 심하면 HLA 부적합 판정을 한다. 이렇게 bone marrow 적합성을 알아낼 수 있다.

자연과학| 2008.07.25| 11페이지| 2,000원| 조회(675)

분리, 골수, mouse, bone, marrow

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DNA isolation and manipulation of purified DNA

DNA isolation&Manipulation of purified DNA1. TitleDNA isolation & Manipulation of purified DNA2. Introduction* DNA의 특성double strand, complementary, antiparallel, right handed helix* DNA의 종류Chromosomal DNAPlasmid DNAPhage DNA크기4×106bp (E. coli)~3000bp~49000bp특성long-circularsingle copysmall-circularmulti copymedium-linearmulti copy용도유전자 sorcevectorvector분리total DNAchromosomal DNA로부터 분리단백질 제거* DNA의 분리, 정제①재료확보overnight 배양한 E. coli cell 3ml을 e-tube에 1.5ml 옮긴 후 30초동안 원심분리sup제거 후 남은 1.5ml의 배양액 취하여 이 과정 반복 →pellet을 -72℃에 얼린 것②세포파괴삼투압을 유지하고 DNA가 망가지지 않게 Mg2+를 잡아주는 0.15M NaCl-0.1M EDTApeptidoglycan 분해하는 lysozyme solution③불순물제거10% SDS solution과 여러 유기화합물을 깨뜨리는 1.3M NaClO4, 무기물 제거하는 chloroform solution④농축, 정제농축을 위한 100% EtOH⑤정량⑥분리, 분석* 제한효소기능 : DNA를 자르는 효소, 방어기능종류 : 1000가지 이상 발견됨. Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ 세 가지 종류로 나눌 수 있다.사용 ①반응-완충액, 반응온도, 저해요인②불활성화 : 반응 후 다음 과정을 위한 제한효소 제거③분석* PCR (Polymerase Chain Reaction)step1은 94℃, step2는 58℃, step3는 72℃에서 일어난다. 이 cycle이 계속 반복된다.특정한 DNA 분자를 매우 빠른 시간 내에 대량 생산할 수 있다. DNA 복제 원리와 기mer을 첨가한다. primer는 분리된 DNA의 각 가닥에 상보적 염기쌍 결합을 한다. 새로 합성된 DNA 가닥은 다음 복제에 template로 작용하게 되는데, 이와 같은 DNA 증폭 과정이 thermal cycler에 의해 이루어진다.*electrophoresis (전기영동)agarose gel에 DNA와 loading dye를 넣고 전기를 걸어주면 DNA는 인산기 때문에 음전하를 띠므로 매질을 타고 양전하 방향으로 움직이게 된다. 이때 움직이는 속도는 DNA의 크기, 모양에 따라 다르므로 매질 내에서 종류에 따라 분리하게 되며 전기영동은 DNA의 크기, 분리, 양의 확인이 가능하다. loading dye는 agarose gel의 well에 DNA를 넣어줄 때 DNA용액을 무겁게 하여 홈으로 가라앉히는 역할을 하며 그 성분에 전기영동되는 속도가 다른 두개의 염색시약이 들어 있어 DNA와 같이 전기영동되며 DNA의 전기영동된 정도를 알 수 있게 하는 역할을 한다. 염색시약으로는 EtBr (Ethidum Bromide)을 많이 쓴다.3. Materials and methodsⅠ. DNA isolationⅠ-1. Isolation of chromosomal DNA in E. coliovernight-cultured E. coli, Lysozyme solution (10mg/ml), 1.3M NaClO4,100% EtOH, 70% EtOH, 0.15M NaCl-0.1M EDTA, 10% SDS solution, Chloroform + Isoamyl alcohol (24:1), TE buffer (Tris 10mM-EDTA 1mM)0.15M NaCl-0.1M EDTA 100㎕↓ vortexinglysozyme 10㎕↓ 37℃ for 30min10% SDS 40㎕↓ 60℃ for 10min1.3M NaClO4 350㎕↓Chloroform solution 500㎕↓ invert for 1min, centrifuge 12000rpm for 5minsup+1ml 100%M EDTA (pH 8.0) )SolⅡ (0.2M NaOH, 10% SDS)SolⅢ (5M Potassium acetate, Glacial acetic acid)Phenol : Chloroform (1:1), 100% EtOH, 70% EtOH, TE bufferSolⅠ 100㎕↓ vortexing and perfectly resuspendSolⅡ 200㎕↓ invertSolⅢ 150㎕↓ invert and place ice for 5mincentrifuge 12000rpm in 4℃ for 10min, transfer sup to new tubephenol : chloroform 1:1 sol. 450㎕↓ vortex for 1min, 12000rpm for 2min, transfer sup to new tube100% EtOH 900㎕↓ mix and centrifuge 12000rpm for 10min, sup 제거washing the pellet with 70% EtOH 500㎕↓ 12000rpm for 2min, sup 제거pellet 건조↓resuspend by TE buffer 20㎕Ⅱ. Manipulation of purified DNAⅡ-1. DNA amplification by PCRTemplate : DNA fragment [108 copies/㎕], Sense primer [8 pmole/㎕]Anti-sense primer [8 pmole/㎕], PCR buffer(10x), MgCl2(50mM)10mM dNTP mix, Taq DNA Polymerase [5 u/㎕], Autoclaved H2OPCR tubes(0.5ml), Electrophoresis kitPlasmid DNA 1/100 dilution↓시약Plasmid DNA-1Plasmid DNA-2Template [108 copies/ul]1ul1ulPrimer [8 pmole/㎕]Sense1ul1ulAnti-sense1ul1ulTaq DNA Polymerase [1u/ul]0.triction Enzyme(Sph1) [5 u/ul]10X enzyme buffer, Autoclaved H2O, Electrophoresis kit시약Chromosomal DNAPlasmid DNAtemplate3ul3ulSphⅠ1ul1ulenzyme buffer2ul2ulRNase1ul1uldH2O13ul13ultotal volume20ul20ul↓incuvation in 37℃ for 1hrⅡ-3. Gel electrophoresisDNA sample, Electrophoresis kit, 1% Agarose gel, EtBr (Ethidum Bromide)DNA loading dye1234567891011sample(ul)marker(1.5)C. DNA-1(3)C. DNA-2(3)C. DNA-1enzymecutting(13)C. DNA-2enzymecutting(13)P. DNA-1(3)P. DNA-2(3)P. DNA-1enzymecutting(13)P. DNA-2enzymecutting(13)PCR-P. DNA 1(7)PCR-P. DNA 2(7)dye(ul)1X dye(13.5)1X dye(12)1X dye(12)6X dye(2)6X dye(2)1X dye(12)1X dye(12)6X dye(2)6X dye(2)1X dye(8)1X dye(8)total(ul)*************515151515↓electrophoresis for 40min, 100volt4. Results10Kb -------3Kb --------2Kb --------1Kb --------chromosomal DNA → c.DNAplasmid DNA → p.DNAE.C → enzyme cutting5. Discussion약plasmid DNA1은 plasmid DNA2를 재조합한 DNA이다. SphⅠ에 의해 잘려진 위치를 보면 위 그림과 같다. 처음 p.DNA2에서 SphⅠ에 의해 잘려져 3.7Kb, 8.6Kb 이렇게 두 조각으로 나눠지게 된다. 재조합된 DNA 즉 pDNA1에nzyme에 의해 조각이 많이 나서 band가 흐릿하게 뭉쳐진 것을 볼 수 있다. p.DNA1과 p.DNA2는 각각 10.4Kb, 12.3Kb 정도임을 알 수 있다. p.DNA2가 p.DNA1의 band보다 약간 위쪽에 위치하고 있다. p.DNA1-E.C를 보면 예상했던 바와 같이 8.6Kb 즉 10Kb보다 아래, 1Kb, 800bp 부근에 band가 보인다. 하지만 2Kb 근처에 band가 나타난 것으로 봐서 제대로 정제되지 않음을 알 수 있다. p.DNA2-E.C에서도 예상했던 것처럼 8.6Kb, 3.7Kb 부근에서 band가 관찰된다. p.DNA2-E.C에서도 정체를 알 수 없는 band가 하나 더 관찰되었는데 역시 정제가 잘 되지 않았음을 알 수 있다. 다음으로 PCR-plasmid1의 경우는 재조합된 600bp의 조각만 증폭되었기 때문에 600bp에서 하나의 band가 나타나야하지만 우리 조의 실험 결과에서는 볼 수 없었다. template DNA를 희석할 때 잘못 되었거나 워낙 극소량의 시약을 다루다보니 PCR이 잘 되지 못했다고 생각한다. 마지막으로 PCR-plasmid2에서는 증폭될 것이 없기 때문에 아무런 band도 나타나지 않았다.이번 실험은, 특히 PCR에서는 시약을 극소량을 사용한다. 매우 세심한 주의를 기울일 필요성이 있다고 생각한다. 또 주의할 점은 supernatant를 딸 때에는 pellet에 팁이 닿지 않게 하고 vortexing과 inverting을 할 때에는 DNA가 깨지지 않게 조심하는 것이다.예상했던 것이 아닌 새로운 band가 나타난다면 DNA가 제대로 정제되지 않았거나 혹은 외부 오염물질일 수도 있을 것이다.우리 조의 실험결과가 예상했던 바와 똑같이 나오지 않아서 아쉬웠지만 그로 인해 그만큼 더 많이 생각하고 좀 더 공부할 수 있었던 기회가 되었다.6. ConclusionsChromosomal DNA와 Plasmid DNA는 각각의 특성 차이를 이용하여 분리를 한다. 정제된 DNA를 제한효소를 사용하여 자르거나 PCR d

자연과학| 2008.07.25| 8페이지| 2,000원| 조회(422)

분리, DNA, 정제, purification, isolation

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Determination of growth

1. SubjectDetermination of growth2. Object배양조건에 따른 세포 성장 측정을 흡광도와 개체 측정으로 비교 조사3. Materialscell culture (fungi), hemacytometer, cuvette2, 4, 6, 8 시간 culture 준비/ fix함 (6% formaldehyde 첨가)YPD culture4. Introductionprokaryotic microorganism : 이분법, 적정 환경 시 매 20분마다 분열eukaryotic microorganism : cell cycle ( G1, S, G2, M, cytokinesis)그림 growth curvecontinuous exponential growth유지를 위해 special device필요; )chemostat and equivalent volume- colony countingculture - serial dilution - counting - plating- 전체균체량 dried cell mass의 측정culture - filter(여과지 무게 잼) - 여과지 통과 - drying - weighing(여과지 무게 뺌)- 균체 질소의 측정(nitrogen content of dried mass)미생물의 경우, dry weight의 16%가 질소 함량, 질소 함량×6.25=단백질 함량대사 및 생리 작용의 활동 상황 조사- 흡광도 측정OD (optical density) 혹은 Absorbancyspectrophotometer)를 이용하여 E.coli는 600nm, fungi는 660nm에서 흡광도 측정- total numberhemacytometer 사용 ; cell number 계산 : 1mm x 1mm x 0.1 mm = 0.1 mm3= x 104 /ml그림 2 hemacytometer그림 3 sample added here그림 4 현미경으로 관찰 가능한 counting areahemacytometer그림 5 cell counting가로 세로 0.1cm이고, 높이는 0.01cm이므로 volume은 0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml그림 5의 왼쪽 그림은 현미경으로 cell을 봤을 때의 예를 나타낸다. 빨간 점이 cell의 한 colony를 나타내는데 굵은 선에 걸리는 cell은 확률적으로 생각해서 붉은 선으로 표시된 두 변에 걸리는 cell은 counting한다. 전체 사각형에 들어있는 cell을 counting해도 되나 일반적으로 오른쪽 그림에서 표시된 바와 같이 대각선 5칸만 세고 그 값에 5를 곱하여 전체의 양을 추측할 수 있다. 왼쪽 그림의 예에서는 한 칸에 cell colony가 3개로 counting할 수 있다.5. Methods0시간, 2시간, 4시간 culture한 sample은 cuvette에 800λ씩 넣는다.6시간, 8시간 culture한 sample은 spectrometer가 읽을 수 있는 정도에 맞춰주기 위해 1/20으로 희석을 한 후 800λ를 맞춰 cuvette에 넣는다.cell이 가라앉아 있으므로 충분히 voltex 후 cuvette에 넣는다.sample cuvette과 blank가 채워지면 OD를 측정한다.① cell culture② dilute the sample by dilution factor③ hemacytometer에 10ul 주입④ counting the cell number6. ResulthourOD00.23920.47341.09463.0485.5hourcell number*************7. DiscussionOD를 측정한 값을 그래프로 그려보았더니 예상했던 그래프와는 다른 모습이어서 아쉬웠다. 정석 그래프로 나오지 않은 이유를 여러 가지 생각해 본 결과 dilution할 때 제대로 mixing되지 않았거나, voltex를 충분히 하지 않았을 확률이 높다. 어떤 실험이든 정확하고 주의 깊고 세심하게 해야 한다는 것을 다시 한 번 깨닫게 되었다. 약간의 실수가 너무 다른 결과를 가져왔기 때문이다. 결과를 분석해 보면 cell이 오래 culture될 수록 흡광을 잘 하는데 우리의 실험 결과에서는 거의 비례한다고 나왔으나 우리가 배운 이론에서는 growth graph는 어느 정도의 수준에 이르면 포화상태가 된다고 하였으므로 우리의 실험은 약간 빗나간 것을 알 수 있었다.cell number counting은 측정할 때 마다 cell이 움직여서 여러 번 측정해서 팀원들끼리 점검해 보기가 힘들었다. 그래서 한 번에 정확하게 counting해야만 했다. 0시간 culture된 것은 counting하지 않았다. OD측정 때처럼 시간이 지날수록 cell이 많이 자란 것을 알 수 있었다. OD의 그래프와 비슷한 양상을 띠고 있고 cell이 움직여서 counting할 때 약간의 오차가 발생하지 않았을까 한다.

자연과학| 2008.07.25| 5페이지| 1,500원| 조회(281)

cell, OD, 흡광, Growth, counting

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Yeast Mating

Yeast Mating1. SubjectYeast Mating2. Objectmating을 통하여 다양한 유전형질을 나타내는 recombinants 제조.mating 후 얻은 diploid를 sporulation했을 경우 가능한 tetrad의 genotype design.3. MaterialsYeast cell균주 genotypeMS10 MAT a ura , leu, adeECY 36-3A MAT α ura , leu, trpMS147 MAT a ade, trp, lysMY1124 MAT α ura , leu, hisamino acid - 100x ura, 200x leu, 200x ade, 200x trpreplica틀, 벨벳 조각, 핀셋, spreader, 백금이YPD plate, SD plate4. Introduction이번 실험에서 한 Mating은 두 균주의 혼합으로 새로운 형질을 만들어내어 새 균주 개발에 쓰이는 방법이다. 우리가 한 Yeast mating은 haploid상태에서 mating해 diploid상태가 되는 S.ceresiviae나 diploid상태에서 mating해 tetraploid가 되는 C.albicans와는 달리 다음과 같은 방법으로 mating을 한다.haploid +haploid -- replication (N→2N, N→2N)karyogamy (2N+2N=4N)meiosis → )tetrad → tetrad analysis)nucleus에서는 one set of chromosome+one set of chromosome이 2set of chromosome이 된다. 다른 allele의 상보성을 가진다.아래는 이번 실험에서는 auxothrophic marker를 가진 균주를 사용하는데 이에 대한 것이다. 이 예로 Leucine을 필요로 하는 auxotroph를 들었다.substrate1→substrate2→substrate3→Leucine↑ ↑ ↑enzyme1 enzyme2 enzyme3↑ ↑ ↑gene1 gene2 gene3이것이 Leucine을 만들어내는 과정인데 우리가 임의로 gene3를 파괴시키면 enzyme3를 만들지 못하게 되고 결국 Leucine을 만들지 못해서 외부에서 Leucine을 주입해줘야 하는 mutant가 만들어진다. 이번 실험에서는 이런 mutant를 사용한다.MS10의 경우에는 ura, leu, ade를 외부에서 필요로 하는 mutant이다.5. Methods서로 mating type이 다르며 다른 auxotrophic marker를 가진 두 균주를 mixing한다. 위의 Materials 참조. ×는 mating을 의미한다.① MS10 × ECY 36-3A (supplement : ura, leu)② MS10 × MS147 (supplement : ade)③ MS10 × MY1124 (supplement : ura, leu)④ ECY 36-3A × MS147 (supplement : trp)⑤ ECY 36-3A × MY1124 (supplement : ura, leu)⑥ MS147 × MY1124mating하여 얻은 diploid를 배지 조성이 다른 plate를 supplement를 첨가하여 만들어 각각의 supplement 배지에 replica method(replica 틀에 벨벳 천 조각을 씌우고 mix된 균주를 묻혀 새 배지에 도장처럼 찍는 것)를 이용하여 plating한다. plate를 만들 때 supplement로 100x ura는 20λ씩, 200x인 leu, ade, trp는 100λ씩 넣는다. replica를 할 때 벨벳 조각은 핀셋으로 다루고 오염되지 않게 조심한다.6. Result(이 report에서 편의상 MS10, ECY 36-3A, MS147, MY 1124를 각각 ㄱ, ㄴ, ㄷ, ㄹ이라고 표기한다.)matingsporulation on supplement plates7. Discussionreplica한 각각의 plate를 incubator에 넣고 이틀 후에 관찰을 하면 위와 같은 결과를 얻을 수 있다. 예상한 결과로는 ura, leu plate에서는 ㄱ×ㄴ, ㄱ×ㄹ, ㄷ×ㄹ, trp plate에서는 ㄴ×ㄷ, ㄷ×ㄹ, ade plate에서는 ㄷ×ㄹ, 아무것도 보충하지 않은 plate에서는 ㄷ×ㄹ만 나올 것이라 생각했다.ㄱ×ㄷ과 ㄴ×ㄹ 즉 MS10 × MS147과 ECY 36-3A × MY1124의 경우는 mating type이 달라서 mating이 되지 않았을 거라 예상했다.실제 나온 결과로는 ura, leu plate에서 ㄱ×ㄴ, ㄱ×ㄹ, ㄷ×ㄹ, trp plate에서는 ㄷ×ㄹ, ade plate에서는 ㄷ×ㄹ, 아무것도 보충하지 않은 plate에서는 ㄷ×ㄹ이 grow된 것을 볼 수 있었다. trp plate에서 ㄴ×ㄷ이 보이지 않았는데 이 이유로는 제대로 mating되지 않았거나 또는 trp plate에 곰팡이가 핀 것을 보아 plate 오염을 들 수 있다. 완벽한그리고 실제 결과에서도 ㄱ×ㄷ과 ㄴ×ㄹ는 mating type이 서로 달라 mating이 되지 않았기 때문에 결과가 나오지 않았다.아래는 mating한 균주의 genotype을 추측한 것이다. (MATa/MATα 의 순서)대문자는 wild type을 나타낸다.ㄱ×ㄴ: ura/ura, leu/leu, ade/ADE, TRP/trpㄱ×ㄹ: ura/ura, leu/leu, ade/ADE, HIS/hisㄷ×ㄴ: ade/ADE, URA/ura, trp/trp, LEU/leu, lys/LYSㄷ×ㄹ: ade/ADE, URA/ura, trp/TRP, LEU/leu, lys/LYS, HIS/his이 실험에서 약간의 부주의가 굉장히 다른 결과를 가져올 수 있는 것을 깨달았다. 멸균이 제대로 되지 않았는지 plate에서 곰팡이가 발견되었고 이로 인해 결과가 제대로 나오지 않았을 수도 있을 것이란 생각을 하였다. 다른 어떤 실험보다 미생물 실험에서는 멸균과 주의가 필요한 것을 알게 되었다.

자연과학| 2008.07.25| 5페이지| 1,500원| 조회(950)

yeast, recombination, mating

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단백질 분리정제 및 기능분석 - DEAE sepharose anion exchange chromatography 평가A좋아요

단백질 분리정제 및 기능분석-DEAE sepharose anion exchange chromatography과목 : 생명과학실험Ⅰ담당 : 배윤수 교수님학번 : 0603120학과 : 자연과학대학 생명과학과이름 : 이은서제출일 : 2007년 3월 27일1. 실험주제단백질 분리정제 및 기능분석을 위한DEAE sepharose anion exchange chromatography2. 실험목표Column chromatography를 이용하여 Alkaline phosphatase를 분리한다.3. 실험 도구 및 방법-실험 도구stand, beaker, column, pipet, e-tube, 15㎖ tubeDEAE, elution buffer, Alkaline Phosphatase-실험 방법ⅰ. 각 traction을 받을 10개의 e-tube를 준비한다.- 각 tube에 labelling을 하고, 500㎕ 지점을 표시한다.ⅱ. 원액 enzyme solution을 조금 덜어 놓는다.-------------------①ⅲ. Packing the columns : 10 vol. of lysis buffer wash(Bead를 washing 할 때에는 wash buffer를 Bead volume의 10배를 넣어washing 한다.이번 실험의 경우 Bead volume의 10배는 5㎖이고 한번에 1㎖씩 5번 washing 한다.)ⅳ. Load the protein solution on DEAE column : flow through-----②flow through는 +charge를 띠는 물질들이 아래로 빠져 나간 것이며①과 ②는 대조군으로써의 역할을 한다.(Protein mixture은 5㎖이고 10mg/㎖이므로 총 protein은 50mg이다.)ⅴ. Step elute the protein with 2 vol. buffer- NaCl 50mM elution--------------------------------③/④- NaCl 75mM elution--------------------------------⑤/⑥- NaCl 125mM elution--------------------------------⑦/⑧- NaCl 200mM elution--------------------------------⑨/⑩Bead vol. 500㎕ 씩 나눠서 e-tube 1㎖을 받는다.ⅵ. Alkaline Phosphatase의 purity와 activity 실험을 위해 분리한 각 fraction을 -70℃ 냉동고에 보관한다.4. 실험 이론 및 원리* DEAE columnDEAE (diethylamino ethyl)-CH2CH2N+H(CH2CH3)2DEAE는 Functional Ligand 즉, DEAE에 +전하가 붙어야 작용이 가능하므로 촉촉한 상태를 유지해야 하며, 따라서 buffer에 보관한다. buffer와 함께 있는 DEAE 상태를 Slurry 상태라고 한다.buffer와 DEAE는 1:1 의 비율을 유지한다.DEAE는 +charge를 띠므로 -charge를 띠는 protein (예를들면 Alkaline Phosphatase) 을 제외하고, +charge를 띠는 물질들은 column 아래로 빠져 나가게 된다.Ion-exchange chromatography는 column chromatography의 한 종류로 gel 여과 chromatography와 병행한 일반적인 정제방법이며, 가용성 단백질의 대부분에 걸쳐 적용이 가능하다.Ion-exchange chromatography는 anion exchange chromatography (negative ion exchange chromatography)와 cation exchange chromatography (positive ion exchange chromatography)로 나눌 수 있는데 이번 실험의 경우는 anion exchange chromatography이다.아래 그림은 anion exchange chromatography의 원리를 나타낸다protein은 acidic protein에서 basic protein까지 광범위하게 분포한다. acidic protein은 negative ion resin에, basic protein은 positive ion resin에 전하 정도에 따라 다른 강도로 정전기적 결합을 한다. protein을 결합시킨 column에 서서히 염농도를 증가시켜 protein을 용출한다.ion-exchange chromatography는 대표적인 chromatography로 protein의 처리능 및 분리능이 모두 높아 저압 chromatography의 초기 정제 및 고압 chromatography에 의한 최종 단계의 정제에 사용되고 있다.* Partition Theory일반적으로 두 상이 동일한 용질을 포함한다면 용질은 두 상 사이에서 분포하게 될 것이다. 이것을 분배라 하며 이와 관련된 평형은 두 상에서 용질 농도의 비인 분배계수 K로 나타내어진다.상은 Stationary phase (정지상) [Bead]Mobile phase (유동상) [Buffer water]이렇게 2개로 나타난다.만약 물질 A, B에 대하여 Stationary phase와 Mobile phase가아래의 표와 같다면StationaryMobileAHLBLH이와 같은 결과가 나오게 될 것이다.elution 되므로 A와 B를 구분할 수 있다.그 원리는아래 DEAE 그림에서 보면 알 수 있다.CH2CH3(+) /CH2CH3-N＼CH3CH2(+) (-)B A만약에 (-)(-)를 띠는, 즉 A보다 더 강한 -charge를 띠는 물질 C가 있다면 상대적인 charge에 의해 DEAE에 C가 A보다 많이 붙게 되므로 C와 A가 같은 -charge를 띠더라도 charge의 세기에 따라 C와 A를 분리해 낼 수 있다.elution buffer NaCl에서 봤을 때 NaCl은 Na+와 Cl-로 이온화 되므로Cl-가 DEAE로 가면 A와 경쟁해서 A가 떨어진다.Cl-가 2개가 가면 C가 떨어진다.라는 것을 알 수 있다.따라서 결과는 아래와 같이 분리가 된다.그래서 최종적으로 elution에 따른 A, B, C의 최종 결과는 아래와 같다.* 주의사항Column에 pipetting을 할 때 DEAE에 팁이 빠져 구멍이 나지 않게 주의한다. 또, elution buffer을 pipetting 할 때에는 천천히 조금씩 흘러들어가게 하여야 한다. 세심한 주의를 기울여 하지 않으면 제대로 된 Column Chromatography를 할 수 없다.그리고 위에서 언급했듯이 Bead는 항상 moisture 상태여야 한다. 그래야 작용할 수 있기 때문이다. 따라서 dry하지 않게 조심해야 한다.이번 실험에서는 Column에 waste가 많아서 버렸지만 보통 여러 번 쓴다. 한번 사용한 Column을 나중에 다시 사용하기 위해서는 역시 위에서 언급했듯이 Bead와 buffer를 1:1의 비율을 맞춰 buffer를 넣어서 Bead가 마르지 않게 보관해야 한다.또한 tube를 손으로 잡을 때에는 아래를 잡지 않는다. 사람의 손에도 전하가 있기 때문에 조심해야 한다.Column Chromatography는 정확성과 세심한 주의가 필요한 실험이다.5. 토의이번 실험은 어렵지는 않지만 꽤나 주의를 기울여야 했다. elution buffer를 pipet으로 넣고 column 아래에서 e-tube에 받기만 하면 됐지만 Bead가 마르지 않게, 그리고 각각의 다른 농도의 elution buffer끼리 섞이지 않게 하기 위해서 하려면 매우 조심해야 했다.column에 pipet으로 elution buffer를 넣는 과정이 어려웠다. 힘 조절도 잘 해야 했고, 팁도 빠지지 않게 조심해야 했기 때문이다. 팁이 Bead에 빠져서 Bead에 구멍을 내면 재실험을 해야 한다는 생각에 조원들은 매우 조심을 하며 실험을 했던 것 같다.내가 실험실에 있을 때에는 균을 다루어서 팁을 autoclaving시킨 후 직접 손으로 만져서도 안되었고, e-tube도 autoclaving 시킨 후 꺼내자마자 바로 뚜껑을 닫았었기 때문에 나는 pipet 팁을 손으로 만지지 않고 pipet에 끼웠는데 우리 조에 있었던 조교님께 손으로 꼭 안끼운다고 지적을 받았던 것으로 봐서 이번 실험은 오염도가 별로 중요하지 않은 것 같았다. 혹은 입자가 컸기 때문인지도 모른다.

자연과학| 2007.05.08| 8페이지| 2,000원| 조회(2,673)

단백질, elution, Column, 분리정제, DEAE

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