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생명분자공학실험 보고서

생명분자공학실험생명공학 전공 교육목표생명공학 전공에서는 생물 산업 분야에 대한 전문지식과, 집중적인 설계 교육을 통하여 창의적, 분석적, 통합적인 사고능력을 함양하고, 이를 바탕으로 공학제반 문제를 정의하고 스스로의 힘으로 해결하는 능력을 갖춘 엔지니어가 됨을 목표로 한다. 이러한 목표 달성을 위한 생명공학 전공 세부 교육목표는 다음과 같다.1. 생명공학 분야의 전문 이론, 실험 및 설계 능력을 습득하고 이를 활용하여 생명공학 전반의 문제 해결능력을 갖춘 현장 중심의 엔지니어가 된다.2. 미래지향적인 생명공학 전문교육을 통해 창의적 사고를 갖춘 생명공학 전문 인력이 된다.3. 건전한 윤리의식과 문화적 소양 교육을 통하여 국가 발전에 공헌하고 사회적, 윤리적 책임의식을 갖춘 전문 엔지니어가 된다.4. 국제화 및 정보화된 전문 교육을 통해 국제적 감각을 겸비한 엔지니어가 된다.미국 국립 직업 공학인 협회 윤리 헌장NSPE (National Society of Professional Engineers) Code of Ethics of EngineersEngineers, in the fulfillment of their professional duties, shall:1. Hold paramount the safety, health and welfare of the public.2. Perform services only in areas of their competence.3. Issue public statements only in an objective and truthful manner.4. Act for each employer or client as faithful agents or trustees.5. Avoid deceptive acts.6. Conduct themselves honorably, responsibly,ethically, and lawfully so as to enhance the honor, reputation, and usefulness으로 활성 측정에는 LDH assay를 이용하였다.실험방법 및 시약1. Gel filtration chromatography를 이용한 LDH 단백질의 정제Gel filtration chromatography에서는 분자의 크기가 다른 혼합물을 부풀은 겔 입자층 사이로 통과시키면 큰 분자들은 겔의 입자와 입자사이를 빠져나가 빨리 이동하여 먼저 용출되지만, 입자가 작은 분자들은 겔 입자 내부에 있는 작은 틈새 속으로 끼어 들어가 이동의 방해를 받아 늦게 용출된다.[1]단백질정제PD10 column을 washing(D.W. 25㎖)한 후 sample(Ammonium sulfate, LDH 혼합액 2.5㎖)을 넣는다. 그 후, 1차정제(D.W. 3.5㎖), 2차정제(D.W. 3.5㎖)한다.단백질분석LDH assay와 CaSO4침전반응을 통해 두 정제물을 확인한다.2. Ion exchange chromatography를 이용한 LDH 단백질의 정제Ion exchange chromatography는 특정물질(resin)을 이용하여 각각의 극성에 따라 물질을 분리한다. 양극성의 resin은 음극성의 물질을, 음극성의 resin은 양극성의 물질을 끌어당긴다. 이때 극성이 강할수록 resin에 당겨붙는 힘이 강하게 된다. 이 원리를 이용하여 column속에 resin에 붙은 물질을 이보다 이온세기가 점차 강한 용액을 통과시킴으로써 서서히 빠져나오게 하여 분리할수 있다.[2] 단백질은 pH에 따라 다른 전하를 가짐으로 pI값을 통해 적당한 column과 buffer를 선택한다.단백질정제Anion exchange chromatography(resin에 음전하를 띤 물질이 붙음)를 사용하였으며 buffer로 20mM Tris-HCl pH5.0을 사용하였다. FPLC를 0.5㎖/min으로 맞추고 sample(LDH, BSA 혼합시료 3㎖)을 injection후 NaCl 농도를 최초 0%에서 10분 간격으로 10%씩 30%까지 증가시키면서 각각 용출액을 받는다.단백질분석280㎚에서 흡광ercaptoethanol이나 DTT(Dithiothreitol) 등의 환원제는 단백질의 disulfide 결합을 절단한다. 이 환원제 존재하에서 음이온 계면활성제인 SDS(sodium dodesyl sulfate)로 처리하면 수용성 단백질과 결합하여 SDS-단백질 복합체를 형성한다. 이 복합체를 형성함으로써 각 단백질 특유의 고차구조가 파손되어 polypeptide 사슬의 상태가 된다. 이 단백질을 SDS 존재하에서 polyacrylamide 전기영동을 실시하면 polypeptide 분자가 분자량에 따라 분리된다.[4]전기영동1번sample(esterase 단백질 시료 5㎕, 5x sample buffer 2㎕, upw 3㎕)과 2번sample(α-synuclein 단백질 시료 12㎕, 5x sample buffer 3㎕)을 전기영동한다.3.2. Agarose gel을 이용한 DNA의 전기영동Agarose gel 전기영동Agarose gel 전기영동은 agarose의 특성을 이용하여 수백bp~수kb에 이르는 비교적 큰 핵산의 분리에 자주 이용된다. 수평형 전기영동장치에 buffer를 채우고 그 안에 agarose gel을 가라앉혀 전기영동을 실시하는 방법이 일반적이다. agarose의 분자체 효과를 이용하고 있으며, 염기배열과 상관없이 핵산의 분자크기에 의해서만 분리할 수 있다.[5]전기영동두 개 조는 제한효소가 처리된 plasmid DNA를, 나머지 두 개 조는 제한효소 처리가 되지 않은 plasmid DNA를 전기영동한다. 그리고 조 공통으로 미지의 DNA시료를 전기영동한다.4. 단백질과 DNA의 정량4.1. 단백질의 정량4.1.1. Bradford assayBradford assay는 용액상태의 단백질 농도를 측정하는데 있어서 간단하면서도 정확한 방법이다. 단백질 수용액에 산성 dye를 첨가하여 spectrophotometer를 이용하여 595㎚의 파장에서 O.D.를 측정하는 것이다. 이는 다양한 단백질의 농도에 대해서 염료의 색깔 변화가 달라지는 것을aline reagent 4㎖를 가해주고 상온에서 10분 후, 2배 희석된 Folin reagent 400㎕를 가해준다. 상온에서 30분 후 750㎚에서 흡광도를 측정한다.4.2. DNA의 정량과 순도 측정흡광도를 이용한 DNA 농도측정핵산은 자외선(260㎚ 근방)을 강하게 흡수하는데, 이것은 purine 및 pyramidine 염기가 여러가지 공명구조를 가지기 때문이다. DNA의 자외선 흡수스펙트럼 pH에 따라서 변하는데, 이것은 pH가 각 염기의 작용기들의 이온화에 영향을 주기 때문이다. 개개의 염기들은 각기 특성적인 자외선 흡수스펙트럼을 가지며 핵산의 총흡광도는 핵산을 구성하는 염기들의 총흡광도의 합과 같다고 생각할 수 있기 때문에 260㎚에서 흡광도를 측정하여 DNA의 농도산출에 이용하고 있다. 한편 280㎚에서의 흡광도를 층정하여 A260/A280의 비를 계산함으로써 혼입된 단백질 함량을 분석하는 데에도 이용할 수 있다.[8]DNA의 정량과 순도 측정DNA 시료(pET21, pQE30)를 10mM Tris-HCl pH 7.5 용액으로 60배 희석하여 0.6㎕ 준비한다. 10mM Tris-HCl 용액으로 reference를 설정해 주고 DNA 시료의 흡광도를 260㎚, 280㎚에서 각각 측정한다.5. LDH의 활성 측정Lactate dehydrogenase의 활성을 아래와 같이 LDH assay를 이용하여 측정한다.β-NADHpyruvate1.0% BSALDH1(blank)2.8㎖0.1㎖--2(negative)2.8㎖0.1㎖0.1㎖-3(positive)2.8㎖0.1㎖-0.1㎖결과 및 고찰1. Gel filtration chromatography를 이용한 LDH 단백질의 정제O.D.1차정제물 0.1㎖NAD 2.8㎖pyruvate 0.1㎖2차정제물 0.1㎖NAD 2.8㎖pyruvate 0.1㎖BSA 0.1㎖NAD 2.8㎖pyruvate 0.1㎖최초0.5950.6560.6565분후0.4300.6440.6435분후-최초-0.165-0.012-0.013왼쪽 : 78pH가 5.0인 버퍼를 사용하여 음이온 교환수지를 사용하였다. 그렇기에 pI가 5보다 낮은 단백질은 음전하를 띄므로 resin에 달라붙어 있다가 NaCl 농도를 높여줌에 따라 Cl-가 붙어있던 단백질을 떨어뜨리고 자신이 붙을 때 용출되므로 늦게 용출되고, pI가 5보다 큰 단백질은 양전하를 띄어 먼저 용출됨을 예상할 수 있다.최초 NaCl 0% 일때 단백질의 존재를 확인하였고 LDH assay에도 반응하였으므로 LDH라고 생각할 수 있다. 그런데 NaCl 20%일때 단백질은 확인 못했지만 LDH assay에서의 흡광도 변화가 눈에 띄게 더 크다. 이를 정리하자면 NaCl 0%일때 LDH assay 흡광도차를 잘못 측정, NaCl 20%일때 280㎚에서 흡광도 값을 잘못 측정한 것으로 생각할 수 있다. 따라서 NaCl 0%에서 용출된 용액이 BSA, NaCl 20%에서 용출된 용액이 LDH이다.3. 단백질과 DNA의 전기영동3.1. SDS-PAGE를 이용한 단백질의 전기영동과 분자량 측정32.5kDa16.5kDa5x sample buffer는 SDS, 글리세롤, DTT, Bromophenol blue등으로 구성된다. 실험방법에서 언급하였듯이 DTT가 단백질의 disulfide결합을 절단, SDS가 여기에 결합하여 전기영동시에 분자가 분자량에 따라서 분리된다. Bromophenol blue는 시료가 투명하기 때문에 전기영동때 얼마나 주입할지 확인하기 위해 시료가 눈에 보이도록 염색해주는 역할을 한다.전기영동 결과 esterase는 32.5kDa, α-synuclein은 16.5kDa의 분자량을 확인하였다. 실제로는 carboxylesterase는 26598.48Da, α-synuclein는 14520.17Da[9]으로 근접하다.3.2. Agarose gel을 이용한 DNA의 전기영동1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13결과를 보면 2, 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11, 12가 같은 위치에 있어 같은 DNA라는 것을 확인할 수 있다. 그리고 있다.

공학/기술| 2010.09.10| 5페이지| 1,000원| 조회(220)

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