*Western blot 정리. DNA-DNA hybridization RNA-DNA Protein-Protein원리:-항체를 detection tool로 이용.??단백질 -1차Antibody-2차 Antibody-발색체?1) 시료 전처리- Western sample 만들기.protein lysis (단백 동화)↓quantification (정량)↓boiling(sample +buffer+4x sample buffer)⇒양 맞춤. gel loading 조건을 만들어줌.95℃에서 9~10분간 boiling함.- 자세한 Sample Quantification for Biochemistry-Homogenization1. Weigh the Tissue and make equally average weight. (10~20mg)2. Add PBS which volume is 30 times amount of Tissue weight. and add 1% protease inhibitor. ex) if hippo 10mg → 300 μl PBS3. homogenize4. 12000rpm 4℃, 20min centrifuge.5. move supernatant another tube →keep in deep freezer.Quantification1. Preparing working solution - by using?Quant-it™ Protein Assay kit-each sample need total 190μl working solution.-standard 1,2,3 also need 190μl working solution.-because of bubble it's better make a little more amount.protein reagent : protein buffer = 1: 200ex )25sample (with standard) × 200μl = 5000μl∴ protein buffer 4975μl protein reagent 25μl?2. P20 × 50 = 1000times dilution20 × 100= 2000times dilutionunit: μg/ μl?*단백질을 정량한 후 최소 정량 농도 기준으로 모든 sample을 동일한 농도로 맞춘다.최소농도 × 최소농도 sample 양 = 임의농도 × 임의농도 sample 양최소농도 sample양-임의농도 sample 양 만큼 모자란 양은 lysis buffer로 채워준다.ex) 5ug/uL sample이 최소일 경우4X sample buffer와 3:1의 비율로 mix하여 사용해야 하므로 120mL sample : 40mL sample buffer를 섞어준다 하면, 10ug/uL sample은 60mL sample에 나머지 60mL는 lysis buffer로 채워주는 형식으로 동일한 단백질 농도를 맞춰준다. 4X sample buffer는 만든 후 1mL씩 분주하여 사용하며 -20℃에 보관하고 사용직전에 200ug mercaptoethanol을 넣어준다.당장 loading 하지 않을 거라면 boiling 후 -20℃에 보관하여 나중에 사용한다.?시약 준비:]) 4x sample buffer (25mL기준)1X Tris pH6.8-------- 6.25mLSDS-----------------2g (detergent)Glycerol--------------10mL (점도가 있고 로딩시 가라앉게)BPB(bromphenol blue)---1mg (전기이동라인표시)dH2O----------------20mL까지 맞춤mercaptoethanol--------사용하기 바로 전에 5mL첨가 왜냐하면 휘발이 강함.(S-S결합끊음)?2) Lysis buffer (50mL기준)1M Tris buffer pH6.8 ------2.5mL10% SDS buffer ---------10mLGlycerol----------------5mLdH2O-----------------32.5mLtotal----------------50mL쓰기 바로 전에 Proteinase inhib0X TBS+ 1mL Tween 20 + DW?→?Total 2L로 맞춤.?6) Blocking solution1.5g Skim milk를 50mL TBS에 녹임.?7) Primary, secondary antibody solution정해진 비율대로 Blocking solution과 mix함.?기구: Hoefer1. Glass plates, spacers, leverl table, comb2. acrylamide gelLower Gel componants5mL10mL15mL20mL25mL30mL40mL50mL6% GelH2O2.65.37.910.613.215.921.226.530%Acrylamide mix1.02.03.04.05.06.08.010.01.5M Tris?(pH8.8)1.32.53.85.06.37.510.012.510% SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510% ammonium persulfate (APS)0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED (N,N,N,N' Teramethylethylendiamine)0.0040.0080.0120.0160.020.0240.0320.048% GelH2O2.34.66.99.311.513.918.523.230%Acrylamide mix1.32.74.05.36.78.010.713.31.5M Tris?(pH8.8)1.32.53.85.06.37.510.012.510% SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510% ammonium persulfate (APS)0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED (N,N,N,N' Teramethylethylendiamine)0.0030.0060.0090.0120.0150.0180.0240.0310% GelH2O1.94.05.97.99.911.915.919.830%Acrylamide mix1.73.35.0678.310.013.316.71.5M Tris?(pH8.8)1.32.53.85.06.37.510.012.510% SmL4mL5mL6mL8mL10mLH2O0.681.42.12.73.44.15.56.830%Acrylamide mix0.170.330.50.670.831.01.31.71.0M Tris (pH6.8)0.130.250.380.50.630.751.01.2510% SDS0.010.020.030.040.050.060.080.110% ammonium persulfate (APS)0.010.020.030.040.050.060.080.1TEMED (N,N,N,N' Teramethylethylendiamine)0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0080.01Component table??2)gel 만들기원리:1. gel이 굳으면 시료를 전기영동하여 가벼운 순서로 재배열. 가벼운 protein이 아래로 배열.2. upper gel은 느슨해서 모든 protein을 같은 열로 배열시키는 역할, 즉 start line을 동일하게.3. low gel은 분자량에 따라 재배열 역할.4. 찾고자 하는 protein 무게가 무거울수록 낮은 농도의 젤 사용. (보통 30kDa이상은 10% 그 이하는 15% 사용)5.도구: glass plate, alumina plate(열제거)spacer(보통 1mm두께)caster(지지대)cam(고정역할)gel:?10% low gel?; 한 gel당 6mL정도가 필요함.H2O--------19.8ML30% acrylamide mix (bid) -16.7mLbid와 29:1mixture. bid가 분자구조에 중심에서 polymer역할.( bid )monomer는 대단한 neurotoxic agent임.1.5M tris buffer(PH8.8) -12.5mL10% SDS -0.5mL10% APS'(ammonium persulfate) - 0.5mLTEMED(tetramethylenethyldiamine)-0.02 mL ?촉매역할. 마지막에 넣어줌. 넣어주면 바로 굳기 시작함.?4.8% upper gel ;?한 gel당 2mL정도가 필요함.HO . 중간 중간 running buffer가 젤 안에서 새기 때문에 밑에 것을 퍼올려 보충해 주어야 함. 안 그러면 늦게 영동됨.?5) transfer하기1. membranedmf MeOH에 3분간 적심.2. D.W로 다시 씻음. 2분간 한번.3. Transfer buffer속에서 gel을 membrane에 옮긴다. gel을 자신이 찾고자하는 Molecular weight에 따라 왼쪽의 marker 색을 기준으로 적당이 자름. 이때 sandwich처럼Cassette-Scotch pad-filter paper-gel-Nitrocellulose paper(membrane)-filter paper-Scotch pad-Cassette 식으로 옮김.4. Transfer apparatus에 넣고 120-300mA?70V에서?2시간동안 영동함. 단백질이 membrane으로 이동함* 주의할 점은 2시간이 지나고 transfer buffer에서 빨리 membrane을 빼내지 않을 경우 단백질이 buffer에 씻김. 그러므로 재빨리 꺼내어 다음 단계인 blocking을 함.?6) blockingblocking solution에서 membrane을 40분에서 1시간 흔들어 줌.?7) Primary antibodyblocking이 다 된 membrane을 빼내어 비닐에 2장이 양면으로 향하도록 잘 봉한 후 blocking solution을 꾹 눌러 따 빼낸 후 준비된 antibody solution은 2장에 5mL정도로 넣어줌. 4℃ overnight 동안 incubation함.*주의할 점은 primary antibody solution은 3-4번 재사용이 가능함. 사용 후 다시 수거함.그러나 용매인 skim milk가 금방 상하므로 10일 뒤 정도에는 재사용불가.또한 매우 소량의 antibody를 섞어주므로 blocking solution과 섞이지 않도록 membrane을 물기가 없는 상태에서 antibody solution을 넣어줌.?8) Washing하루 incubation한 IgG
EXTRACT RNA20044958 박원영1.제목 : Extract RNA2.목적 : Spleen에서 RNA를 추출한다.3.서론 :RNA :리보핵산(ribonucleic acid)이라고도 한다. 핵산의 단위물질인 뉴클레오티드(nucleotide)가 매우 길게 연결된 고분자유기물인데, 이 뉴클레오티드는 염기와 탄수화물의 일종인 펜토오스(오탄당), 그리고 인산이 각각 1분자씩 결합한 물질이다. 이 구성성분에서 펜토오스의 당이 리보오스(ribose)일 때 RNA라 하고, 디옥시리보오스(deoxyribose)이면 DNA(deoxyribonucleic acid)라 한다. RNA를 구성하는 뉴클레오티드의 4가지 염기는 아데닌(adenine:A)·구아닌(guanine:G)·시토신(cytosine:C)·우라실(uracil:U)이다. 따라서 RNA의 뉴클레오티드에도 A, G, C 또는 U를 가진 네 가지가 있게 된다. 이 뉴클레오티드의 연결방식은 다음과 같다.여기서 S는 오탄당인 리보오스를, P는 인산을 나타낸다. 위 구조에서 AGC 또는 U 의 염기를 가진 네 가지 뉴클레오티드의 배열순서는 무수히 많은 종류가 있을 것이다. 이 뉴클레오티드의 배열순서가 다르면 RNA의 종류도 달라진다. 즉, RNA의 종류라는 것은 뉴클레오티드의 배열순서인 것이다. 따라서 RNA에는 무수히 많은 종류가 있다. 보통 RNA는 뉴클레오티드가 수십에서 수백 개 연결되어 있다. 거의 모든 생물의 유전자는 DNA이지만, 식물에 기생하는 바이러스와 약간의 동물성 바이러스, 그리고 세균성 바이러스는 RNA가 유전자 구실을 한다. 세포 내에서는 주로 리보솜에 들어 있고 일부는 핵 속에, 그리고 인에도 들어 있다.Isoprpanol(isopropyl alcohol) ; (CH3)2CHOH: RNA를 침전하는데 사용한다.: 프로판올의 이성질체이며 독특한 냄새가 나는 무색의 휘발성 액체로, 인화성이 있다.: 많은 점에서 에탄올과 비슷한 반응성을 보이나, 2차알코올로서의 특징도 보이며, 산화하면 아세톤이 된다.Chloroform ; CHCl3: aqueous phase, interphase, organic phase로 나눠진다.: 즉 RNA와 DNA, 그리고 나머지 층으로 구별된다.: 트리클로로메탄: 무색 투명한 액체로 휘발성이며, 특유한 냄새가 나고, 약간 달면서 찌르는 듯한 맛이 난다.: 에탄올이나 벤젠에는 녹지만, 물에는 잘 녹지 않는다.: 공기와 빛에 의해 서서히 산화되어 맹독을 지닌 포스겐을 생성하는데, 이것은 소량의 에틸알코올에 의해서 저지되므로, 시중에서 판매되는 클로로포름에는 보통 0.5∼1%의 무수알코올이 첨가되어 있다.: 산화를 방지하기 위해 갈색병에 넣어 마개를 꼭 닫아서 차고 어두운 곳에 보존해야 한다.DEPC-treated water: DEPC는 histidine을 선택적으로 alkylation시키는 물질이다.: 대부분의 RNAse의 active site에는 histidine이 있기 때문에 DEPC 처리를 하면 불활성화된다.: DEPC는 NH2, SH, OH group들을 modify하여 RNase를 비롯한 여러 protein의 enzyme activity를 불활성화시킨다.: RNA와 접촉할 solution을 처리하는 데에 유용하다.4.실험준비물 & 실험방법a. spleen 100mg에 TRI zol 700㎕를 섞는다.b. homogenizec. 실온에서 5분간 둔다.d. 0.3ml의 cloroform을 넣고 격렬하게 섞는다.e. 실온에서 2~3분간 둔다.f. 12,000 rpm으로 4℃에서 15분간 원심분리한다.g. 가장 위층에 있는 aqueous phase를 새 튜브로 옮겨 담는다.
![[생화학]RNA Extrantion](https://image4.happycampus.com/Production/thumbnail/2006/09/18/data4191292-0001.jpg)
