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(결과레포트) 모근에서 DNA 추출 평가A좋아요

2006.12.1.금(결과레포트)1. Subject;모근에서 DNA 추출2. Introduction; 전기영동법은 DNA나 단백질(Protein)의 크기 차이를 이용하여 구별하는 방법으로 전기장 안에서 하전된 입자가 양극 또는 음극쪽으로 이동하는 현상을 말한다. 이 때, 이동하는 속도는 입자의 전하량, 크기와 모양 용액의 pH나 점성도, 용액에 있는 다른 전해질의 농도와 이온의 세기, 지자체의 종류등 여러 가지 요인에 의해 결정된다. 전기 영동법 중에서 DNA를 분리, 정제하여 크기와 양을 알아보고자 할 때, 가장 많이 쓰이는 방법이 agarose gel 전기영동법이다. 망상구조를 가진 agarose gel에 DNA를 넣고 전기를 걸어주면 DNA는 골격에 인산기(PO4-)를 함유하고 있기 때문에 수용액에서 음전하를 띠어 매질을 타고, 양성축(+극)으로 이동하게 된다. Gel 상에서 DNA에 형광염료인 EtBr로 염색하면 자외선 하에서 DNA를 직접 관찰 할 수 있다.3. Material;모근 10개, 1.5ml microtube, DNA추출용액, water-bath전기영동장치, 1×TAE, 6×loading dye, 0.7% agarose gel, 가위, centrifus(원심분리기), vortex, miropipette, tip, 비닐장갑*DNA 추출용액;TE buffer(10mM Tris-치, 1mM EDTA=pH8.0)10% (w/v) sodium dedecyl sulfate(SDS), Proteinase K(20mg/ml)4. Methos① 모근을 포함한 머리카락 10개를 뽑는다.② 모근 부위를 포함해 1cm 정도 잘라 1.5 microtube 안에 넣는다.(모근 부위에 DNA가 있기 때문에 상하지 않도록 조심스럽게 잘라 넣는다.)③ 1.5ml microtube속의 모근에 추출용액 50ml를 pipette을 이용하여 넣는다.④ 1시간 동안 37℃ water-bath 안에서 반응시킨다.⑤ 12000rpm(속도)에서 약 5분간 원심분리 시킨다.⑥ 모근이 들어가지 않게 조심하면서 상층액 40㎕를 pipette을 이용하여 적출한다.⑦ 6×loading dye 2㎕+sample 10㎕를 썪어 전기 영동 시킨다.(전기영동 시킬 때, 기계를 알루미늄 호일로 싸서 빛의 노출을 막는 것이 좋다)⑧ UV transilluminator에 gel을 올려놓고 DNA양을 확인한다.5. Result→ 원본사진은 너무 어두워서 색보정을 통해 밝은 부분은 좀더 밝고 뚜렷하게 나오게 했음-관찰 : 전체적으로 띠모양으로 나오지 않고, 끌림 현상이 발생했다. size marker의 크기는 실험할 때 조교에게 묻지 못해서 아쉽움(알수없었음). 1조, 2조, 5조는 대체로 양호하나 3조의 경우에는 너무 일찍 띠가 나오기 시작했으며, 4조는 띠 자체가 나오지 않았다. DNA Band의 크기가 차이가 나는 것은 DNA를 뽑는 과정중에 실험미숙으로 인한 DNA 오렴으로 양이 줄었거나 전기영동 loading시 DNA가 well 밖으로 새어나갈 수도 있다고 본다.6. Discussion※ DNA 추출용액의 역할-Tris-Cl; pH의 급격한 변화를 막기 위한 buffer의 역할-EDTA ; 2가 양이온(Mg2+, Ca2+,…)등을 잡아주는 역할을 하는 chilating agent이다. 일반적으로 미생물의 exopolysaccharide사이를 안정화시키는 Mg2+와 결합하 여 cell wall을 약하게 만드는 역할을 한다.-TE buffer; pH 변화를 최소화 시켜주는 완충용액으로 DNA의 안정화를 목적으로 사용 한다. Tris-cl과 EDTA의 기능을 모두 수행한다고 생각하면 된다.-10%(w/v) sodium dodecyl sulfate(SDS); 계면 활성제로 세포막의 인지질등을 녹여서 세포막 안의 DNA를 추출 할 수 있게 하는 시약이다.-Proteinase K; 단백질 분해효소로서 세포 내부의 단백질이나 DNA에 붙어있는 단백질 등을 제거하여 순수한 DNA만 분리하게 도와주는 시약이다.※ 모근에서 DNA를 추출하는 실험시 주의사항-머리카락을 1.5ml microtube안에 잘라 넣을 때, 모근 부분이 상하지 않도록 조심해서 잘 라 넣는다.-1시간동안 water-bath안에서 반응시키면서 vortex 시킬 때, 너무 자주 하거나 너무 오 랫동안 하지 않는다. 너무 자주하거나 오래하면 DNA 이중나선 구조가 깨지기 때문이다.-원심분리기를 사용할 때, 축이 기울면 안되므로 microtube를 넘을 때, 균형을 맞춰서 넣 어준다. 균형이 맞지 않을겨우 D?W(포도당 멸균 증류수)를 넣은 microtube를 넣고, 원심 분리기를 사용한다. 또한 microtube의 뚜껑이 축을 향하도록 넣는다.-6×loading dye와 DNA 상층액 sample을 섞을 때, 비율을 맞춰서 섞는다. 6배 농축된 loading dye는 6배 희석시켜야 하므로, 예를 들어 DNA 상층액 5㎕에는 loading dye 1 ㎕를, DNA 상츠액 15㎕에는 loading dye 3㎕를 넣어 같은 비율로 유지시켜준다. 또한 두 용액을 섞을 때에는 pipette을 이용하여 빨아 올렸다 내렸다를 반복하여 섞어주는데, 공기가 들어가지 않도록 마지막엔 천천히 끌어 올린다.-이온 강도 또는 pH에 약간의 차이만 있어도 DNA 조각의 이동속도에 영향을 주므로, 전 기영동 tank와 gel은 동일한 전기영동 완충액을 사용한다.-전기영동 장치를 사용할 때에는 알루미늄 호일로 싸서 빛에 노출을 막도록 한다. Gel안 에 들어있는 EtBr(브롬화 에티듐)은 빛에 쉽게 파괴되기 때문이다. 그리고 이 물질은 발 암물질이므로 사용시에는 반드시 장갑을 착용하여 손에 뭍지 않도록 한다.-microtube는 멸균된 상태이므로 꺼낼 때에는 손으로 꺼내지 않고 뚜껑은 손등으로 닫도 록 한다.※ loading dye의 역할-DNA가 buffer 위로 뜨지 않도록 한다. dye 성분에는 Ficol이나 sucrose가 들어 있는 데, 이런 성분들은 고분자 물질이라 매우 무겁다. buffer 상에 DNA를 loading하면 가벼 워서 DNA가 뜨게 되므로 DNA가 뜨지 않도록 이러한 고분자 물질을 사용한다.-두번째로 DNA의 이동거리를 육안으로 확인하기 위해서이다. DNA자체는 눈에 안보이므 로 gel에 loading하고 흘려보내면 DNA가 얼마나 이동했는지 알 수 있기 때문에 사용한 다.※ EtBr의 기능과 역할-EtBr은 Ethidium Bromide의 약자로 DNA 실험에서 DNA를 염색할 때 사용한다. EtBr 은 DNA의 염기쌍 사이에 끼어 들어가게 되어서 DNA에 염색된다. 이 EtBr은 자외선 (UV)를 받으면 형광을 내는데 이것으로 DNA의 양과 존재를 알 수 있다. EtBr은 agarose gel을 만들 때 첨가하는 경우와 gel에 DNA를 전기영동한 다음 EtBr 용액을 넣고 염색하는 방법이 있다. 우리의 실험은 EtBr을 gel에 넣고 전기영동 시켰는데, 이러 한 경우에는 전개속도에 영향을 줄 수 있기 때문에 나중에 염색하는 방법을 많이 쓰고 있다. gel에 EtBr을 넣었을 경우 DNA 전개속도를 15%정도 감소 시킨다.※ agarose gel전기영동에서 DNA가 전개되는 원리-망상구조를 가진 agarose gel에 DNA를 넣고 전기를 걸어주면 DNA는 골격에 인산기를 함유하고 있기 때문에 수용액에서 음전하를 띠어, 매질을 타고 양성축(+)으로 이동하게 된다. gel 이 서로 다른 DNA분자들을 분리할 수 있는 것은 마찰력 때문이다. 작은 DNA분자는 용매와 매질로부터 약한 마찰력을 받으므로 빠르게 이동하게 되고, 이에비 해 큰 DNA분자들은 비례적으로 큰 마찰력을 받게 되므로 천천히 이동하게 된다. 그 결 과, 가장 큰 DNA 분자는 전기 영동 빗(comb)에서 가장 가까이에 위치하고 가장 작은 것은 전기 영동 빗에서 가장 멀리 위치하게 된다. 이때 움직이는 속도는 DNA의 크기뿐 만 아니라 동일한 크기의 DNA라도 형태에 따라 다르므로 gel 전기영동법으로 DNA의 크기, 모양, 양의 차이를 확인할 수 있다.※ 전기영동의 목적은?-전기영동은 단백질의 크기차이를 이용하여 크기별로 구별하는 방법이다. 단백질을 전기 영동 할때에는 단백질을 자르지 않고, 단백질의 구조적인 변형만 일으켜서 전기영동한 다. 이것은 SDS-PAGE라고 하는데, 접힘 구조를 SDS처리하여 직선구조 형태로 만드는 것을 의미한다. 그렇게 되면, 좀더 정확하게 크기별로 구별할 수 있기 때문이다. 이와같 이 전기영동의 목적이 단백질의 크기를 알아 보기 위한 것도 있으나 서로 다른 샘풀을 gel상에 로딩하여 그 패턴을 보고, 비교하여 서로다른 것인지 확인하기 위한 목적도 있 다. 정리하자면, 단백질 전기 영동의 목적은 단백질의 크기를 알아보는 것이고, 세포적 특성이 결정되는 원리를 이해하며, 여러 새물이 있으시에 그 샘플을 구별하기 위함이다.※ 전기영동할 때 size에 따라 구분되는 이유?-그것은 size의 크기에 따라 분자량이 다르기 때문이다. 큰 size는 큰 분자량을 가지고 있다. 반면에 작은 size는 작은 분자량을 가지고 있다. 큰 분자량을 가지고 있을수록, 무 거워서 이동거리가 짧아지게 되고, 작은 분자량은 가벼워서 더 멀리까지 갈 수 있다.※ 전기영동시에 끌림현상인 스멜링 현상이 나타난 이유?-① 핵산 추출시 과도한 볼택싱에 의해서, 핵산들이 깨질수도 있음② 실험시 컨탐에 의한 DNase 또는 RNase의 유입 가능성

자연과학| 2015.10.28| 5페이지| 1,500원| 조회(663)

전기영동, EDTA, Agarose gel, EtBr, 모근, loading dy..

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(결과레포트) mouse sperm의 관찰 평가A+최고예요

2006.12.01.금(결과레포트)1. Subject;mouse sperm의 관찰2. Introduction:mouse sperm의 형태와 미세구조를 관찰하고, 그 특징을 알아본다.3. Material;mouse(♂), 70% EtOH, 해부기구, 1×PBS, 파스퇴르 파이펫, slide glass, cover glass, 현미경, 호일, 해부판, 해부침, 2mm petri dish4. Method① 흰 쥐를 경추탈골한다.→ 흰 쥐의 귀 뒤를 잡고(왼손으로) 오른손으로 꼬리를 잡아 45°로 들어올린 후 똑소리가 날때까지 잡아땡긴다.② 해부판에 쥐를 올려놓고, 70% EtOH를 뿌린뒤, 배 부분을 잡고 해부 가위를 이용하여 U자로 잘라 개복한다.→ 해부판에는 호일을 깔아 사용한다. 핀셋으로 가죽을 들어낸 후, 끝을 자르고 U자로 개 복한다.③ 수컷의 생식기(정관, 고환등)를 관찰하여 위치를 확인한다.④ 채취하 vas deferens(정소관) epididymis를 찾아서 잘라낸다.⑤ 자른 정소관을 2mm petri dish에 옯겨 1×PBS 용액으로 씻는다.⑥ 해부침을 이용하여 정소관을 잘게 찢는다. 후에 찢은 정소관을 1×PBS에서 추출한다.⑦ 2mm dish에 든 혼합물을 파스퇴르 파이펫으로 잘 혼합하여 slide glass에 올려놓고 관 찰한다.⑧ 정자의 움직임과 모양을 관찰하여 스케치한다.(정자의 수는 어느정도인가? 그 중 몇 마리나 살아있는가?)5. Result→ 우리조에서는 쥐정자를 많이 관찰 할 수 없었다. 정소관을 해부침으로 잘게 찢을 때, 부주의로 정소관에 있던 정자등이 모두 흩어졌다. 그 상태에서 정자를 추출하다보니, 상대적으로 적은수의 정자만 관찰 할 수 있었다.→ 정자의 움직임은 대체로 활발한 움직임을 보였다.→ 정자의 모양은 사람과 달리 머리부분이 뾰족한 갈고리 모양을 하고 있었다.6. Discussion※사람의 정자와 mouse의 정자; 사람의 정자와 쥐의 정자는 두부, 즉 정자의 머리부분의 모양이 다르다. 정자의 두부는 핵과 첨체로 구성되어 있고, 첨체는 두부의 앞끝에서 핵을 둘러싸며 캡을 형성한다. 첨체 뒤쪽 두부의 부위를 첨체 후부라 한다. 핵은 매우 농축된 염색질을 포함하고, 핵을 덮고있는 첨체는 매우 단순한 구조를 갖고 있다. 핵과 첨체의 관계에서 첨체는 원혈질막과 핵막 사이에 끼워져 있으며, 첨체막으로 둘러쌓여 있다. 어떤 종에 있어서는 첨체가 핵의 앞 끝으로 뻗어 있는 첨체편이 매우 현저하여, 종 특이성 모양을 한다. 이처럼 첨체와 핵은 정자의 두부 모양을 결정하며 실제 두부의 구조는 종에 따라 다양하다. 그러나 다양한 구조적 차이에 따른 기능의 중요성은 알려져 있지 않다. 두부의 모양에 실질적으로 기여하는 첨체편은 정자가 난자에 접촉하기 전인 첨체 반응 동안에 파괴되기 때문에 두부의 모양은 수정에서 명백한 기계적 역할을 하지 않는다. 위의 그림에서 보듯이 사람의 두부는 작고, 약간 길죽한 원모양을 하고 있으며, 첨체편은 작고 뚜렷하지 않다. 반면 쥐의 두부는 작은 갈고리 모양이며, 꼬리 부분도 사람에 비해 매우 긴 것을 볼 수 있다. 또한 쥐와 사람의 정자는 발생 단계에서도 모양과 기간의 차이를 보이는데, 생쥐의 경우 정원세포에서 정자로 만들어지는 기간은 차이를 보이는데, 생쥐의 경우, 정원세포에서 정자로 만들어지는 기간은 약 34.5일이 걸린다. 정원세포기간은 약 8일이며, 감수분열은 13일동안 진행되며, 정자 완성 기간은 13.5일이 소요된다. 사람은 저 과정이 약 74일 정도 걸리게 된다.※ 정자의 운동 메커니즘;정자의 꼬리는 난자를 향해 전진할 수 있는 편모운동을 일으키는 매우 복잡한 구조이다. 정자 꼬리의 운동기구는 2개의 중심 미세소관과 그것을 둘러싸고 있는 9개의 이중 미세소관으로 구성되어 있는데, 이 구조를 축사라고 부른다. 이중 미세소관의 두소관은 서로 다른 모양을 가지며, 한 관은 완전한 소관을 이루고 다른 한 관은 C자 모양을 한다. 각 미세소관은 작은 원섬유로 구성되어 있으며,중심 미세소관과 주변 이중 미세소관의 A소관은 각 13개의 원섬유로 구성되어 있는 반면 B소관은 10개의 원섬유로 구성되어 있다. 이중 미세소관의 A소관에서 돌출한 팔을 ATPase 활성을 가지는 디네인 단백질로 구성되어 있으며, 화학에너지를 기계적 운동으로 전환하는 역할을 맡고 있다. 정자의 편모운동은 마치 근수축의 활주 필라멘트 기작과 같이 인접한 이중 미세소관 사이를 활주한다. 활주는 디네인 팔에 의해 주개되며 ATP의 가수분해로부터 나온 에너지를 이용하여 이중 미세소관이 다른 미세소관에 대해 미끄러진다. 꼬리의 파동운동으로 정자는 추진하게 되며, 이작용은 중심 미세소관과 주변 미세소관의 활주운동을 조정하는 방사살의 상호작용에 의해 일어난다.※ 70% EtOH를 사용하는 이유(죽은 쥐에 70% EtOH를 뿌리고, 해부하기 시작하는 데 왜 70% EtOH를 사용할까?):에탄올은 삼투능력으로 세균표면의 막을 뚫고, 세균 내부로 들어가서 세균의 생명기초인 단백질을 응고시키기 때문에 세균이 죽게 된다. 그런데 농도 70% EtOH를 사용하는 이유는 70-75% 정도의 에탄올이 세균 살균 효과가 크기 때문이다. 진한 에탄올은 세균의 단백질을 응고시키는 능력은 좋지만, 너무 순간적으로 한번에 세균표면에 단백질을 응고시켜서 세균의 외벽에 단단한 막을 형성시키게 된다. 그러므로 세균 내부까지 에탄올이 침투하지 못한다. 반면 70-75% 정도의 에탄올은 서서히 세균의 외벽의 단백질을 응고시킴에 따라 에탄올이 세균 내부까지 침투 할 수 있기 때문에, 더 효과적으로 세균을 죽일 수 있으므로 소독용 알코올로 70% 농도의 알코올을 사용한다. 쥐가 죽으면 온도가 급격하게 내려가면서 귀에 서식하고 있던 많은 세균들이 다른 곳으로 옮겨갈 염려가 있으므로 70% EtOH를 뿌려 세균을 죽인다.

자연과학| 2015.10.28| 4페이지| 1,000원| 조회(129)

정관, PBS, 고환, 경추탈골, 편모운동, Mouse sperm, 해부침, 정소관, 첨체

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plasma DNA 와 genomic DNA 차이 평가A+최고예요

2006.11.28.화(예비레포트)1. Plasmid와 genomic DNA차이;genomic DNA는 모든 생물이 가지고 있는 DNA로 필요한 유전정보를 담고 있다. plasmid DNA는 genomic DNA 이외의 DNA에 해당한다. plasmid DNA는 자체의 replication origin을 가지고 있기 때문에 genomic DNA와는 상관없이 복제가 가능하다. plasmid DNA는 없어도 살아가는데 지장은 없지만, genomic DNA는 없으면 생존 불가능하다. 두 DNA의 가장 큰 차이점은 크기이다. plasmid는 그 크기가 수Kb∼수백Kb정도 되지만, genomic DNA는 1000Kb∼9000Kb에 이른다. 따라서 유전정보의 크기도 달라진다.2. DNA 추출 용액의 역할① TE buffer - TAE와 TBE의 조합; 만약 DNA를 물에 녹였다면 시간이 흐르면서 pH도 조금씩 변하게 되고, 용기나 공기 등에 포함되어 있던 효소에 의해 pH가 조금씩 변하게 되고, 용기나 공기등에 포함되 어 있던 효소에 의해 DNA가 조금씩 degrsdation 된다. 그러나 TE에 녹였다면 이런 걱정에서 조금은 벗어날 수 있다. 따라서 분자 생물학 실험에서 물처럼 이용하는 것이 TE이다.② Sodium dodecyl sulface(SDS); 계면 활성체이며, 세포막의 지질을 녹여준다.③ Proteinase k ; 단백질 분해효소3. loading dye 역할;전기 영동시 loading dye를 섞어준다. 왜냐하면 dye성분에는 Ficol이나 sucrose가 들어있어서(고분자) 매우 무겁다. 따라서 이런것들과 섞인 DNA는 젤상의 well 안으로 가라 앉게 해준다. 또한 DNA의 이동거리를 육안으로 확인하기 위해 loading dye를 이용한다. DNA 자체는 눈에 보이지 않는다. 그래서 젤에 로딩하고 그냥 DNA가 얼마나 이동했는지 잘 알 수가 없다. 하지만 loading dye를 섞어서 전개하면 dye의 이동에 따라 DNA와 같은 속도로 이동하기 때문에 육안으로 확인 할 수 있게 된다.

자연과학| 2015.10.27| 2페이지| 1,000원| 조회(4,118)

전기영동, SDS, tab, Genomic DNA, loading dye, Sod..

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Mouse 암수 생식기 구조 및 기능

2006.11.28(예비레포트)Mouse 암수 생식기1. 수컷의 생식기① 음낭-고환과 부고환을 수용하는 피부주머니로 항문 바로 배쪽에 있다.② 고환-질긴 섬유결합조직 피막인 백색막에 싸여 있는데, 이들은 고환 실질내로 뻗어 들어 가 고환 , 중격을 만들어 고환 실질을 많은 고환소엽으로 나눈다. 고환소엽 내에는 정세관이 있다. 이 관에는 정자발생세포가 있어 정자를 생산한다.③ 부고환-고환의 표면에 놓여있는 장기로, 이것은 꾸불꾸불하며 복잡하게 엉킨 관상구조이 다. 이관은 고환의 앞쪽에서 시작되며 이곳은 부고환 머리(부고환두)라 하고, 고 환의 외면으로 계속된 꾸불꾸불한 관을 부고환 몸통이라 하며 고환 뒤쪽 부분을 부고환 꼬리라고 한다. (정자 임시 저장)④ 정관-부고환 꼬리 부분과 요도 사이에 있는 정관은 요도와 이어져 정자를 수송한다.⑤ 음경-발기조직으로 구성된 원주상의 교미기관이다. 이는 2개의 음경 해면체와 1개의 요 도해면체등 3개의 해면체와 음경 끝부분인 음경귀두 그리고 음경골등 3가지로 구 성되어 있다.⑥ 부속생식샘- 짝짓기를 쉽게하고 정자(sperm)에 활력을 부여하는 분비물을 분비하는 기 관→전립샘, 정낭샘, 응고샘, 펑대샘, 쿠퍼샘, 음경꺼풀샘2. 암컷의 생식기① 난소-수정에 관여하는 난자를 생성하고 방출한다. 약 4주마다 한번씩 두 난소중 하나에 서 여포가 성숙하여 여포내 난자는 수정되기 위해 빠져 나간다.② 수정관-자궁과 난소를 연결하는 가늘고 긴 관으로, 이곳에서 수정이 이루어지며, 수정란 을 자궁으로 이동시키는 역할을 한다.③ 나팔관-난소에서 나온 난자를 자구응로 보낸다.④ 자궁- 수정란이 착상 후, 태아가 되어 출생할 때까지 자라는 곳이다.3. Sperm 그림. 기능(사람과 mouse 비교)→구조: 두부(핵과 첨체가 있다), 중편, 미부;정자는 핵, 첨체와 편모로 되어 있으며, 핵은 고도로 농축된 염색질을 함유하고 있다. 핵을 덮고 있는 첨체는 종 특이성 물질을 포함하고 있어서, 난막을 침투하는 역할을 한 다. 중편의 미토콘드리아는 정자 추진을 위한 에너지를 제공하며 편모는 운동기관으로 중부와 경부는 물질 교대와 운동의 중심이 된다. 미부의 꼬리는 11개의 미세소관으로 되어 있어, 운동기능을 담당한다.

자연과학| 2015.10.27| 3페이지| 1,000원| 조회(802)

자궁, 정관, 난소, 고환, 음경, 음낭, 수정관, mouse해부, 나팔관, 부속생식샘

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(결과레포트) Gram Straining

2006.11.24.금(결과 레포트)1. Subject;Gram staining2. Introduction; Gram staining은 미생물을 (+)균과 (-)균으로 나누는데 그 목적이 있다. 염색을 하면 두 균은 색깔차가 두드러지는데, 이러한 양성과 음성이 서로 다르게 염색되는 이유는 근본적으로 세포벽의 구조가 다르기 때문이다. Gram 양성균이 세포벽은 여러층의 펩티도글리칸층이 두껍게 감싸고 있는 반면에 Gram 음성균의 세포벽은 펩티도글리칸 층이 한겹으로 매우 얇다. 이번 실험을 통해서 Gram 양성균과 음성균의 염색 특이성을 이용하여 분리 및 확인해보자.3. Material; E.coli HB101, Bacillus, subtilis, crystal violet, iodine, 95% ethanol, safranin O, slide glass, 현미경, 백금이(이쑤기개), 알콜램프4. Method① Slide glass에 네임펜으로 도말한 세균의 이름을 쓴다.② slide glass 위에 멸균된 증류수 한 방울ㅇ르 떨어뜨린다.③ 비닐 장갑을 끼고 백금이(이쑤시개)를 불에 뒤, colony 일부를 묻힌다.(간단히 소독만 하는 것이므로 백금이가 타지 않도록 주의한다.④ 증류수와 백금이를 잘 섞은 뒤 도말한다.(최대한 얇고 넓게 도말한다)⑤ 공기중에서 말린 뒤, 도말한 부위가 위로가게 하여 불꽃이 서너차례 통과시킨다.(열고 정) →공기중에서 말릴 때 알코올 주위에서 말리는 것이 좋다. 열고정 시킬 때, 열에 의 해 시료가 너무 심하게 손상 또는 변형되지 않게 유의한다.⑥ crystal violet 용액을 떨어뜨리고, 1분간 반응시킨다.(염색 시약 Tip으로 긁지 않도록 주의한다)⑦ slide glass를 뒤집어 흐르는 물에 간접적으로 염료를 제거한다.⑧ 씻은 후 slide glass를 세워서 탈탈 털어 최대한 물기를 제거하고 말린다.⑨ iodine 용액을 떨어뜨리고 1분간 반응시킨다.⑩ ⑦번과 같이 세척후 물기를 제거한다.⑪ 95% ethanol로 30초간 탈색한다.(탈색시간을 너무 오래하면 둘다 탈색될 수 있으므로 주의한다)⑫ slide glass를 뒤집어 흐르는 물에 세척 후, 물기를 제거한다.⑬ 대조 염색로 safranin O 용액을 떨어뜨린 후, 1분간 반응시킨다.⑭ slide glass를 뒤집어 흐르는 물에 세척 후 물기를 제거한다.⑮ 현미경으로 관찰한다.5. Result(배율 10×40)→ 그람 양성세균, 보라색(사진으로는 확인하기 어렵지만, 실제로는 보라색을 띰)(배율 10×40)→ 그람 음성세균, 붉은색(사진을 잘못찍어, 너무 어둡게 나왔다. 붉은색을 띰)6. Discussion① 결과는 올바르게 나왔는가?-대체로 올바르다. 하지만 염색을 할 때, 시간을 더 잘 지키고, 세척을 깔끔하게 했다면 더 완벅한 결과가 나왔을 것이다. 그람 음성에서는 사진을 잘못찍어 다소 어둡게 나와 서 색을 확인하기는 어려웠지만, 실제상으로는 붉은색을 띰② Gram 염색 실험에서 주의할 사항-이쑤시개로 colony를 묻히기 전에는 반드시 불에 달궈 멸균시켜야 한다. 세균을 묻혀 도말 할 경우, 너무 두텁거나 조밀하면 탈색시 crystal violet이 남아서 나타날 수 있 다. 또한 도말후 완전 건조가 되기전에 열로 건조하면 후에 탈색이 어렵고 찌꺼기 같은 것으로 잘못 판단할 수 있다. Gram 염색 과정중 가장 주의해야 할 점이 탈색제의 사용 이며, 그 적용시간이다. 만약 탈색제의 적용시간이 지나치게 길면 Gram 양성 세균이 Gram 음성으로 보일 수 있기 때문이다. 그리고 slide glass를 공기중에서 말릴 때, 알 코올 램프 근처에서 말리는 이유는 불이 연소할 때에는 산소가 필요하다. 알코올램프 주위는 자연히 산소가 부족하게 되므로 일시적으로 진공 상태가 된다. 그러므로 알코올 램프 주위는 상대적으로 먼지나 세균이 적은 상태가 된다. 실험과정과 결과가 더 좋게 하기 위해 slide glass를 알코올 램프 주위에서 말렸던 것이다. 그리고 실험에 임하는 모든 사람들ㅇ르 비닐 장갑을 착용하는 것이 좋다.③ crystal violet, iodine, 95% ethanol, safranin O 역할은?-Gram staining에 쓰이는 crystal violet을 건조, 고정된 세균 도말표본에 가했을 때, Gram 양성균이나 Gram 음성균이 다같이 일단은 crystal violet 색에 착색된다. 이와 같은 현상은 색소의 염기군과 세포의 산성군 사이에 일어나는 이노결합에 의한다. 시약 중에 iodine약은 매염제(mordant)의 구실을 하는데 Gram 양성 및 음성균 세포내에서 색소와 작용하여 일종의 침체 현상을 일으켜 색소의 부착을 촉진한다. 95% ethanol인 탈색제는 Gram 음성균 세포에 착색된 crystal violet 색을 씻어 없애지만 Gram 양성 균은 위 탈색제에 견딜수 있어 crystal violet 색을 유지하게 된다. 탈색제로 쓰는 알코 올이 탈수작용을 하여 Gram 양성균을 수축시켜 crystal violet의 유실을 감소시키기 때 문에 violet 색으로 남는다. 끝으로 후염색소(counter stain)로 쓰이는 safranin O는 대 조염색으로 분홍 혹은 붉은색으로 나타난다. safranin O는 탈색된 세균 세포벽에 착색 되며 이와 같은 균종을 Gram 음성균이라고 한다.

자연과학| 2015.10.26| 4페이지| 1,000원| 조회(133)

매염제, Bacillus subtilis, 백금이, Gram staining, iodine

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