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plasmid vector에서의 antibiotic resistance geme(항생제저항성유전자)의 필요성

생물공정공학 reportPlasmid vector에antibiotic resistance gene이 있는 이유는?화공생명공학과이지원교수님2005170128정다영ㅎThe condition for gene expressionPromoter5' UnTraslated RegionMulti Cloning Site3' UnTraslasted RegionTerminal sequenceAntibioticresistance gene ! Replicaiton originQ. Plasmid에 왜 antibiotic resistance gene을 가지는가?A. antibiotic resistance gene은 selection marker로 사용된다.? 알아두기 : Gene CloningTransformation(형질전환) :Plasmid에 외부 DNA를 삽입하여 만든 recombinant DNA를 Bacteria cell 에 넣는 것Trnasformation 후에 gene cloning 하면 Recombinant DNA도 cloning되므로 원하는 DNA를 다량 복제할 수 있다.plasmid를 이용한 recombination은 efficiency가 낮기 때문에 clone들을 antibiotic에 노출시켜gene of interest가 들어있는 Recombinat DNA만 골라낸다. 그 과정을 selection 이라고 하고, 그때 selection marker로 사용되는 것이 antibiotic resistance gene이다.? Antibiotic resistance gene의 Selection Marker로서의 기작antibiotic resistance gene에서는 이름 그대로 antibiotic의 독성에 저항할 수 있는 단백질이 합성된다. antibiotic resistance gene이 포함된 plasmid가 bacterial cell 안에 제대로 들어갔다면 antibiotic에서 bacteria가 생존할 수 있다. 반대로 plasmid가 bacteria cell 안으로 insertion하지 못했다면 bacteria는 actibiotic에 의하여 죽고만다.* 위 실험시 antibiotic은 정상적인 독성농도로 사용한다.antibiotic으로는 ampicillin 이나 tetracyclin이 있다.더 자세하게 !두 가지 antibiotic(ampicillin, tetracyclin) resistance gene이 들어있는 plasmid vector를 준비한다. (R-plasmid - antibiotic resistance gene을 가진 plasmid) 위의 그림과 같이 tetracyclin안에 restriction enzyme BamH1 site가 있어서 BamH1로 잘린 부분에 gene of interest가 tetracyclin안으로 들어가면, 관련된 단백질생성이 불가능해지므로 plasmid의 tetracyclin resistance가 사라지게 된다.이렇게 만들어진 recombinant plasmid를 bacterial cell(일반적으로 E.coli) 안으로 주입하고 tetracyclin이 섞인 batch에 배양하면 원하는 gene이 제대로 주입된 bacteria는 사멸하게 된다.gene of interest가 제대로 insertion한 bacteria를 골라내기 위해서는 replica plating이라는 방법을 사용한다.*Replica(복제) plating(접시에 배양)1. 한쪽 batch에서 자라고 있는 colony를 벨벳같은 천으로 찍어서 도장찍듯이 찍어주면 bacteria가 천에 ane는다. 그것을 새 batch에 찍어서 번식시킨다.2. 새 batch에서 새롭게 번식한 colony를 ampicillin batch에서 replica plating하면bacteria들이 잘 자란다.3. 새 batch에서 새롭게 번식한 colony를 tetracyclin batch에서 replica plating하면 원하 는 gene이 제대로 삽입된 bactria는 resistance가 없으므로 모두 죽게된다.4. ampicillin batch와 tetracyclin batch를 잘 비교하여, tetracyclin batch에서 잘 자라지못한 colony를 ampicillin batch에서 골라내면 원하는 gene이 제대로 insertion한bacteria이다.? 더 알아보기다른 selection marker에는 어떤 gene 이 있을까? "LacZ"LacZ는 X-gal이라는 물질을 분해할 수 있고 분해되면 X-gal은 파란색을 띄게 된다. LacZ 안으로 Restriction Enzyme Site 가 있어서 Transformation이 제대로 일어나면 LacZ는 제 기능을 할 수 없게 된다. 파란색 콜로니는 Transformation이 안 된것이고, 하얀색 콜로니는 Transformation이 된 것이다.

공학/기술| 2008.04.10| 4페이지| 1,000원| 조회(1,059)

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