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숙주세포만들기(Competent Cell Preparation)

숙주세포 만들기(Competent Cell Preparation)1) 기본원리대장균의 세포를 calicium ion의 존재에서 저온처리하면 competent 세포라 불리우는 DNA 취득능을 갖는 상태로 변한다. 주의할점은 무균적으로 하며 온도는 0~4℃로 보존하도록 해야 한다는 것이다.2) 필요한 장비- Cap tube, 500㎖ 삼각 플라스크, 250㎖ cfg bottle, 원심분리기, Water bath, 흡광도기, Micropipett, pH meter, Clean bench, 멸균된 1.5 ml (Epp. tube), microtips, 알코올 램프, 얼음, 메스실린더, 양팔저울3) 필요한 시약- RbCl- MnCl ? 2H2O- Potassium acetate- CaCl2 ? 2H2O- Glycerol- MOPS- RbCl- CaCl2 ? 2H2O- Glycerol- Bacto tryptone- Yeast- NaCL- KCL4) 필요한 용액 만들기- RE Ⅰ? 100mM RbCl 0.2 g? 50mM MnCl ? 2H2O 0.99 g? 30mM Potassium acetate 0.294 g? 10mM CaCl2 ? 2H2O 0.15 g? 15 % Glycerol 15 g? 0.2 M acetate로 pH 5.8 까지 adjust? filtration- RF Ⅱ? 10mM MOPS 0.21 g? 10mM RbCl 0.12 g? 75mM CaCl2 ? 2H2O 1.1 g? 15 % Glycerol 15 g? NaOH로 pH 6.8 까지 adjust? filtration- SOB? 2% Bacto tryptone 2g? 0.5% Yeast 0.5g? 10mM NaCL? 2.5mM KCL 18.6 ㎎(1M KCl 용액 0.25 ㎖)- LB Broth 100㎖?배지조성Tryptone 1.0gYeast extract 0.5gNaCl 1.0g- LB/Amp 배지?배지조성기본 LB배지 멸균 후 Amp 추가(고체 배지를 만들 땐 50℃까지 식힌 다음 Amp 추가)5) 실험 방법(1) 실험 방법 1① SOB 액체 배지(5 ㎖)에 균 접종하여 배양한다.(37℃ shaking incubator에 12시간 동안 배양)② 새로운 SOB 액체 배지(5 ㎖)에 배양한 배지 1%(50㎕) 접종.(37℃ shaking incubator에 6시간 동안 배양)③ 500㎖ 삼각플라스크에 든 50㎖의 LB Broth에 0.5%(250㎕) 접종(vortex를 시키고 실온에서 5분간 방치 시킨다.)④ O.D값이 0.4에 가깝게 나올 때 까지 배양(600㎚에서 측정)⑤ cfg bottle 4개에 배양액을 동일하게 나누어 담는다.(clean bench에서 실행)⑥ 냉장고에 10min 방치 후 원심분리(4000rpm, 7min, 4℃)⑦ 상층액이 pellet에 닿지 않도록 기울려서 solution을 따낸다.(무균상태를 위해서 clean bench에서 실행)⑧ RFⅠ buffer 10㎖을 넣고 서서히 흔든다.(pipet으로 sucking, gently sucking)⑨ 냉장고 30min 방치 후 원심분리(4000rpm, 7min, 4℃)⑩ 상층액이 pellet에 닿지 않도록 기울려서 solution을 따낸다.(무균상태를 위해서 clean bench에서 실행)⑪ RF Ⅱ buffer 2.4㎖을 넣고 gently sucking⑫ 냉장고 15min 방치 후 꺼내서 잘 혼합⑬ clean bench에서 200㎕씩 cap tube에 분주 후 deep freezer에 보관

자연과학| 2007.09.01| 3페이지| 1,000원| 조회(624)

competent cell, 숙주세포, 유전자 변형 실험

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plasmid 추출법 평가A+최고예요

1. Plasmid 추출1) 기본원리(1)Plasmid DNA의 구조-대부분의 plasmid 는 세포내에서 supercoiled분자로 존재-topoisomerase라는 효소에 의한 plasmid 복제과정 동안에 plasmidDNA의 이중 나선구조가 부분적으로 풀려 supercoiled(초나선형)가 생겨남-초나선형 구조는 두 개의 polynucleotide 가닥이 완전할 때만, 더 기술적인 이름으로는 닫힌 공유결합성 원형 DNA(covalently closed-circular DNA, cccDNA)일 때 유지됨-polynucleotide 가닥 중 하나가 깨어진다면, 이중나선 구조는 일반적으로 이완된(relaxed) 상태로 돌아가서 plasmid는 다른 구조인 열린 원형(open-circular, oc)으로 됨(2)알칼리 변성(Alkali법)-비초나선형(unsupercoiled)DNA가 좁은 pH범위 내에서 변성(denaturation)되는 반면, 초나선형 플라스미드는 그렇지 않다.-NaOH를 세포추출물, 혹은 투명 용해질에 첨가하여 pH가 12.0-12.5로 되면 비초나선형 DNA의 수소결합이 깨어져 이중 나선 구조가 풀리게 되고 두 개의 폴리튜클레오티드(polynucleotide)사슬이 풀리게 된다. 만약 산이 첨가되면 이러한 변성된 박테리아 DNA 사슬이 헝클어진 상태로 다시 모아질 것이다.-불용성 물질이 원심분리에 의해 뭉쳐지면 순수한 플라스미드 DNA가 상등액에 남게 된다.-어떤 경우에(특별히 SDS에 의한 세포 용해와 아세트산나트륨(sodium acetate)에 의한 중화) 대부분의 단백질과 RNA가 불용성이 되어 원심분리 단계에 의해 제거될 수 있다는 것이 이 방법의 이점이다. 따라서 페놀 추출물과 리보뉴클레이즈 (ribonuclease)처리는 알칼리 변성법이 사용될 때는 필요 없다.2) 필요한 장비-원심분리기, 탁상용 원심분리기, Micropipett, pH meter, 교반기(stirrer), Vortex mixer, 진탕 배양기(Shaking incubator), Clean bench, 미량저울, 멸균된 1.5 ml eppendorf tube (Epp. tube), Collection tube, Spin column, 비커, microtips, Magnetic Bar, Cap tube, 멸균된 이쑤시개, 알코올 램프, 얼음, 메스실린더3) 필요한 시약(1)SolGent Plasmid Mini-Prep. Kit(SolGent Co., LTD.)(SP1, SP2, SPG3, Buffer WB, Buffer EB) Kit안에 동봉되어 있음.(2)Alkali법에 필요한 시약-Glucose/Tris/EDTA(GTE) solution? NaOH/SDS solution? Potassium acetate solution, pH 4.8? TE buffer? 95 % and 70 % ethanol-Glucose/Tris/EDTA(GTE) solution? 50 mM glucose? 25 mM Tris HCl (pH 8.0)? 10 mM EDTA (pH 8.0)(3)시약제조법※ 몰농도라는 것은 용액 1000ml속에 들어있는 물질의 몰수를 말합니다.여기에 1몰은 분자량에 g을 붙인 값이다. 100㎖를 기준으로 정리하였음※ 용액의 농도를 나타내는 방법의 하나로 용액 1ℓ 속에 녹아 있는 용질의 g당량수를 나타낸 농도를 말한다.※ 당량의 개념①원소의 당량: 산소의 1/2 g원자(8.000 g)와 화합하는 다른 원소의 양을 x g이라 할 때,x를 그 원소의 당량이라고 한다. 직접 산소와 화합하지 않는 원소인 경우는 산소와화합하는 다른 원소를 중개하여 정할 수 있다. 원소의 원자량과 당량의 비는 그 원소의 원자가(原子價)와 같아지므로 다음과 같다.②산 ·염기의 당량: 산으로 작용하는 1당량의 수소를 함유하는 산의 양을 그 산의 당량 이라고 하며, 이에 대하여 그것을 중화(中和)하는 염기의 양을 염기의 당량이라 한다.예를 들면, 황산 H2SO4에서식량(式量) 98에 대하여, 산으로 작용하는 수소는 두 가지가 있으므로 당량은 49, 수산화나트륨 NaOH은 식량 40에 대하여 당량 40이다.③ 산화 ·환원의 당량: 환원작용에 관여하는 수소의 1당량을 함유하는 환원제(還元劑) 의 양 및 이것에 상당하는 산화제(酸化劑)의 양을 말한다. 예를 들면, 과망간산칼륨 KMnO4는 황산 산성으로 과산화수소와 반응하여 다음과 같이 된다. 2KMnO4＋5H2O2 ＋3H2SO4 → 2MnSO4＋K2SO4＋8H2O＋5O2 따라서, 이 때의 과산화수소의 환원제의 당량은 식량의 1/2, 즉 17이며, 과망간산칼륨의 산화제의 당량은 식량 158의 1/5이 된다.※ 필요한 기구 : 메스실린더, 비커, 교반기(stirrer), Magnetic Bar-50 mM glucose (dextrose 180.61g)?몰농도 식에 의해서 glucose가 50 mM 되게 하려면 glucose 0.9 g 필요?증류수에 glucose 0.9g을 녹인 후 최종 100㎖로 용량을 맞춘다.-25 mM Tris?HCl (pH8.0)?몰농도 식에 의해서 Tris?HCl 25mM 되게 하려면 0.3 g 필요-10 mM EDTA(ETHYLENEDIAMINETETRAACETIC ACID) (pH 8.0)?몰농도 식에 의해서 EDTA 10 mM 되게 하려면 3.722 g 필요?증류수에 EDTA 3.722 g을 녹인 후 최종 100㎖로 용량을 맞춘다.-NaOH/SDS solution (실험할 때 마다 만들어서 사용)?0.2 N NaOH → 1 N NaOH희석하여 사용?1 % SDS → 10 % SDS?최종 10 ㎖ 만들려면① 1 N → 0.2 N1 N × □ = 0.2 N × 10 ㎖ ∴ 2 ㎖ 첨가② 1 % SDS → 10 % SDS10 % × □ = 1 % × 10㎖ ∴ 1 ㎖ 첨가③ 마지막으로 7 ㎖ 의 증류수를 넣고 최종 볼륨 10 ㎖을 맞춘다.-5 M Potassium acetate solution(CH3COOK, FW 98.15), pH 4.8?최종 50 ㎖ 만들려면 몰농도 식에 의해서 14.7 g 필요?5M은 진하므로 시약 녹일 때 충분한 시간을 가지고 조금씩 넣으며 녹인다.?먼저 증류수 30 ㎖에 Potassium acetate 14.7 g을 녹인 다?pH meter로 pH를 측정하며 glacial acetic acid로 pH를 4.8로 맞춘다.?pH 4.8이 되면 증류수로 최종 볼륨 50 ㎖을 맞춘다.-TE buffer?10 mM Tris?HCl (pH 8.0)?1 mM EDTA (pH 8.0)?최종 볼륨을 50 ㎖ 하며 pH는 8.0으로 맞춘다.?계산법은 위쪽의 계산법을 참고한다.4) 필요한 용액 만들기-엠피실린 보관 용액 : 50 mg/ml의 농도로 70% 에탄올에 녹임( -20℃에서 보관)5) 필요한 배지 만들기- LB 배지 100㎖?배지조성Tryptone 1.0gYeast extract 0.5gNaCl 1.0gAgar 1.5g- LB/Amp 배지?배지조성기본 LB배지 멸균 후 Amp 추가(고체 배지를 만들 땐 50℃까지 식힌 다음 Amp 추가)6) 실험 방법(1) 실험 방법 1① LB/Amp 액체 배지(5 ㎖)에 균 접종하여 배양한다.(37℃ shaking incubator에 12시간 동안 배양)② Epp. tube에 나누어 담고 탁상용 원심 분리기에 넣고 원심 분리시킴.(원심분리 시간은 3 ~ 5분, 여러 번에 나눠 원심부리 시킴.)③ GTE solution 100 ㎕ 첨가하여 pellet을 현탁 시킨다.(vortex를 시키고 실온에서 5분간 방치 시킨다.)④ NaOH/SDS solution 200 ㎕ 첨가 후 얼음에 5분간 방치.(solution 첨가 후 vortex 금지, 손으로 가볍게 흔들어 줌)⑤ Potassium acetate solution 150 ㎕ 첨가(vortex 후 얼음에 5분간 방치)⑥ 원심분리기(centrifuge) 넣고 원심분리 시킴(12,000 RPM , 4℃ 3분) 원심분리기 온도는 미리 설정해 둔다.⑦ 새 Epp. tube에 상층액만 400 ㎕ 씩 나누어 담는다.⑧ 95 % ethanol 800 ㎕ 첨가 후 실온에 2분간 방치함.(ethanol은 상층액의 두 배를 넣는다.)⑨ 원심 분리시켜 pellet을 얻은 다음 70 % ethanol 1㎖ 첨가(12,000 RPM, 실온(20~25 ℃) 3분)⑩ 진공상태(vacuum)에서 말림⑪ TE buffer 30 ㎕ 첨가하여 pellet 녹인 후 -20℃ 에 보관.(pellet을 녹일 땐 vortex 시킴.)(2) 실험방법2(SolGent Plasmid Mini-Prep. Kit 이용)① 키트를 사용하기 전에 80 % ethanol을 준비 - Buffer WB키트에 첨부되는 RNase A powder를 Buffer SP1에 첨가하여 섞는다.(Buffer SP1은 4℃에 보관한다.)② LB/Amp 액체 배지(5 ㎖)에 균 접종하여 배양한다.(37℃ shaking incubator에 12시간 동안 배양)③ Epp. tube에 나누어 담고 탁상용 원심 분리기에 넣고 원심 분리시킴.(원심분리 시간은 3 ~ 5분, 여러 번에 나눠 원심부리 시킴.)250 ㎕의 Buffer SP1으로 pellet을 현탁 시킨다. Vortex 시킴.④ 250 ㎕의 Buffer SP2을 넣고 부드럽게 섞어준다.(Vortex 금지, 부드럽게 4~6회 위 아래로 돌려서 조심스럽게 섞는다.)

생활/환경| 2007.01.17| 5페이지| 1,000원| 조회(1,640)

플라스미드, 시약, 몰농도, 노르말농도

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DNA전기영동

2. 전기영동(DNA)1) 기본원리(1)전기영동은 DNA, RNA 또는 단백질을 크기에 따라 분리하는 방법으로 각 고분자화합물이 지닌 전하에 의해 외부에서 공급되는 전류의 방향에 따라 일정한 방향으로 크기별로 이동하는 원리를 이용한 것이다. 전기영동은 전해질로 사용되는 Buffer 용액 속에서 전장을 가로질러 이동하게 되는데 이때 이동하는 속도는 DNA가 가진 구조형태 및 크기에 따라 다르게 된다. DNA를 분석하기 위해서는 적당한 matrix가 요구되는데 이러한 matrix는 모두 network을 형성하여 미세한 구멍들을 가지게 되는 것으로 가장 일반적으로사용되고 있는 것이 천연물인 agarose이다. 이는 그 농도가 높아질수록 점점 미세한 구멍을 가지게 되어 농도를 변화시킴으로써여러 크기를 가진 물질들을 용이하게 분리할 수 있다.2) 필요한 장비-전기영동기(Mupid - 2 , COSOMO BIO CO., LTD), 탁상용 원심분리기, Micro pipett, 멸균된 eppendorf tube (Epp. tube), microtips, UV transilluminator3) 필요한 시약- Tris-base- Glacial acetic acid- EDTA- 아가로오스 - SEAKEM- EtBr (Ethidium Bromide) - SIGMA- Size marker(1Kb) - SOLGENT (냉동보관)- Loadying dye - Fermentas (냉장보관)4) 필요한 용액 만들기- 50 × TAE buffer(1L)? 242 g Tris-base? 57.1 ml Glacial acetic acid? 100 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0)- 0.7 % Aganrose gel(100㎖)? 0.7g Aganrose 에 0.5 × TAE buffer로 최종 볼륨을 100㎖로 맞춘다.? Aganrose가 완전히 녹을 때까지 가열한다.(전자레인지)- EtBr? Ethidium bromide 원액은 증류수에 10 ㎎/㎖로 녹아 있는 용액으로, 이 용액의 보관은 빛이 차단된 용기에 담아서 실온에 보관한다.이 원액을 0.5 ㎍/㎕로 희석해 사용한다.- 증류수5) 실험 방법① 0.5 × TAE buffer 100㎖에 0.7 g의 Agarose를 넣어 Agarose분말이 녹을 때 까지 열을 가한다. (0.7 % Agarose)② 약 50 ℃ 정도가 되도록 식힌 후 수평이 맞춰진 gel판에 붓고 comb를 꽂아서 sample wall을 만든다.③ 약 20분 후 gel이 굳으면 comb를 빼내고 gel을 buffer tank속에 넣고 0.5 % TAE buffer를 gel의 위 약 2~3 ㎜까지 붓는다.④ 각각의 sample에 6 × loading dye를 섞어 준다.(loading dye는 sample의 1/6 정도를 넣는다.)⑤ 준비된 Agarose gel에 size maker와 sample을 loading 한다.⑥ Veltage를 설정한 후 전기영동을 시작한다.( - 극에서 +극으로 설정 속도를 50V와 100V로 조정 가능)⑦ 약 25분 후 loading dye가 원하는 만큼 내려오면 gel을 꺼낸다.

자연과학| 2007.01.17| 2페이지| 1,000원| 조회(898)

전기영동, 필요한 장비, 필요한 시약, 필요한 용액

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