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얇은 층 크로마토그래피 (TLC) 평가A좋아요

얇은 층 크로마토그래피 (TLC)이론1크로마토그래피(chromato graphy)크로마토그래피는 혼합물 중의 각 성분을 분리분석하는 가장 강력한 방법 중의 하나이며, 여러 가지 과학분야에서 널리 이용되고 있다. 오늘날에 와서는 크로마토그래피에 의해 대부분의 무기화합물과 유기화합물이 분리 분석의 대상이 되었다. 크로마토그래피는 상에 머무르게 하는 성질을 지닌 고정상과 상과 함께 이동시키려는 성질을 지닌 이동상인 두 상은 서로 섞일 수 없는 특성을 갖기 된다. 따라서 크로마토그래피는 혼합물을 이루고 있다. 각 성분이 두 상에 대해 서로 다른 분포도를 갖기 때문에 분리가 되는 원리에 입각한 화학분리법이라고 간단히 정의 된다. 크로마토그래피 분리법의 기본요건은 용매추출법과 같다. 즉, 혼합물을 분리하기 위해서는 최소한 정지상과 이동상이 있어야하며 이들 두 상은 서로 섞이지 않아야 하고, 각각 다른 특성을 가져야 한다. 그러므로 혼합물의 각 성분은 두상에 대하여 흡착성이나 분배계수가 서로 다르기 때문에 정지상에 친화력이 센 성분은 느리게, 친화력이 약한 성분은 빨리 이동하게 된다. 따라서 이동속도의 차이가 생기는 성질을 이용하여 혼합물을 분리할 수있고, 분리된 각 성분을 정성 및 정량분석할 수 있다. 이런 분리분석법을 크로마토그래피라고 하는 것이다.(1)크로마토그래피의 원리크로마토그래피(chromatography)는 분배평형에 기초를 둔 중요한 분리기술이며, 흡착제에 대한 친화도의 차이, 즉 분별 흡착 현상을 이용하여 혼합물을 분리하고 정제하여 정성 및 정량 분석하는 방법이다. 크로마토그래피의 어원은 chroma로 '색'을 의미하는데, 최초의 크로마토그래피 분리가 색을 지닌물질을 대상으로 행하여졌기에 붙여진 명칭이다. 크로마토그래피의 원리는 용질이 되는 화학종이 이동상(mobile phase)(고정상에 비해 이동하므로)과 고정상(stationary phase)으로 불리는 두 상 사이에서 서로 교환되는 연속추출과정이다. A, B 두 성분으로 된 혼합물을 흡착시키고 적당한에서 가열하여 수분을 제거시키면 활성화된다. 너무 높은 온도로 가열하면, 비가역 탈수화가 일어나 표면적을 감소시키는 원인이 된다. 실리카는 약한산이며 염기성 용질과는 매우 강한 상호작용을 한다. 실리카 표면은 용질과의 상호작용을 변화시키기 위하여 화학적으로 변형할 수 있다. 흔히 쓰이는 다른 흡착제로는 알루미나(Al2O3․xH2O)가 있다. 공기 중에서 400℃까지 하룻밤 동안 가열하면서 활성도가 제일 큰 (활성도1급) 알루미나가 된다. 물의 양을 달리하여(가끔 저어주면서 24시간 동안)을 이루게 하면 알루미나의 활성이 감소된다. 알루미나는 보통 산성(pH4),중성(pH7), 또는 염기성(pH10)형태의 고체이다. 중성 알루미나는 대부분의 비수용성 분리에 사용되며, 산성용질을 강하게 흡착하는 염기성 활성자리를 가지고 있다. 또한 불포화 물질을 아주 잘 흡착하는 Lewis 산 자리를 가지고 있다. 활성화된 알루미나는 에스테르, 무수물, 알데히드 및 케톤 화합물과 반응하며 제거 반응이나 이성질화 반응에 촉매 역할을 한다. 염기성 알루미나는 수영액에서 양이온 교환성질을 가지며, 산성 알루미나는 음이온 교환 성질을 가진다. 셀룰로오스는 극성이 너무 커서 실리카 젤이나 알루미나로 용리시키기에는 적당하지 않은 화합물에 대해서 사용되는 흡착제이다. 다른 흡착제로는 활성탄, Florisil 및 마그네시아(MgO․xH2O)등이 있다. 일반적으로 정지상(실리카 젤, 알루미나)은 강한 극성(strong polar)이다. 따라서 실리카 젤은 극성을 띠는 화합물일수록 잘 흡착한다. 극성이 약하거나 비극성(nonpolar)인 물질일수록 실리카 젤 층에는 덜 흡착되어 멀리 이동한다. 실리카 젤과 강하게 결합하는 순서는acid and base > amides > alcohols > aldehydes,ketones >halides > esters > unsaturated hydrocarbons > saturated carbons얇은 층 크로마토그래피에서 좀 더 강한 극성을 띄는 물질일수록 4:1, 1:1, 1:4, 1:8)3. TLC 전개통에 2에서 제조한 전개용매를 바닥에서 0.5cm정도 높이까지 넣은 후 전개통의 뚜껑을 덮어 놓아 전개용매가 휘발되어 조성이 변하는 것을 막는다4. TLC판에 분석물질을 공점적(co-spot)하여 찍은 후 핀셋을 이용하여 TLC 전개통에 약간 세워서 넣는다.5. 전개용매가 TLC 판 끝에서 어느 정도 올라갔으면 연필로 이동거리를 표시하고 상온에서 판을 말린 후 자외선 램프를 이용하여 분석물질의 종류와 이동거리를 관찰한다.1. 분석물질 준비- 분석물질(벤조산,메틸벤조에이트, 벤조나이트릴)들을 선택해서 각각을 작은병에 50mg씩 넣고 각각의 병에 에틸 아세테이트3.0ml씩 넣어 녹인다.2. 전개용매 준비- 에틸 아세테이트와 헥세인의 혼합용액을 조성으로 전개용매를 제조한다.(에틸 아세테이트 : 헥세인 = 1:4)3. TLC 전개통에 2에서 제조한 전개용매를 바닥에서 0.5cm정도 높이까지 넣은 후 전개통의 뚜껑을 덮어 놓아 전개용매가 휘발되어 조성이 변하는 것을 막는다4. TLC판에 분석물질을 공점적(co-spot)하여 찍은 후 핀셋을 이용하여 TLC 전개통에 약간 세워서 넣는다.5. 전개용매가 TLC 판 끝에서 어느 정도 올라갔으면 연필로 이동거리를 표시하고 상온에서 판을 말린 후 자외선 램프를 이용하여 분석물질의 종류와 이동거리를 관찰한다.1. 분석물질 준비- 분석물질(사이클로헥산온, 사이클로헥산올)들을 선택해서 각각을 작은병에 50mg씩 넣고 각각의 병에 에틸 아세테이트3.0ml씩 넣어 녹인다.2. 전개용매 준비- 에틸 아세테이트와 헥세인의 혼합용액을 조성으로 전개용매를 제조한다.(에틸 아세테이트 : 헥세인 = 1:4)3. TLC 전개통에 2에서 제조한 전개용매를 바닥에서 0.5cm정도 높이까지 넣은 후 전개통의 뚜껑을 덮어 놓아 전개용매가 휘발되어 조성이 변하는 것을 막는다4. TLC판에 분석물질을 공점적(co-spot)하여 찍은 후 핀셋을 이용하여 TLC 전개통에 약간 세워서 넣는다.5. 전개용매가 TLC 이도 잘 구별할 수 있다. 공점적은 반응 생성물을 이미 알려진 화합물과 비교할 때도 아주 유용하게 쓰이게 된다.우리가 이번실험에 쓰이는 대부분의 유기화합물은 색깔을 띠고 있지 않으므로 이 화합물들을 눈으로 보기 위한 작업이 필요하다. 즉 물리적인 시각 확인 법을 사용하는데 이를 형광소광법이라고 한다. 이는 발색제가 없어 발색 시킬 수 없는 분석물의 경우 에도 쓰이는데 벤젠의 경우발색제가 없기에 이 방법을 사용하여준다. 이는 자외선을 쪼여서 흡광과 형관현상을 보는 방법으로 분석시료를 찍을 때 와 전개되었을 때 쪼여보면 유기화합물의 자리에는 색이 띠지 않게 되는 것을 볼 수 있다. 이는 TLC판 위의 아연과 황화카드뮴을 사용하여 만든 형광 물질로 인해 자외선 아래에서 형광을 띄며, TLC판 위에 유기물질은 이 형광을 가려서 검은 점으로 보이게 되는 것 이다.사이클로헥산올(cyclohexanol)과 사이클로헥산온(cyclohexanone)의 경우에는 발색시약이 존재하므로 발색시약을 이용하는데 이는 발색 시약을 제조한 후 (실험에서 사용한 발색 시약은 에탄올과 황산과 아니스알데하이드(anisaldehyde)를 18 : 1 : 1의 비율로 섞은 용액) 전개시킨 TLC판을 핀셋으로 집어서 발색 시약(dyeing reagent)에 담근 후 꺼내서 가열판 위에 구워서 분석물질이 전개된 정도를 확인한다. 우리가 사용한 staining solution에 들어갔던 anisaldehyde에 대하여 잠사 살펴본다면 아니스알데히드, 또는 anisic 알데히드는 알데히드와 메톡시 그룹으로 치환된 벤젠 고리로 이루어진 유기화합물이다. 이것은 강한 방향성의 투명한 무색 액체이다. 산과 에탄올에서 파라-아니스알데히드 용액은 자주 thin layer chromatography(TLC)판 발색에 사용된다. 이것은 특히 발색에 유용하다. 판 위의 다른 점들이 다른 색으로 착색되어 쉽게 구분할 수 있게 해준다. 즉 실험 결과로도 확인할 수 있었듯이 사이클로헥산올(cyclohexanol)과 사이클로헥개 거리가 달라진다는 것이다.실험2,3,4,5는 전개용매의 조성 혹은 극성을 고정시키고 분석물질을 여러 가지로 변화시켜가며 분석 물질의 전개 경향성을 살펴보는 실험으로 만약 분석 물질의 극성이 증가한다면 그에 따라 실리카 겔 층에 잘 흡착되고 전개용매에는 덜 녹아 분석 물질의 전개 거리는 줄어들게 되는 것이다. 따라서 이 경우 분석 물질을 더 멀리 전개시키기 위해서는 전개용매 역시 극성을 증가시켜 실리카 겔 층에는 덜 흡착되고 전개용매에는 잘 녹게 만들어야 한다.실험 2의 분석물질로는 벤조산(benzoic acid), 메틸 벤조에이트(methyl benzoate), 벤조나이트릴(benzonitrile)을 사용하였다. 먼저 우리는 실험 1과 동일한 실험으로 적절한 전개용매를 찾기 위해 에틸 아세테이트(Ethyl acetate): 헥세인(Hexane)이 2:1 , 1:2 , 1:4 인 전개 용액을 이용하여 전개시킨 결과 1:4의 경우가 적절다고 판단하였다. 즉 용매선택을 보아 각각의 분석시료들의 극성이 크지 않다는 것을 알 수 있다. 실험 결과 Rf값은 다음과 같다.벤조산 < 벤조나이트릴 < 메틸벤조에이트먼저 구조상으로 살펴보자. 이들 분석물질 역시 세 가지 모두 벤젠을 포함하는 화합물이다. 역시 극성이 크지 않을 것 이라고 예측할 수 있다.하지만 이들 세 화합물 중 벤조산의 경우 하이드록시기(-OH)를 포함하고 있기에 수소결합이 존재하여 실리카겔의 표면의 실란올기(-SiOH)와 결합을 하기에 이들 중 작은 Rf값을 갖는다. 벤조 나이트릴의 경우 벤젠과 N이 삼중결합을 하기에 상대적으로 짧은 결합을 이루고 전기음성도가 크기에 전자가 치우치게 되어 상대적으로 극성을 띠게 된다. 메틸벤조에이트는 벤조산과 분자량, 녹는점, 끓는점이 유사하고 카보닐기를 지녀서 약한 정전하를 띠는 화합물 이지만 메틸기를 지녀서 상대적으로 소수성기가 우세하다. 또한 벤조 나이트릴과 메틸벤조에이트의 경우 유전상수를 비교하여 보자. 벤조 나이트릴은 26.0 (20° C )으로 상대적으로 큰 유6

자연과학| 2009.05.17| 20페이지| 3,000원| 조회(1,910)

크로마토그래피, TLC, 얇은 층 크로마토그래, chromato graphy

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침전적정법

Exp4. 침전적정법과목: 분석화학실험분반: A반I. Introduction1. 적정(Titration)일정한 부피의 시료용액 내에 존재하는 알고자 하는 물질의 전량을, 이것과 반응하는데 필요한 기지농도의 시약의 부피를 측정하여 그 양으로부터 알고자 하는 물질의 양을 구하는 방법이다. 반응용액의 한쪽을 뷰렛에 취하고, 다른 한쪽을 비커에 담아 뷰렛에서 조금씩 떨어뜨려 반응의 종말점을 결정한다. 종말점을 아는 데는 여러 방법이 있으나, 가장 간단한 것은 눈으로 확인하는 방법이며, 이것을 시각적정이라고 한다. 이에는 지시약의 변색을 이용하는 방법(지시약 적정법)과, 반응시약 자체가 변색하는 경우(예를 들면 과망간산적정) 등이 있다.이 밖에 물리화학적인 방법으로서 전위차적정·도전율적정·전류적정·고주파적정·온도 적정·광도적정 등이 있다. 또, 적정에 이용되는 반응의 형식에 따라 중화적정(산적정 및 알칼리적정) · 산화환원적정 · 침전적정 · 착적정 등으로 분류되고, 적정제의 종류에 따라 과망간산적정·중크롬산염적정·세륨적정·요오드적정 등으로 구별하기도 한다. 또한, 시료와 적정용액의 직접적인 반응을 직접적정이라 하며 가장 많이 사용되는 방법이다. 경우에 따라서는 역적정·간접적정 등의 조작을 하는 경우도 있다.2. 침전적정침전생성반응을 이용한 적정법을 침전적정법이라고 하는데 여러 적정의 기초가 되는 중요한 예로서 조작이 비교적 간단하고 신속하게 정량할 수 있는 적정법이다. 분석물질과 적정시약의 농도와 Ksp의 크기가 종말점이 뚜렷이 나타나는 데 영향을 준다. 만일 두 이온으로 된 혼합물을 적정한다면, 용해도가 작은 침전물이 먼저 형성될 것이다. 용해도곱이 서로 현저히 다르면 주 번째 침전이 생기기 전에 첫 번째 침전이 거의 완결될 것이다. 반응의 종점을 확인하는 방법이 적으므로 이 방법을 이용한 물질의 정량은 몇몇에 제한되어 있다. 침전적정법에서 주로 사용하는 표준용액은 AgNO3, NaCl, KSCN 그리고 NH4SCN 의 용액 등인데 이들과 반응하는 물질은 거의 할로가하고 과잉의 Ag+ 상기의 방법으로 적정(역적정)한다.3. 주요 시약(1)질산은 [Silver nitrate]은의 질산염으로 화학식 AgNO3. 분자량 137.87. 녹는점 212℃. 비중 4.35.무색·무취의 투명한 판상 결정으로, 알코올무수물·벤젠·아세톤 등에는 잘 녹지 않지만, 에테르·메탄올 등에는 약간 녹는다. 또, 물에는 잘 녹으며 수용액은 중성이다. 순수한 질산은은 빛에 의해 변화하지 않으나, 타르타르산·수크로오스·알데히드 등에 의해서 환원되어 은을 유리시키므로 은거울반응으로서 이용된다. 염소이온을 갖는 액체와 혼합하면 염화은의 백색 침전이 생긴다. 단백질 응고작용이 있어 피부 등을 부식시킨다. 과잉의 암모니아수를 가하면 [Ag(NH3)2]NO3라는 착염이 생긴다. 은을 산에 녹여서 증발시키면 무수물이 석출된다. 은거울반응 외에 브롬화은의 제조원료, 은도금, 분석용 시약, 도자기의 착색, 상아 등의 부식제로서 사용된다. 또, 의약품 으로서는 농도에 따라 부식·소독·살균·수렴의 작용을 보이며, 묽은 용액을 피부나 점막에 도포하여 사용한다. 보존할 때는 마개를 단단히 하여 어두운 곳에 둔다. 극약으로 치사량 10g이다.(2)염화나트륨 [Sodium chloride]나트륨과 염소의 화합물으로 화학식 NaCl. 분자량 58.44. 녹는점 800.4℃. 비중 2.16. 식염. 즉 소금을 말한다. 엄밀한 의미에서 염화나트륨을 주성분으로 하는 식용 소금과 순수화학약품으로서의 염화나트륨은 구분해야 한다. 사람이 살아가는데 있어서, 또 화학공업의 원료로서 극히 중요하기 때문에, 옛날부터 다량으로 채취되었다. 천연으로는 바닷물 속에 평균 2.8% 함유되어 있으며, 암염으로 땅 속에도 존재한다.녹는점 이상에서는 휘발성이 높고, 기체가 되면 NaCl 분자가 존재한다. 보통마그네슘 등의 염류를 함유하며 조해성이 있다. 100g의 물에 0℃에서 35.7g, 100℃에서 39.8g 녹는다. 알코올에는 잘 녹지 않으며, 포화용액은 0℃ 이하에서 무색 단사정계의 이수화물 NaC칼륨 [potassium thiocyanate]티오시안산의 칼륨염으로 화학식 KSCN. 분자량 97.18. 녹는점 172.3℃. 비중 1.886이다. 무색의 결정으로 조해성을 가진다. 3가 철이온과 작용하므로 이것의 검출시약으로, 또는 염료나 의약품으로도 쓰인다. 물 100g에 0℃에서 177.2g, 20℃에서 217g 녹는다. 아세톤· 알코올·아밀알코올 등에도 녹는다. 3가 철이온과 작용하여 물에 잘 녹는 적색 티오시안산철 Fe(SCN)3를 생성한다. 티오시안산암모늄 수용액에 수산화칼륨을 가하고, 그 용액을 가열하여 증발시키면 생긴다. 또, 시안화칼륨을 황과 함께 용해하여 물로 추출하고, 여과 후에 황산 및 알코올로 분리 해도 생긴다. 사진의 보조제, 냉각제 외에 혈압강하제와 같은 의약품으로도 사용된다.(6)니트로벤젠 [nitrobenzene]벤젠의 혼합산으로 분자식 C6H5NO2. 분자량 123. 녹는점 5.8℃. 비중 1.2이다. 무색의 액체로서 물에는 잘 녹지 않지만, 유기용매와는 잘 섞인다. 수용액은 단맛이 나며, 환원시키면 니트로소벤젠, N-페닐히드록실아민을 거쳐 아닐린이 된다. 1834년 E.미처리히가 처음으로 합성했으며, 벤젠을 황산과 질산의 혼합산 속에서 니트로화시켜 얻는다. 아닐린의 원료로 염료공업에서 중요하고, 또 유기반응의 용매로도 사용된다. 또한, 약한 산화작용을 나타내므로 온화한 산화제로 이용된다. 니트로벤젠은 독성이 강하고 피부에 흡수되기 쉬우므로 취급할 때 조심해야 한다.(7)크롬산칼륨 [potassium cromate)분자식 K2CrO4 녹는점 975℃. 비중 2.732이다. 황색(노란색) 결정으로, 가열하면 적색이 되고, 냉각하면 원래대로 되돌아간다. 물에 잘 녹고, 또 용해도는 온도변화에 그다지 영향을 받지 않는다. 수용액은 가수분해하여 알칼리성을 나타내며, 용액을 산성으로 하면 주황색이 되는데, 알칼리를 가하면 이 반응은 역행한다.(8)적정액의 pH 조건중성이나 약한 염기성 용액(pH가 7에서 10.5)에서 해야 한다. 용액 옮긴다.②NaCl용액을 옮긴 삼각플라스크에 플루오레세인 5-10방울을 넣은 후 섞는다.③0.1M AgNO3로 적정한다.④위 ③까지의 과정을 2회 더 반복해 실시한다.3. Volhard법 적정(1)KSCN 표준용액 만들기①KSCN 2.4295g을 취하여 증류수에 희석해 250ml가 되게 만든다.(부피플라스크 이용) ②0.1M AgNO3 20ml를 피펫으로 정확히 삼각플라스크에 취하고 증류수를 50ml, 6M HNO3를 3ml 가한 후 다시 철지시약 1ml를 가한다.③제조한 KSCN용액으로 적정한다.④삼각플라스크 안에 붉은 색이 생기기 시작하면 조심하여 천천히 적정하고 잘 저어도 붉은색이 1분간 지속될 때 적정을 중지한다.⑤위 ④까지의 과정을 2회 더 반복해 실시한다.(2)Cl의 정량①Mohr법 적정에서 이용한 NaCl용액을 피펫을 사용하여 10ml 취한 후 삼각플라스크에 옮긴다.②6M HNO3를 3ml 가한 후 0.1M AgNO3 20ml를 넣어주어 AgCl침전을 만든다.③다시 여기에 니트로벤젠 3ml와 철지시약 1ml를 가하여 잘 젓고, 표준화 한 KSCN 용액으로 적정한다④위 ③까지의 과정을 2회 더 반복하여 실시한다.Ⅳ. Results※NaCl의 표준화●실제 취한 NaCl 질량 = 3.0082g●NaCl의 몰수 = 3.0082g × (1mole/58.45g) / 0.25L = 0.2053M●3g의 NaCl 안에 들어있는 Cl양의 이론값= 3g × [Cl] / [NaCl] = 3g × (35.45 / 58.45) = 1.8198g그런데 이를 250ml의 증류수에 녹여 각 실험마다 10ml씩 취했으므로,1.8198g × 10ml / 250ml = 0.0728g※0.1M AgNO3의 제조●이론적 AgNO3 필요량 = (0.1mole / 1L) × (0.5L) × (169.87g / 1mole)= 8.4935g●실험에서의 AgNO3의 실제농도실제 취한 AgNO3 질량이 8.4935g 였으므로 정확히 0.1M1. Mohr법①AgNO3의 적정부피1차: 21.10mld법이 있다. 이러한 은법적정 법들의 차이는 지시약이다. 우선 Mohr법에는 크롬산지시약을 사용하는데 크롬산은 농도가 아주 낮을 때는 크롬산칼륨수용액과 비슷한 황적색이고 농도가 높아짐에 따라 적색에서 적흑색이 되는 특징이 있다. Fajans법에서는 플루오레세인은 강한 형광성 화합물로써 분석목적에 따라 많은 분자들과 결합시킬 수 있다. Volhard법에서는 철지시약을 사용 하는 테 금속이온을 적정하는 킬레이트 적정에서 당량점의 판정에 쓰이는 금속지시약이다. 실험에 앞서 세척에 주의해야하는데 이번실험은 증류수를 이용하는 실험으로 증류수 안에 있는 미세한 염화이온이 있기에 염화이온의 정량을 하는 실험이기 때문에 모든 기구를 사용하기 전에 깨끗이 세척한 후 사용해야한다.이번에 하는 은적정법에서는가 이용되는데 0.1M의를 500ml를 준비해야하는데 계산결과가 8.4935g 필요한 것을 알 수 있다. 이것을 통해 우리조가 만든의 몰농도는 0.1000M을 얻을 수 있었다. 이렇게 만들어진는 표준용액으로써 적정할 때 쓰인다.첫 번째로 Mohr법을 이용한 적정이다. NaCl 3g를 250ml로 묽힌 뒤 삼각플라스크에 묽혀둔 NaCl 10ml와 크롬산 지시약 1ml와 NaHCO3울 가해준다. 여기서 NaHCO3을 가해주는 이유는 적정 중 원하는 지점에서침전이 생성되기 위해서의 농도와 PH를 8정도인 알칼리에서 실험해야하는데, 이는가 약한산인에 속하므로 과잉의가 있게 된다면 이와 결합한 Anion을 형성하여 산성도의 증가에 의해에 대한 예민도가 감소하여 생성물을 쉽게 만들지 못한다. 그러나 너무 염기성이 되면이 생기기전에이 먼저 생겨 정확한의 당량을 적정할 수 없기에 NaHCO3로 써 환경을 맞추어 준다. 모든 적정 창치를 준비되면 적정을 해준다. 이 때 과량의와 플라스크 안의이 반응을 하여의 침전을 만들게 된다. 모든이 반응하고 나면 과량의가와 반응 하여의 붉은색 침전을 형성하게 된다. 이에 대한 반응식은 다음과 같다.적정반응 :: 흰색종말점반응 :: 붉은색이 색변화를 보고의 똑같이

자연과학| 2009.05.12| 15페이지| 2,000원| 조회(1,190)

침전적정법, Mohr Method, Volhard Method, Fajans ..

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Handling of spectrophotometer & Determination of total chlorophyll in leaf tissue

EXP.4 Handling of spectrophotometer & Determination of total chlorophyll in leaf tissueⅠ. INTRODUCTION1. Spectrophotometer (분광광도기)화합물의 흡수 스펙트럼을 얻을 수 있는 기기를 적외선 분광기(infrared spectrometer)또는 분광광도기(spectrophotometer)라고 한다. 두 가지 종류의 적외선 분광기가 유기실험실에서 일반적으로 쓰이는데, 분산방식(dispersive)과 퓨리에 변환방식(Fourier trarm:FT)이 그들이다. 이 두 종류의 측정기로 4000~400의 일반적인 범위에서 화합물들의 스펙트럼을 얻을 수 있다. 이 두 기기로 얻을 수 있는 시험화합물의 스펙트럼은 거의 같지만, FT적외선 분광기를 이용하면 분산방식인 것보다 더 뻐르게 자외선 스펙트럼을 얻을 수 있다.1) 분산적외선 분광기이 측정기에서 열선으로부터 적외선 방사 빛살(beam of infrared radiation)이 방출되어, 거울을 거쳐서 같은 세기의 두 평행 방사 빛살로 갈라진다. 시료는 그중의 한 빛살 속에 놓이며, 다른 하나의 빛살은 기분(reference)으로 사용된다. 그 빛살들은 단색화장치(monochromator)속을 지나면서, 연속 적외선 주파수 스펙트럼으로 변한다. 단색화장치는, 두 빛살을 회절발(diffraction grating)로 교대로 보내기 위한 장치인 회전 부채꼴(rotating sector, 빛살 자르게 =beam choffer)로 이루어져 있다. 천천히 회전하는 회절발은 열전기쌍 검출기(thermocouple detector)에 도달하는 복사선의 주파수 또는 파장을 변화시킨다. 그 검출기는 기준 빛살과 시료 빛살 사이의 세기 비율을 감지한다. 이렇게 하여, 빛이 시료를 통과할 때 어떤 주파수가 시료에 의해 흡수 되었으며, 어떤 주파수가 영향을 받지 않았는지 검출기에서 결정된다. 이 검출기의 신호는 증폭된 후, 기록기(recoder)의 종이에 시료의 결과 스펙트럼으로 그려진다. 여기서 스펙트럼은, 회절발이 회전하여 적외선 복사 주파수가 변함에 따라 기록된다는 것을 잊지 말아야 한다. 따라서, 분산 방식 기기는 주파수 영역(frequency domain)에서 스펙트럼을 기록한다고 말 할 수 있다.주파수(정확히 말하면 파수,)는 흡수된 빛의 양에 따라 기록(plot)되는 것이 아니라, 관습적으로 투과된 빛의 양에 따라 기록되는 것이 보편적이다. 검출기가 두 광선의 세기 비율 및 다음과 같은 퍼센트 투과율을 기록하기 때문에, 주파수는 퍼센트투과율(percent transmitrance, %T)로 기록된다.퍼센트 투과율이 식에서 Is는 시료 빛살의 세기이고, Ir은 기준 빛살의 세기이다. 스펙트럼의 많은 부분에서 투과율이 거의 100%인 것을 볼 수 있는데, 이는 시료가 그 복사 주파수를 거의 투과시킨(흡수하지 않은)것을 의미한다. 그래서 최대(maximum)흡수는 도표에서 최소값(minimum)으로 표현된다. 그렇게 하더라도, 그 흡수를 피크(peak)라고 부른다.화학자는 종종 용매에 시료를 녹여서 그 화합물의 스펙트럼을 얻기도 한다. 시료 용액을 시료 빛살(smaple beal)속에 놓는 반면, 동일한 용기에 담은 순수용매를 기준빛살(reference beam)속에 넣고 스펙트럼을 측정한다. 기기는 자동으로 시료의 스펙트럼으로부터 용매의 스펙트럼을 뺀다. 이렇게 하여 기기는 시료의 스펙트럼이르부터 대기 중의 적외선 확성인 이산화탄소 및 수증기 등의 기체에 의한 효과도 상쇄한다. 이런 편리한 특징 때문에 대부분의 분산 방식인 적외선 분광기가 세기비율을 측정하는 겹빛살(double beam)처계를 갖추고 있다. 이 체계에서는 용매가 양쪽 빛살 속에서 흡수하기 때문에, 용매의 흡수는 비율 Is/Ir의 양쪽 항에 다 들어 있으므로 서로 상쇄된다. 용매없이 원액 시료를 분석할 때 시료 빛살 속에 시료를 놓으며, 기준 빛살에는 아무것도 놓지 않는다. 이런 액체의 스펙트럼을 얻을 때, 대기중 기체들이 광선 모두에 존재하기 때문에 그들 기체의 영향은 자동으로 없어진다.2. 분광광도법분광광도법은 전자기 복사성(Electromagnetic radiation)을 이용하여 물질의 특성을 규명하는 분석법이다. 분광광도법에서 주로 이용하는 복사선의 종류는 자외선(UV, 10 - 380nm), 가시광선(VL, 380 - 750nm), 적외선(IR, 750nm 이상) 등이다.부노강광도법은 주로 분자 단계에서의 물질이 복사선과 반응함으로써 나타나는 빛의 흡수 및 빛의 발산 현상을 통하여 물질의 특성을 규명하는 방법이다. 흡광광도계는 시료를 투과하고 나오는 빛의 강도를 광전관(photo tube)으로 검출하는데 형광의 경우는 보통의 흡광광도계 대신 형광 광도계(Fluo-rescence spectrophotometer)를 사용한다.흡광광도법은 전자기 복사선을 시료에 조사하였을 때 시료를 투과하고 나오는 빛의 강도, 즉 광자 에너지를 광전판에서 전기 에너지로 전환함으로써 여러 분석에 응용한다.이때, 시료에 흡수되는 빛의 양, 즉 흡광도는 시료의 농도(C) 및 통과하여야 하는 시료의 총 두께(l)에 비례한다.I = I ? 10 -?cl이를 Lambert-beer의 법칙이라고 하고 특히 시료의 농도가 1M이고 시료층 두께가 1cm일때 ?를 몰흡광계수(M-1cm-1)라 하는데, 물질마다 독특한 값을 갖는다. 따라서 어떤 물질의 몰흡광계수를 알면 흡광도를 측정함으로써 쉽게 그 시료의 농도(c)를 구할 수 있다.한편, 시료의 흡광도(A)와 빛의 투과도(T) 간의 관계를 살펴보면 시료의 농도가 높아 흡광도가 커지면 상대적으로 빛의 투과도가 작아지는, 즉 서로 반비례의 관계에 있기 때문에A(흡광도) = -T(투과도) = -(I /I ?)의 식이 성립된다.Lambert-Beer의 법칙에서 흡광도의 범위는 0≤A

자연과학| 2009.05.12| 11페이지| 1,500원| 조회(329)

분광광도계, Spectrophotometer, chlorophyll in l..

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Determination of protein amount by biuret method

EXP.6 Determination of protein amount by biuret methodⅠ. introduction(1) 단백질생물체를 건조시키면 수분이 빠져나가 탄소, 산소 그리고 수소가 서로 결합되어 형성된 단백질, 탄수화물, 지방 그리고 핵산만 남는다. 이것들이 서로 결합하여 생명체의 기본 단위인 세포를 형성하는 것이다.이 중에서 단백질 분자는 분자량이 인슐린과 같이 5,000에서부터 담배모자이크 단백질과 같은 4,000만에 이르는 것도 있다. 단백질은 아미노산이 펩티드결합(Peptide bond)에 의하여 서로 결합되어 있는데 경우에 따라 탄수화물, 지방, 핵산 그리고 햄(Heme)등이 결합하여 복합 단백질(Conjugated protein)을 이루고 있다. 단백질은 20여 가지의 아미노산들이 무한히 다양하게 결합되어 있고 단백질의 크기, 구조 그리고 물리적 특성의 다양성을 보여주고 있기 때문에 각 단백질 분자는 각각 특수한 기능에 맞는 화학적 성질을 갖고 있는 것이다. 따러서 단백질처럼 생체의 여러 가지 기능을 수행 할 수 있는 다양성을 지니고 있는 물질은 없다. 특히 단백질은 생체막이나 세포기관의 중요한 부분, 효소, 호르몬 그리고 항체 등을 형성하고 있다.이와 같은 생물학적 중요성 때문에 단백질을 잘 알아두어야 한다. 단백질의 아미노말단기(-NH2)와 카르복시말단기(-COOH)는 안일 아미노산의 아미노기와 카르복시기의 그것과 동일하게 화학반응을 하기 때문에 전기 영동법(Electrophoresis)이나 크로마토그래피(Chromatography) 방법은 복잡한 단백질을 분리하는 데 널리 쓰이고 있다.(1) 이화학적 성질에 의한 분류단백질은 그 조성 및 이화학적 성질에 의하여 단순단백질(simple protein), 복합단백질(conjugated protein) 및 유도단백질(derived protein)의 3가지로 분류한다. 그중 단순 단백질(simple protein)은 아미노산으로만 구성된 단백질이며, 특정한 용매에 대한 용해도에 따라서 albumin, globulin, glutelin, prolamin, albuminoid, histone, protamine으로 나눈다.용해성이 다른 것은 단백질을 구성하는 아미노산의 종류, 함량과 배열의 차이에 의한 것이다. 이들 중에서 식품성분으로서 중요한 것 albumin, globulin, glutelin, prolamin 이다.① Albuminalbumin은 물, 염류용액, 묽은 산, 묽은 알칼리에 잘 녹으며 가열에 의하여 응고된다. 각종 아미노산을 전부 함유하나 glycine은 아주 적게 함유하고 있다. 동물성 식품에서 ovalbumin(달걀 흰자위), conalbumin(달걀 흰자위), lactalbuimn(젖), legumelin(콩류), ricin(피마자), phaseolin(강낭콩)등이 여기에 속한다.② Albuminoidalbuminoid는 경단백질(scleroprotein)이라 하며, 물, 염류용액, 묽은 산, 묽은 알칼리에 녹지 않는다.Glycine과 proline은 많이 함유하고 있으나 tryptophan, tyrosine, cystine이 없으므로 영양가가 낮다. 동물의 세포와 조직에 많이 분포되어 있다.Keratin(피부, 머리털, 깃털, 뿔, 결합조직), elastin(인대, 건), fibroin(명주실), sericin(명주실 중에 있는 일종의 collagen)등이 여기에 속한다. collagen을 물과 함께 끓이면 쉽게 gelatin으로 변한다. 또 gelatin을 130℃이상으로 가열하면 반대로 collagen으로 변화한다.이 두 가지를 가수분해하면 같은 종류의 아미노산이 생기므로 collagen은 gelatin의 무수물이라고 생각된다.(2) 아미노산 및 단백질이 정성분석① Ninhydrin testα-아미노산, 펩티드 및 단백질들은 pH 4-8에서 그리고 100℃근처에서 ninhydrin과 반응하여 자주색 또는 붉은 자주색의 착색물질을 만든다. 착색물질이 색깔은 아미노산에 따라 다르며, 아미노산인 프롤린과 히드록시프롤린의 경우에는 황색이다. 일차 아민과 NH3도 양성반응을 나타내지만, 이 때는 CO2가 유리되지 않는다.② Xanthoprotein test단백질용액 3ml를 시험관에 취하고 진한 질산 1ml를 가하면 바로 백탁이 생긴다. 이것을 자비하면 황색의 침전이 생기던가 또는 용액이 황색으로 변하게 된다. 이것을 자비하면 황색의 침전이 생기던가 또는 용액이 황색으로 변하게 된다. 냉각 후 수산화암모늄용액에서는 알칼리성이 되며 황색은 오랜지색으로 된다. 이 반응은 단백질 중의 tyrosine, tryptophan등의 아미노산의 방향핵이 질산으로 nitro화를 받기 때문이다.③ Hopkins-cole test단백질용액 3ml를 시험관에 취하여 빙초산을 같은 양 가하고 잘 혼화시킨후에 시험관 기벽을 통하여 진한 황산을 서서히 가하면 접촉면에 자색의 고리가 생긴다. 이것을 흔들어주면 전체가 자색이 된다. 이 반응은 indole 핵이 나타내는 반응으로 단백질에 indole 핵을 갖는 tryptophan이 존재하기 때문에 일어난다.④ Biuret 반응1) 원 리수산화알칼리로 알칼리성으로 한 단백질용액에 황산구리용액을 가하면, 액은 청자∼적자색을 나타낸다. Proteose, peptone,peptide등의 단백질의 분해산물과 tripeptide 이상의 peptide는 이 반응에 양성이나 dipeptide는 음성이다. 이 반응은 다음과 같이 착염을 형성하기 때문에 정색반응을 나타내며, peptide결합(-CO·NH-)의 유무를 알기 위해 사용한다.2) 시 약① 단백질용액(albumin, gelatin등의 1% 수용액)② 10% NaOH용액③ 1% CuSO4 용액3) 조 작단백질용액 2 ㎖에 10% NaOH 용액 2㎖를 가한 후 1% CuSO4용액 1∼2방울을 가한다. Cu(OH)2를 생성함과 동시에 이것이 단백질과 반응하여 적자색을 나타낸다. CuSO4용액의 첨가량을 증가시키면 용액의 색은 적→적자→청자색으로 변한다.4) 방법도시① 10% NaOH 용액 2㎖ ② CuSO4용액 1∼2방울Ⅲ. MethodsBSA(10mg/ml)K-PO4 bufferBlank1mg/ml2mg/ml??9mg/ml10mg/ml0ml0.1ml0.2ml??0.9ml1.0ml1ml0.9ml0.8ml??0.1ml0ml① 11개의 시험관에 blank와 BSA solution을 희석한다.② 각각 희석시킨 tube에 Biuret reagent를 4ml씩 넣고 잘 섞어 준다.③ 실온에서 약 20분 정도 방치한다.④ 540nm에서 O.D값을 측정하여 standard curve를 그린다.< Sample Preparation>① sample 10개, sea sand 0.5g, K-PO4 buffer 5ml를 유발에 넣고 곱게 마쇄한다. 마쇄한 것을 K-PO4 buffer 5ml이 담겨 있던 tube에 다시 넣는다.② 2700rpm에서 10분간 원심분리 한다.③ 분리된 상등 액의 부피를 재고(반드시 기록) 그 중 3ml만을 K-PO4 buffer 7ml씩 분주한 tube에 넣고 잘 섞는다.④ 3의 용액에서 pipet을 이용하여 1ml 취하여 시험관에 옮긴다.⑤ Biuret reagent 4ml를 넣고 잘 섞고 20분간 방치한 후, 540nm에서 O.D값을 측정한다.⑥ standard curve에서 O.D값을 이용하여 protein함량을 구한다.Ⅳ. ResultBSA(X축)K-PO4 buffer(Y축)0.10.0010.20.0160.30.0150.40.0210.50.0260.60.0280.70.030.80.0310.90.03110.049< Sample Preparation>종자의 O.D값 = 0.029=0.039X+0.003X = 0.67ml? 1ml당 단백질이 0.67ml종자의 단백질 함량Ⅴ.Discussion이번 실험은 Biuret 반응을 통해서 종자와 자엽에 포함된 단백질 함량을 알아보는 실험을 하였다.Biuret 반응은 단백질의 정성 ? 정량 분석에 많이 쓰이는 대표적인 시험으로 이는 수산화알칼리로 알칼리성으로 한 단백질용액에 황산구리용액을 가하여 착염을 형성하여 정색반응을 하여 peptide결합(-CO·NH-)의 유무를 알기 위해 사용한다. 정색반응 된 용액은 청자∼적자색을 나타내게 되며, Proteose, peptone, peptide등의 단백질의 분해산물과 tripeptide 이상의 peptide는 이 반응에 양성이나 dipeptide는 음성반응을 나타내게 된다. 이 반응은 다음과 같이 착염을 형성하기 때문에 정색반응을 나타내며, peptide결합(-CO·NH-)의 유무를 알기 위해 사용한다.엄밀히 말하면 단백질이 금속이온인 구리의 (+)charge가 단백질의 N의 (-)charge를 끌어 묶어 두어 착색되어지는 것이다.우선 BSA의 농도를 다르게 하여 Biuret reagent을 넣고 상온에서 20~30분간 방치한다. 이는 위 그림처럼 각각의 이온들과 단백질용액이 충분히 결합되어야지만 정확한 책을 띠기에 이를 충분히 반응되게 방치한다. 보톤 반응을 촉진하기위해 외부의 에너지를 가하여 주로 열을 가하는데 단백질의 반응에서는 사용하지 않고 방치해두는 것이 좋다. 그 이유는 단백질이 열에 매우 민감하고 다른 요인에서도 민감하기 때문에 상온에 방치해두는 것이 가장 바람직하다.반응되어진 용액들을 분광기로 540nm에서 흡광도를 측정하여 주는데 이는 착색물질의 색이 청자색이므로 이 색을 최대로 흡수하는 파장이 540nm이기 때문이다. 이러한 흡광도와 BSA의 농도로 standard curve를 그린다.

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단백질, 뷰렛반응, protein amount, Biuret method

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Photosynthesis Ⅰ : Isolation of Thylakoid from Spinach&: Hill reaction & chlorophyll fluorescence

EXP.3 Photosynthesis Ⅰ: Isolation of Thylakoid from SpinachEXP.4 Photosynthesis Ⅱ: Hill reaction & chlorophyll fluorescenceⅠ. introduction1) 광합성[photosynthesis]식물은 태양 에너지와 간단한 몇 가지 무기 물질을 이용하여 세포에 있는 엽록체에서 에너지 화합물을 합성하고 그 과정에서 산소를 만들어 내는데 이것을 광합성이라고 한다.스스로 에너지를 합성해낼 수 있는 독립 영양 생물(autotroph)에는 에너지를 빛에너지로 포착해서 고분자 유기물을 만들어 내는 것과 화학에너지 형태로 포착해서 고분자 유기물을 만들어 가는 두 가지 종류가 있다. 전자를 광합성(photosynthesis), 후자를 화학 합성(chemosynthesis)이라고 한다. 광합성은 물질계에서 생물계로 에너지를 유입시키는 과정으로 모든 생물은 직접 혹은 간접적으로 광합성에 의존해서 살아가고 있다. 화학 합성이 일부 세균에 국한되는 반면 광합성은 모든 녹색식물에서 일어나며, 빛에너지가 식물에 포착되어 화학에너지로 전환되고, 종속 영양 생물에게 고분자 유기물을 제공하며, 호기성 생물의 호흡에 이용되는 산소를 방출하는 등 생리적으로 중요한 과정이다.6CO2 + 6H2O + 빛 에너지 → C6H12O6 (포도당) + 6O2▶ 의의 : 빛에너지가 화학 에너지로 전환됨 무기물인 이산화탄소와 물로부터 유기물인 포도당이 생성 흡열반응▶ 장소 : 엽록체(엽록소 a, b,c,d,e, 카로티노이드계 색소)▶ 녹말 검출 ← 요오드 반응에 의해 갈색의 녹말이 청남 색으로 바뀜 광합성의 종류 광합성은 빛 에너지를 이용한 광화학 반응(명반응)과 빛과 관계없이 일어나는 효소 반응(암반응)으로 나눌 수 있다.2) 틸라코이드 [Thylakoid]①형성엽록체의 틸라코이드 형성에는 빛이 필요하다. 싹이 트기 전이나 싹이 땅속에서 나오기 전, 빛이 없을 때 엽록체의 전구체인 전색소체(proplastid)는 에티때문에 틸라코이드 내부의 양성자 농도는 외부보다 높아진다. 또한 전자가 가진 에너지를 이용하여 외부의 양성자를 안쪽으로 능동 수송한다. 이렇게 형성된 양성자의 농도차를 이용하여 틸라코이드 막에 있는 CF1복합체가 ATP를 합성한다.3) 엽록소의 흡수 파장과 형광 파장에테르(Ether)로 엽록소를 추출하여 흡수대를 측정하면 엽록소 a와 b 적색부에 큰 흡수대와 청색부에 다른 하나의 작은 흡수대를 가지며, 엽록소 a는 엽록소 b에 비해 적색부에서 더 장파장 쪽으로 청색부에서 더 단파장 쪽으로 흡수극대를 가진다.엽록소의 또 다른 광화학적 성질은 적색부에서 형광파장을 나타내는 것이다. 형광의 강도는 용매에 따라 다르며 (에테르에서는 664.5nm), 형광 방출은 흡수한 빛에너지의 약 30%에 달한다. 이러한 형광 특성은 퀴논이나 페닐히드라진(phenylhydrazine)등에 의하여 억제되는데 이러한 현상을 형광소광(fluorescence quenching)이라 한다. 또한 산소에 의해서도 억제되며, 공기 중에는 약 20% 정도 억제 된다. 안정된 가장 낮은 에너지 상태 즉 바닥상태(또는 기저상태: ground state)에 있는 엽록소 분자는 빛을 흡수하면 들뜬 상태(excited state)의 분자(Chl*)로 (상태)전이된다. 들뜬 상태는 그 에너지 수준에 따라서 에너지 수준이 낮은 것부터 첫째, 둘째, 셋째 들뜬 상태로 부른다.그림 1에서 엽록소 분자의 흡수스펙트럼에서 적색 지역의 흡수는 바닥상태에서 첫째 들뜬 상태로의 전이를 보여주며, 보다 높은 에너지를 가지는 청색광의 흡수는 높은 에너지 수준의 들뜬 상태로의 전이가 일어남을 의미한다. 빛의 흡수과정은 대개 femtosecond (10-15s) 수준에서 일어난다. 청색광의 흡수와 같이 첫째 들뜬 상태 보다 높은 에너지 수준의 들뜬 상태로 전이된 엽록소 분자는 매우 불안정하여 신속히 에너지의 일부를 1 picosecond (10-12s) 이내에 열로써 주변으로 발산시키고, 첫 번째 들뜬 상태로 되어 수 nano 이때 방출되는 빛을 인광이라 부르며 인광의 수명은 길게는 수초까지 매우 길다. 네 번째 경로로 들뜬 상태의 에너지가 광화학 반응을 일으키기 위해 사용되어진다. 이 광화학 반응이 효율적으로 일어나기 위해서는 광화학 반응 속도가 엽록소 분자가 들뜬 상태에서 수 nanoseconds 동안 머무는 기간, 다시 말하면 형과의 수명, 보다 훨씬 빨라야 한다. 즉, 광합성에 의한 에너지 저장과정에서 처음 일어나는 초기 광화학 반응은 알려진 가방 빠른 광화학 반응 중의 하나로서 picosecond(10-12s) 수준에서 진행된다. 이외에도 들뜬 에너지는 다른 화합물로 에너지 전이 등 여러 경로를 거쳐 소멸될 수도 있다. 이상에서 보듯이 엽록소가 흡수한 에너지는 크게 열, 형광 및 광합성(초기 광화학 반응)에 이용되므로 광합성 활성은 형광 세기의 변화로 간접적으로 측정할 수 있다 . 즉 형광의 증가는 광합성 활성의 감소를 의미한다.4) 형광유도과정과 광합성 효율엽록소에서 방출되는 형광은 광합성의 초기 광화학반응에 사용되지 못한 빛에너지의 일부가 다시 빛으로 방출되는 것이다. 이와 같이 버려지는 에너지로서의 형광은 식물에게는 쓸모가 없으나, 광화학반응의 활성이 증가 혹은 감소함에 따라 형광의 방출량이 변화하므로 광합성 연구에 중요한 도구로 이용될 수 있다.식물의 잎을 어두운 곳에서 암적 응시키면 엽록체 전자전달계의 전자전달 체들이 산화된 상태에 놓이게 되는데, 여기에 빛을 쏘이면 그림과 같은 형광의 방출곡선이 그려진다. 이 곡선은 전형적인 모양으로 초기에 형광이 증가하였다가 감소한 후 정류상태에 도달하는 것을 나타내고 있다. 이와 같은 형광 유도과정을 카우츠키(kautsky)효과라고 한다. 암적 응된 잎에 빛을 매우 약하게 쪼여줄 때 최소의 형광이 나오는데 이를 초기 형광(Fo)이라고 하며, 이때의 광계의 반응중심은 모두 빛에너지를 받을 준비가 되어 있는 상태, 즉 열린 상태에 놓여 있다. 암적 응된 잎에 광합성을 포화시킬 만큼 강한 빛을 비추거나, 혹은 DCMU를 처리하여 이스트의 물 추출액을 분리 엽록체의 반응현탁액에 첨가하면 O2 발생이 현저히 증가하였다. Hill은 O2 발생을 촉진하는 물질을 규명하고자 다음과 같은 실험을 했다. 즉, 이스트의 물 추출물을 Ca3(PO4)2 겔로 처리하고 다시 옥살산(Oxalic acid)을 첨가해서 얻은 것을 사용하면 O2 발생이 현저하게 촉진된다는 것을 알게 되었다. 그 후의 연구에서 분리 엽록체 현탁액에 적당한 산화제를 넣어주면 CO2의 흡수 없이 빛에 의해 O2가 발생함을 확인하였는데(1937년), 나중에 이것을 힐반응(Hill reaction)이라고 불렀다.Hill은 처음에는 산화제로 옥살산 제2철을 사용했으나, 여기에 시안화칼륨 제2철[K3Fe(CN)6]을 함께 넣어주면 O2 발생이 오랫동안 유지됨을 알았다. 그가 사용한 반응 액의 조성은 옥살산칼륨(0.5M), 시안화칼륨 제2철(0.02M), 황산철암모늄(0.01M), 설탕(0.2M), 적당량의 엽록체가 현탁되어 있는 인산완충액(pH 7.5)등이었는데, 이것을 힐용액(Hill solution)이라 한다. 이 용액을 사용한 실험에서 Hill은 ① O2 발생은 CO2의 유무와 무관하며 ② 발생하는 O2는 옥살산량에 비례하고 ③ 제2철은 산소발생과 함께 제1철로 환원되며 ④ O2발생의 초기 속도는 첨가한 엽록체 량에 비례하고 ⑤ O2 발생 속도는 빛의 강도에 비례하지만 어느 정도 이상으로 강해지면 포화되는 것을 알았다.이러한 실험으로 광합성이 O2발생과 CO2 고정의 두 과정으로 분리될 수 있음을 알았으며, 이에 힘입어 분리 엽록체를 이용하여 광합성 메커니즘을 규명하고자 엽록체의 해체와 재구성의 실험이 활기를 띠게 되었다. 그리고 여러 사람들에 의해서 여러 가지 힐산화체(Hill oxidant)가 발견 또는 개발되었으며, 산화제로 사용하는 화합물과 그것들의 산화환원준위와의 관계 및 생체에서 이와 같은 산화환원준위를 갖는 화합물들이 어떠한 것인지를 알려는 노력이 싹트게 되었다. 그 결과 O2 자신도 조건에 따라서는 힐산화제가 될 수 있h 7.5)50mM NaClⅢ. Methods1) Thylakoid막의 분리 (Filtration and differential centrifugation)① 약 1g의 시금치 잎에 10ml의 추출액을 첨가 하여 유발에서 2회 마쇄한다.② 마쇄액을 4겹의 cheesecloths를 사용하여 거른 후 1.200 x g (3000rpm 이상)에서 5분간 원심분리한 후 상층 액은 버리고 침전물을 10ml 의 현탁액으로 현탁 한다.③ 현탁액을 다시 1.000 x g (3000rpm)에서 3분간 원심분리 하여 얻어진 침전물을 10ml 정도의 현탁액으로 재 현탁 한다.2) Hill reaction 측정①11개의 test tube에 0.2mM DCPIP 1ml , buffer 2ml , Thylakoid액 1ml을 넣고 이 중 2개 tube는 aluminum foil로 싸고 , 또 다FMS 2개의 tube에는 20㎕의 DCMU를 첨가 한다. 1개의 control test tube에는 Thylakoid액 대신 buffer 1ml을 넣는다.☞DCMU의 반응 농도는 50μM이 된다.②각 2개씩의 test tube들을 관원으로부터 5, 10, 20cm의 거리에 두고 5분간 빛을 조사 한다. Control과 DCMU가 첨가된 tube들은 5cm의 거리에 둔다. 빛을 끈 후 모든 tube 들로부터 빛을 차단한다.☞5cm test tube의 파란색이 흐려질 때까지 반응시킨다.③각 tube들의 흡광도를 600nm에서 측정한다.(blank는 현탁액)Ⅳ. Result1. Hill Reaction 측정 결과 (graph로 결과 처리할 것)첨 가 액처 리 방 법흡 광 도시험관 10.2mM DCPIP, buffer, Thylakoid액빛에서의 거리 5cm0.105시험관 20.2mM DCPIP, buffer, Thylakoid액빛에서의 거리 10cm0.110시험관 30.2mM DCPIP, buffer, Thylakoid액빛에서의 거리 20cm0.124시험관 40.2mM DCPIP, buffer, T.

자연과학| 2009.05.12| 9페이지| 1,500원| 조회(348)

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