세포의 동결보존 (Freezing)Introduction배양세포를 여러 세대 유지할 때 몇 가지 문제점이 있다① 주세포가 계대배양 중에 그 형상, 성질이 변할 수 있다② 계대배양 중 마이코플라스마 등에 감염될 수 있다③ 유한증식성 세포에서는 계대배양 을 오랫동안 계속할 수 없다이러한 문제점들을 해결하는 방법으로 cell을 freeze하는 방법이 쓰인다즉 세포배양 중에 일정량의 세포를 앰플에 분주하여 동결보존하고 필요시에 하나씩 꺼내 실험에 사용한다. 이에 따라 매주 계대배양 하는 시간과 노력을 절약할 수 있다세포의 동결, 융해 후의 생존율은 동결 시의 냉각속도, 보존온도, 융해 시 융해속도, 동결보호제의 종류와 농도 등 여러 가지 조건에 따라 민감하게 차이가 난다Method1. CO2 incubator에서 cell 배양 dish를 꺼내고 배지를 모두 흡입 제거한다2. PBS를 10ml 정도씩 넣고 washing 한다3. Washing 이 끝나면 RPMI-1640 배지를 10ml 분주하여 바닥으로부터 cell을 떨어트려준다4. 위의 cell suspension을 tube로 옮긴 후 1000rpm으로 3분간 원심분리 한다5. Cell pellet만 남기고 상층액은 흡입 제거한다6. Cell stock solution (Medium, DMSO, FBS, HS, Glycerol 각각 일정 비율로 포함)을 한 dish 당 1ml씩 첨가하여 suspension 한다7. 동결 vial 에 위의 suspension을 1ml씩 각각 분주 후 냉동실로 옮긴다8. Cell 은 -20℃에서 동결시키고 ?70℃ deepfreezer로 옮긴 후 질소탱크 (-196℃)로 옮겨 보관 한다Tip☞ cell stock solution: 세포 동결 보존 시 발생하는 손상으로부터 세포를 보호하기 위해 넣어주는 solution으로 cell에게 맞는 구성으로 만드는데, DMSO 의 역할은 세포 외액에 얼음 결정이 형성될 때 발생하는 삼투압 스트레스로 인한 세포 손상을 막아주고 세포에 치명적인 세포 내 얼음결정 형성을 억제하는데 있다
