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Using gel filtration to study ligand - protein interactions

1. 실험제목 : Using gel filtration to study ligand - protein interactions2. 실험목적 : serum albumin은 혈액 내에서 fatty acid 등의 중요한 영양분을 말초의 tissue까지 운반하면서 순환한다. ligand라고 불리는 transported molecule은 흔히 protein과 핵산의 선택된 binding site에 대해 특이한 친화성을 가진다. 이번 실험에서는 ligand - protein interaction의 반응동역학에 대해 bovine serum albumin과 dye phenol과의 binding을 이용하여 조사할 것이다. gel filtration technique은 dye protein complex를 분리하기 위해 사용될 것이다. 실험에서 얻어진 data는 binding curve 제작으로 분석될 것이다.3. Contents⑴Ligand binding by macromolecules=>이번 실험에서의 gel filtration technique은 dynamic binding of small molecules by protein을 연구하기 위해 사용되어질 것이다. cell과 organism 사이에서는 많은 dynamic process가 일어나는데, 흔히 하나 또는 많은 smaller molecule과 macromolecules과의 binding을 포함한다.①hormone의 action : hormone은 약하지만 특이성을 가진, hormone 분자와 targel cell의 membrane에 있는 receptor protein과의 interaction의 결과에 의해 response가 형성된다.②enzyme의 조절 : small molecules은 특정 enzyme과 interaction을 이루어서 enzyme의 physical properties를 조절한다.③Drug의 action : 혈액 내의 drug는 주로 plasma protein에 carrier와 같이 binding된다1)을 얻는다.=>= ([L])/([L]+1)은와 [L]에 대해 그래프를 얻으면 limiting value 또는 saturation level에 접근하는 hyperbolic curve를 형성한다. 이 point에서는 M의 모든 binding site는 occupied되어있다. 이 saturation point를 측정하는 것은 어렵기 때문에, 주로 linear plot으로 변형하여 측정한다.⑤은 average number of occupied sites per M이고 n은 number of potential binding sites per M이다. M의 모든 binding site가 동등하다고 가정하면= ([L])/([L]+1)의 식은 = (n[L])/([L]+1)으로 바뀐다. n-는 average number of unoccupied sites per M이므로, n- = n - (n[L])/([L]+1)이다. 정리하면 (n - ) = n / ([L]+1)이다. /(n-)는 ratio of occupied sites to nonoccupied sites on M을 나타내고 이는 다음과 같이 표시된다. 최종 밑줄 친 관계식을 Scatchard's equation이라 한다.or :⑥모든 binding site에서의는 동일하다는 것은, binding site들은 서로 영향을 주지 않는다는 뜻이다. 그러나 많은 ligand-macromolecule interaction은 이러한 영향이 작용하는 것을 보여주는데, 이를 cooperativity라 한다.⑶ligand-macromolecule interaction의 실험적 측정①equilibrium dialysis, ultrafiltration, spectroscopic measurements : 복잡함②simple method : some measurable change를 UV-VIS region에서의 흡수로 그것을 detect하고 정량하는 differential method가 있다.=>binding ligand는 UV-Ve : expermental biochemisty, Rodney Boyer.// Merck index 12th ed.1. Introduction⑴실험 제목 : Using gel filtration to study ligand - protein interactions⑵실험 목적 : ligand - protein interaction의 반응동역학에 대해 bovine serum albumin과 dye phenol과의 binding을 이용하여 조사하며, gel filtration technique을 사용하여 dye protein complex를 분리해낸다.2. Materials & Procedure⑴시약 및 초자- BSA, fatty acid free- Acetate buffer; 0.1 M at pH 4.0, 4.5, 5.0- Sodium phosphate buffer; 0.1 M at pH 6.0, 7.0, 8.0- Phenol red in buffer (1.0 g of phenol red/100 mL of buffer)- Sephadex G-25-150; slurry in buffer- Chromatography columns; 1.5 X 15 cm- Fraction collector- Spectrometer for A520 measurements and cuvettes⑵실험 과정*Preparing the Sephadex column①Clamp the column to a ring stand.②Place a rack of test tubes under the column for collecting fractions.③Preparing Sephadex G-25=>Preswollen in water for several hours. and Then fine particles are removed by defining. Finally, Equilibrated in buffer.④The column is poured using between 20 and 25 mL ofnt of buffer and gently mix to dissolve protein.③Add the indicated amount of phenol red solution.④Mix gently but well for about 3-4 minutes. (Do not shake.)⑤Remove all buffer from the top of the gel.⑥Use a pipet to apply 250 mL of the reaction mixture to the top of the Sephadex column. (Carefully drop the sample directly onto the top of the paper disk.)⑦As soon as the colored solution has entered the gel, add a few drops of buffer to wash all reaction mixture into the gel.⑧Carefully add buffer to the top of the gel, begin to collect 1㎖ fractions, and set a column flow rate of about 1 drop per 1~2 seconds.⑨Add buffer continuously to the top of the column as you collect fractions.⑩Continue to collect 1㎖ fractions and add buffer until all yellow dye color has eluted from the column (about 50 fractions)⑪Turn off the stopcock of the column.⑫The yellow color in the fractions is due to the presence of phenol red. The red color is more intense, so the fractions are made basic by the addition oe를 좀더 빠르게 증가시킨다면 free ligand에 대한 peak를 얻을 수 있을 것으로 생각된다.⑵pH를 일정하게 하고 phenol red의 양을 다르게 넣어줬을 때의 실험 결과분석①예상 : 먼저 BSA에는 적어도 6개의 phenol red가 binding할 수 있다. phenol red의 양이 BSA에 binding할 수 있는 site의 수보다 적다면, protein-ligand complex의 양은 phenol red의 양에 의해 결정될 것이다. 그러므로 BSA의 binding site가 phenol red에 의해 포화되지 않는 정도까지는, phenol red의 양이 증가하면 protein-ligand complex의 양도 증가하여 elution되는 양이 많아져서 peak의 absorbance값이 커질 것으로 생각되며, 만약에 BSA의 binding site가 phenol red에 의해 포화된다면, 더 이상 phenol red의 양을 증가시켜도 absorbance의 값은 변화가 없을 것으로 생각되었다.②실제 실험 결과 : 실제 실험 결과에서는 phenol red 0.05㎖와 0.1㎖를 넣었을 때에는 예상한데로 결과값이 얻어졌다. 하지만, 0.2㎖의 phenol red를 넣었을 때는 peak가 아예 나타나지 않는 결과가 얻어졌다. 일단 phenol red 0.05㎖와 0.1㎖를 넣었을 때에는, BSA에 phenol red가 binding을 하는데 0.05㎖보다는 0.1㎖의 phenol red를 넣었을 때 더 많이 binding하고 이에 따라 BSA-phenol red complex가 많이 생겨서 absorbance값이 증가한 것으로 생각된다. 그리고 0.2㎖의 phenol red를 넣었을 때 peak값이 나타나지 않은 이유는 확실치 않으나, phenol red의 absorbance값이 아예 나타나지 않은 것으로 보아 2가지 경우로 생각될 수있다.=>complex가 elution이 되지 않은 경우 : phenol red가 많은 만큼 complex의 형성도 .

자연과학| 2009.05.01| 8페이지| 3,000원| 조회(832)

실험, Gel filtration, interaction, ligand - p..

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The action of restriction endonucleases on plasmid or viral DNA

1. 제목 : The action of restriction endonucleases on plasmid or viral DNA2. 실험목적 : 다양한 restriction enzyme들을 plasmid 또는 viral DNA와 함께 incubate시켜서, 형성된 product DNA fragment들을 agarose gel electrophoresis를 통해 분석한다.3. Introduction=>이 실험에서는 hybrid plasmid construction과 analysis-restriction enzyme action의 중요성에 대해 언급할 것이다. 여기서 소개된 이 과정들은 모든 DNA 분자들의 analysis와 characterization에 관해서 널리 사용되고 있는 과정들이다.4. Content & Theory⑴restriction endonucleases=>이중 나선 구조의 DNA 내에서 특정 base sequence를 인식하여 2개의 hydrolytic cleavage를 촉진시키는(catalyzed) enzyme이다.①생물학적 목적 : foreign DNA를 degrade시키거나 restrict시키는 것이다.=>이때 host DNA는 protect되는데, cleavage site 부근의 some bases들이 methylation되기 때문이다.②EcoRⅠ의 action은 다음과 같다.5`-GGATCC-3`-(EcoRⅠ,)->5`-G+GATCC-3`3`-CCTAGG-5`3`-CCTAGG-5=>EcoRⅠ는 specific hexanucleotide sequence를 인식한다. 두개의 phosphodiester bond가 hydrolyzed되고, 결과적으로 두 strand의 fragmentation이 형성된다. 이에 따라 cohesive end도 함께 형성된다.③명명법 : three-letter abbreviation representing the source + a letter representing the strain + roman numera보들을 얻을 수 있다.--->restriction enzyme map for a DNA molecule은 restriction endonuclease에 의한 cleavage sitefhk 각 enzyme들을 적용시 얻을 수 있는 fragments의 개수를 display한다.=>map은 적은 수의 fragments를 형성하는 restriction endonuclease에 의한 digesting plasmid DNA에 의해 만들어진다. 각 single nuclease에 의해 생긴 digest of DNA들은 agarose gel electrophoresis를 통해 분석이 가능하다 ---> 각 digests은 다시 추가적인 일련의 additional restriction enzyme으로 처리되어 다시 agarose gel electrophoresis로 분석된다.=>restriction map은 여러 시도와 error들에 의해 생긴 조각들을 logic과 함께 고려하여 만들어진다.⑨restriction endonuclease digest의 경우, DNA fragment들의 2가지 characteristics를 알 수 있다 : 대략적인 분자량(electrophoresis로부터) & fragment ends의 nature(각 restriction enzyme에 대한 selectivity로부터)⑵practical aspects of restriction enzyme use=>이 enzyme들은 heat-labile하고 비싼 시약이므로 사용전 충분한 계획과 주의가 필요하다.①enzyme들의 최적의 condition은 이미 알려져 있으며, -20℃ + 50% glycerol를 사용하여 store가 가능하다.②1회용 장갑을 끼고 다루며, 사용되기 바로 전에 freezer에서 꺼내고, 꺼내고 난 후에도 ice bucket에 담아놓는다. 절대 RT에서 보관하지 않는다(degradation 가능).③대략 1㎍(or 이하)의 DNA와 1 unit의 enzyme을 사용한다.=>1 uniteriment=>이번 실험에서는 bacterial plasmids, λ phage DNA or viral DNA에서의 restriction enzyme의 action을 evaluate하는 것이다. reaction mixture는 agarose gel electrophoresis에 의해 fragment들의 숫자와 size를 알 수 있다.5. Reference- Modern experimental biochemistry, 3rd ed., Rodney Boyer, Benjamin Cummings.1. Introduction⑴실험 제목 : The action of restriction endonucleases on plasmid⑵실험 목적 : 다양한 restriction enzyme들을 plasmid 또는 viral DNA와 함께 incubate시켜서, 형성된 product DNA fragment들을 agarose gel electrophoresis를 통해 분석한다.2. Materials & Procedure⑴시약 및 초자- plasmid (60ng/㎕)- Incubation buffer for restriction enzymes(10X) (0.5M potassium acetate, 0.2M Tris-acetate, 0.1M magnesium acetate, 10mM DTT)- 1X TAE 0.1ℓ, agarose 1.2g, ethidium bromide(10mg/㎖) 10㎕- 6X loading buffer(0.25% BPB/XCFF, 30& glycerol)- Distilled water- Restriction enzymeBspHⅠ2500 unit#R0517LEcoRⅠ10000 unit#R0101SFspⅠ2500 unit#R0135LPvuⅡ5000 unit#R0151S⑵실험 과정①다음과 같은 각각의 enzyme 반응 혼합물들을 만든다.반응혼합물1234567plasmid DNA5㎕5㎕5㎕5㎕5㎕5㎕5㎕enzymeEcoRⅠ 0.5㎕PvuⅡ 0.5㎕FspⅠ 0.5㎕Bs결과 : 원본사진=>왼쪽부터 mix 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7이다.⑵electrophoresis의 결과 : size marker를 토대로 ladder에 size를 결정한 사진4. 결과 분석⑴각 restriction enzyme에 대한 DNA fragments반응혼합물1234567enzymeEcoRⅠPvuⅡFspⅠBspHⅠPvuⅡFspⅠPvuⅡBspHⅠBspHⅠFspⅠfragments (kb)3.02.60.441.81.22.01.01.351.20.44(0.050)1.00.890.580.441.450.580.530.38①원래 reaction mixture 5번에서 0.050kbp(50bp)짜리 fragment가 ladder의 일부로 나타나야하나, size marker의 최소가 0.1kbp여서 gel 하단의 50bp의 ladder는 gel에서 빠져나가 손실되었을 것으로 생각된다.②EcoRⅠ은 plasmid의 전체 크기를 알기 위해서 사용한 것으로 생각된다.⑵Restriction map 그리기①일단 BspHⅠ를 기준으로 map을 작성한다.②PvuⅡ+ BspHⅠ일 때, 0.89 + 0.58 + 0.44 = 1.91로서 BspHⅠ로 잘랐을 때의 2.0 kbp 조각과 일치한다. 그러므로 2.0kbp조각이 P에 의해 3조각으로 잘리는 것을 알 수 있다. 그리고 PvuⅡ로만 잘랐을 때 조각이 2.6, 0.44로 나뉘는 것으로 보아 이 세 조각 중 가운데 조각이 0.44kbp임을 알 수 있다. plasmid는 원이므로 0.58과 0.89조각은 아무 방향으로나 둔다.③일단 BspHⅠ + FspⅠ에서 보면, 1.45 + 0.53 = 1.98이고, 0.38 + 0.58 = 0.96이다. 그러므로 B의 fragment에서 1.0kbp에서 한번, 2.0kbp에서 F에 의해 한번씩 잘림을 알 수 있다.④B의 1.0kbp 조각에서 B-F 조각 중 한쪽을 0.58로 두면 PvuⅡ+ FspⅠ의 조각들에서 1.2kbp에 해당하는 조각(0.58 + 0.58 = 1.16)과, PvuⅡ+ F0.05) = 1.11, 1.76- BspHⅠ : (0.58 + 0.38), (0.89 + 0.44 + 0.05 + 0.53) = 0.96, 1.91- PvuⅡ+ FspⅠ: (0.53 + 0.58), (0.38 + 0.89), 0.05, 0.44 = 1.11, 1.27, 0.05, 0.44- PvuⅡ+ BspHⅠ : 0.44, (0.05 + 0.53), (0.58 + 0.38), 0.89 = 0.44, 0.58, 0.96, 0.89- BspHⅠ + FspⅠ : 0.53, 0.58, 0.38, (0.89 + 0.44 + 0.05) = 0.53, 0.58, 0.38, 1.38enzyme실험에서 얻은fragment의 size값restriction mapd에서 얻은 fragment의 size값1EcoRⅠ3.02.872PvuⅡ2.6, 0.442.43, 0.443FspⅠ1.8, 1.21.76, 1.114BspHⅠ2.0, 1.01.91, 0.965PvuⅡ + FspⅠ1.35, 1.2, 0.44, 0.0501.27, 1.11, 0.44, 0.056PvuⅡ + BspHⅠ1.0, 0.89, 0.58, 0.440.96, 0.89, 0.58, 0.447BspHⅠ + FspⅠ1.45, 0.58, 0.53, 0.381.38, 0.58, 0.53, 0.38⑷최종적으로 얻어진 restriction map=>검토를 마치고 최종적으로 얻어진 restriction map은 다음과 같다.=>각 fragment의 단위는 kbp이다.5. Discussion⑴오차의 요인=>이번 실험에서는 EcoRⅠ로 잘랐을때는 3.0의 크기를 가지나, map을 만들고 나서 전체 크기를 구해보니 2.87로 약간의 차이가 나타났다. 이는 각 ladder를 포토샵 작업을 통해 눈금을 맞추어 크기를 알아내는 과정에 있어서 직접 그래프 등을 이용한 계산을 한 것이 아닌, ladder의 위치를 눈대중으로 맞추어 크기를 측정한 것이므로 정확한 값이 아니다. 그리고 이 mapping과정에서 중요한 것은 어떤 두 값을 더하였을 때

자연과학| 2009.05.01| 10페이지| 3,000원| 조회(482)

plasmid, Restriction, viral DNA, Action, end..

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Measurement of vitamin C in biological samples using DNS

1. 비타민 C의 성질에 대한 조사⑴비타민 C(L-ascorbic acid)의 분자구조⑵항산화제로서의 비타민 C①자기 스스로 산화됨으로써 다른 물질의 산화를 막아주는 역할을 한다.②비타민 C는 몸속에서 항산화제(antioxidant)로 작용하는데, 항산화제는 신체를 자유라디칼(free radicals)라 불리는 유해산소입자(harmful oxygen particle)로부터 보호하는 구실을 한다.③마른상태에서는 매우 안정적이지만 용액 속에서는 매우 불안정하여 쉽사리 산화가 되어 버린다.---> 조리과정에서 손실되기 쉽다.⑶천연의 비타민 C와 합성의 비타민 C에 대한 비교=>천연의 비타민 C와 합성의 비타민 C 모두 L-ascorbic acid이다. 화학적으로나 생물학적으로 차이점은 없다.⑷Vitamin C가 부족했을 때 생길 수 있는 질병- loose teeth : 치아의 손실- superficial bleeding : 표면상의 출현--->최악의 경우 괴혈병(scurvy)로서 사망할 수 있다.- fragility of blood vessels- poor healing- compromised immunity : 면역반응이 제대로 발휘되지 못함- mild anemia : 빈혈, 무기력증⑸하루에 필요한, 즉 권장되는 비타민 C의 하루 섭취량- 40 mg per day UK Food Standards Agency- 60?95 mg per day US Food and Nutrition Board 2001 revision⑹비타민 C를 정량하는 방법①NBS를 이용한 정량법=>NBS란, N-bromosuccinimide의 약자로, 알릴성 및 벤질성 자리를 선택적으로 브롬화하는 시약이다. 이 시약과의 반응을 이용하여 비타민 C의 양을 정량할 수 있다.②dye를 이용하는 방법=>위의 반응식에 나타난 것처럼, dye를 이용하여 적정하는 방법이 있다.=>비타민 C는 강력한 환원제이고, 실험에서 사용하는 dye는 원래는 rose pink빛에서 환원되었을 때 무색으로 변하기 때문에 산화mance Liquid Chromatography)=>위의 방법들은 분석하고자 하는 물질이 다른 물질들과 섞여 있는 상태에서 분석물질에만 적용되는 반응(specific reaction)을 이용하는 방법이다. 이러한 방법에서는 다른 물질에 의한 방해(interference)가 문제의 소지로 남는다.=>요즘 간단한 유기화합물에 많이 사용되는 분리 방법에는 HPLC(high performance liquid chromatography)가 있다. HPLC에서는 분리의 선택성과 검출의 선택성이 조합되어 원하는 물질만을 분석할 수 있게 된다.=>Vitamin C의 분석에는 reversed phase chromatographic column과 UV absorption의 조합을 사용할 수 있다. 그러나 vitamin C가 약산인 점을 이용해서 약산의 분리에 유리한 ion exclusion column을 분리에 사용하고, UV absorption은 범용 검출기인데 비해 걸어준 전위차에서 산화가 되는 화학종 만을 선택적으로 잡아내는 electrochemical detector를 사용하면 복잡한 식품 시료에서도 vitamin C를 높은 감도로 분석할 수 있게 된다. 아래의 예에서는 ion exclusion chromatography-electrochemical detection (+0.6 V vs. Ag/AgCl 전극) 방법으로 vitamin C와 갈색 반응을 방지하기 위해서 넣어준 sulfite를 동시에 분석할 수 있음을 볼 수 있다.2. DNS(3,5-dinitrosalicylic acid)에 대한 조사 - Properties of DNS=>2-Hydroxy-3,5-dinitrobenzoic Acid 또는 3,5-Dinitro-2-hydroxybenzoic Acid라고도 함.①분자식 :②분자량 : 228.12 // CAS # : 609-99-4③형태 : solid로서 존재함④Melting point : 169 ~ 172℃⑤안정성(stability)=>안정하나, 강한 산화제(obic acid)를 DNS와 반응시키면, ascorbic acid는 산화되어 dehydroascorbic acid를 형성하고, DNS는 환원되어 3-amino-5-nitrosalicylate를 형성할 것이다. 이렇게 되면 UV-vis spectrum에서 540nm의 영역의 빛을 흡수할 것이므로 이 흡수의 정도를 absorbance 측정으로 알아낼 수 있다. 결과적으로 이 data에서 비타민C가 얼마나 sample에 포함되어 있는지를 beer-lambert law를 이용하여 계산할 수 있다.4. Reference- Modern Experimental Biochemistry, 3rd ed., Rodney Boyer.- Merck index, 12th ed., CambridgeSoft.- Biochemistry, 5th ed., Stryer, Berg, Tymoczko, Freeman publishing- http://en.wikipedia.org/wiki/Vitamin_C- http://www.sciencelab.com/page/S/PVAR/23051/SLD2275- http://www.lsbu.ac.uk/biology/enzyme/practical1.html- http://ptcl.chem.ox.ac.uk/MSDS/DI/3,5-dinitrosalicylic_acid.html- http://membres.lycos.fr/jjww/page231.htm1. Introduction⑴실험 제목 : Measurement of vitamin C in biological samples⑵실험 목적 : 제조된 sample 내의 vitamin C를 정량하고, 미지의 sample 내의 vitamin C의 양을 알아낸다.⑶실험의 원리①DNS는 다음과 같은 반응을 일으킬 수 있다.=>DNS는 환원된 형태의 분자와 반응하여 그 분자를 산화시키고 3-amino-5-nitrosalicylate를 형성한다. 이는 UV-vis spectrum에서 540nm의 영역의 빛을 흡수한다.②비타민 C는 id- 3,5-dinitrosalicylic acid- potassium phosphate buffer- (ascorbic acid oxidase)- heat block- potassium sodium tartrate 40% solution- spectrophotometer- cuvette⑵실험 과정①ascorbic acid로 standard solution을 준비한다.=>ascorbic acid를 사용하여 0, 10, 20, 30, 40(mg/ml)의 다섯 가지 농도의 용액을 제조하여 standard solution을 준비한다.②e-tube에 각각 standard solution을 50㎕씩 transfer한다.③sample이 담긴 e-tube에 모두 450㎕의 potassium phosphate buffer를 첨가한다.④총 500㎕인 sample(standard)를 test tube로 옮기고 여기에 1ml의 DNS를 첨가한다.⑤heat block을 이용하여 90℃에서 5분간 incubation한다.⑥반응시킨 용액을 잘 섞은 후, 1ml를 새 tube에 옮긴다.⑦각 tube에 potassium sodium tartrate 40% solution을 넣는다.=>potassium sodium tartrate solution은 stop solution으로서, ascorbic acid와 DNS간의 더 이상의 반응을 막아준다.⑧spectrophotometer에서 563nmso의 흡광도를 측정한다.⑨위의 결과에서 standard curve를 얻는다.⑩조교님이 준비하신 미지 농도의 ascorbic acid 용액을 위의 ②~⑧까지의 과정을 반복하여 흡광도를 얻어낸 후, standard curve에서 미지 용액의 농도를 알아낸다.3. Results⑴standard and sample OD values①standard OD values농도(mg/ml)010203040OD values00.1560.2940.3790.507②Sample OD values#12345OD values0.fitting과정에 있어서 데이터값에서 (-)값이 발생되는 것을 방지하기위해서 최소값을 0으로 잡는, 즉 원점을 통과하는 직선으로 fitting하였다. 그 결과 원점을 통과하지 않고 fitting된 값과 약간의 차이를 더 나타내었다. 아무래도 원점통과라는 하나의 limit를 설정함에 따라 각 데이터값의 근사가 좀더 어려워진 것(근사가 덜 됨)이 아닌가 싶다.②DNS와 ascorbic acid의 반응에 있어서의 과정=>이 과정은 90℃의 heat block에서 5분간 반응시키는 것으로 진행되었다. 이상적으로는 모든 sample이 동시에 heat block에 적용되고 5분 후 동시에 적용이 해제되어야 한다. 그러나 현실적으로 그것이 불가능하므로 heat block이 sample에 적용되는데에 각 sample마다 5~10초 정도의 차이가 생기게 되었다. 그 영향의 정도는 미미하더라도 이에 따른 오차는 존재할 것으로 생각된다.③ascorbic acid의 변형=>ascorbic acid는 열이나 빛으로도 변형이 될 정도로 불안정한 분자이다. 실험에서 ascorbic acid는 은박지로 싸여져 빛을 차단하는 등의 조치가 취해지지 않았으므로 실험실의 광원에서 발생된 빛에 의해 변형되었을 가능성도 존재한다.④실험상의 실수=>이번 실험은 전 과정을 우리들이 직접 실험하였다. 이에 따라 마이크로피펫 조작에 대한 미숙함, 농도계산에 있어서의 실수, 농도 제조에 있어서의 실수, transfer 과정에서의 용액의 잔류 등의 실수가 범해질 수 있다. 실제로 이번 실험에 있어서 같은 실험을 2번하였는데, 첫 번째 시도에서 농도가 제대로 맞지 않아 standard curve가 틀렸기 때문이다. 만약 standard curve가 실험상의 미숙함에 의해 틀렸다면, 모든 결과값은 잘못된 것일 것이다.⑵DNS 사용시의 주의할 점①DNS는 실제로 굉장히 corrosive한 물질로서, 흡입하거나 삼켰을 때 굉장히 harmful하다. Eye, skin에 접촉시 이를 burn하고, respiratory 있다.

경영/경제| 2009.05.01| 10페이지| 3,000원| 조회(657)

DNS, Vitamin C, Measurement, dinitrosalicyl..

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$Isolation, subfractionation, and enzymatic analysis of beef heart mitochondria$

Isolation, subfractionation, and enzymatic analysis of beef heart mitochondria

1. 실험제목 : Isolation, subfractionation, and enzymatic analysis of beef heart mitochondria2. 실험목적 : beef heart muscle에서 mitochondrial fraction을 분리하고 protein content에 대해서 분석하며, 각각을 submitochondrial particle로 fractionate하여 malate dehydrogenase & monoamine oxidase activity에 대해 분석한다.3. Introduction & Content⑴Mitochondria의 구조①double membrane : smooth outer membrane(permeable), inner membrane(unique transport & protein, enzyme 존재)②intermembrane space, matrix : 각각 다른 생물학적 기능을 나타냄⑵mitochondria의 기능=> aerobic (oxygen dependent) metabolism of the cell에 관여한다.①cristae에 존재하는 효소들은 citric acid cycle, respiratory chain, and beta fatty acid oxidation에 필요한 효소들이다.②독립적인 DNA를 가지고 있어 protein enzyme에 필요한 mRNA 합성이 가능하다.⑶intact mitochondria의 분리=>크기가 크기 때문에 분리하는데 유리하다. 주로 쓰는 방법은 differential centrifugation of homogenized tissue이다.--->mitochondrial fraction(major compartments), lysosomes, cell fragments, nuclear fragments, microbodies(peroxisomes)로 분리되며, 다음과 같은 순서로 mitochondrial fraction을 준비한다.①적절한 biological materhondria의 Subfractionation=>enzyme profile or enzyme activity pattern(with marker enzyme)으로 각각 네 개의 major region(외막, 내막 matrix, intermembrane space)를 연구한다.①submitochondrial particle(SMPs)를 준비한다.=>sonication과 centrifuge로 만들어짐. 12000~100000g 사이의 sediments들을 SMP fraction으로 정의한다.②위의 과정에서 membrane들은 뒤집히며(inside-out), matrix enzyme은 제거된다. 그러나 electron transport components는 남아있다.⑸mitochondria와 SMPs의 characterization①malate dehydrogenase : matrix enzyme에 대한 markermalate +? oxaloacetate + NADH +=>intact mitochondria에서는 activity가 나타날 것으로 예상되나, SMPs에서는 나타나지 않을 것으로 예상됨 : spectrophotometric assay로 알아낸다(at 340nm-oxaloacetate, NADH),②monoamine oxidase(MAO) : outer membrane의 marker, SMP에서 내막에 의해서도 activity가 예상됨.+? RCHO ++=>benzylamine을 substrate로 이용하여 benzaldehyde 형성을 250nm에서 관찰하는 것으로 assay한다.⑸Centrifuge에 대하여=>원운동을 하고 있는 물체를 center로부터 멀어지게 하는, 관성에 의한 가상적인 힘에 의해 나타나는 힘을 centrifugal force라고 한다.∴centrifugal force := =(: 바깥쪽으로의 반지름)①Relative centrifugal force(RCF)=>gravitational force에 대해 환산하여 나타낸 centrifume, p는 medium의 density, f는 frictional coefficient(shape의 측정)이다.=>sedimentation coefficient는 주로 Svedberg units(S :)로 나타내지며, S가 작을수록 centrifugal field에서 느리게 움직인다.4. Reference- Modern Experimental Biochemistry, 3rd ed., Rodney Boyer.- Merck index, 12th ed., CambridgeSoft.- Biochemistry, 5th ed., Stryer, Berg, Tymoczko, Freeman publishing- http://www.elmhurst.edu/~chm/vchembook/591cellstruct.html- http://www.medal.org/visitor/www%5CActive%5Cch41%5Cch41.01%5Cch41.01.01.aspx- http://library.thinkquest.org/20991/gather/formula/data/189.html1. Introduction⑴실험 제목 : Isolation, subfractionation, and enzymatic analysis of beef heart mitochondria⑵실험 목적 : beef heart muscle에서 mitochondrial fraction을 분리하고 protein content에 대해서 분석하며, 각각을 submitochondrial particle로 fractionate하여 malate dehydrogenase & monoamine oxidase activity에 대해 분석한다.2. Materials & Procedure⑴시약 및 초자①Preparation of the mitochondrial fraction- Beef heart 50g- Sharp knife, Chopping board- Hand blender (PHILIPS) and Meat grinder- Cottonclis base solution, pH 10.8, 15ml- Beaker, Conical tubes, Centrifuge Tubes, Stirring rod②Measurement of Malate dehydrogenase- Mitochondrial fraction from Part ①(A)- Phosphate buffer, 0.2M, pH 7.4- Oxaloacetic acid, 0.006M in phosphate buffer- NADH, 0.0375M in phosphate buffer (10X)- Spectrophotometer- Cuvettes⑵실험 과정①ice-cold beef heart 50g을 빠르게 무게를 잰다.=>지방, connecting tissue는 제거하며, 보관 시에는 -80℃에서 fixation시킨다.②pre-chilled meat grinder로 beef heart를 잘게 썬다.③잘게 썬 tissue를 100ml ice-cold homogenizing solution에 suspend 시킨다.④2M Tris로 pH를 7.5로 맞춘다.⑤갈아진 heart를 무명천에 붓고 이것을 짜서 sucrose solution을 제거한다.⑥걸러진 heart의 덩어리들을 다시 100ml ice-cold isolation solution에 넣고 2M Tris base를 넣어서 pH를 맞춘다.=>isolation solution은 EDTA 등을 함유한 용액으로서, cell lysis를 수행한다.⑦blender를 이용하여 tissue를 homogenize시킨다.⑧pH가 변했을 수 있으므로, 2M Tris base를 사용하여 pH를 7.8로 유지시킨다.⑨얻어진 homogenate를 1200× g로 15분 동안 centrifuge시킨다.=>centrifuge할 때 균형을 맞추기 위해 50ml씩 두개의 parts를 재서 centrifuge 시킨다.⑩centrifuge된 결과물을 밑의 pellet이 풀어져서 섞이지 않도록 조심하면서 위쪽의 supernatant를 얻는다.on을 사용하여 다음과 같은 reagent의 조성을 가진 tube1에 섞어서 background을 잡고, tube2에 넣어서 340nm에서 5분 동안 absorbance를 측정한 후 plot한다.ReagentsTube1Tube20.2M phosphate, pH 7.4650λ650λ0.0375M NADH (10X)-10λOxaloacetic acid solution50λ50λdW750λ740λ3. Result : Tube2에서의 absorbance에 대한 plotting graph4. 결과 분석 및 해석⑴plotting된 graph에 대한 해석=>흡광도 변화의 관찰에서 1분이 지난 후에는 더 이상의 변화는 관찰되지 않았다.malate +? oxaloacetate + NADH +이 흡광도의 변화는 위의 반응에서 NADH의 양에 의해 결정된다. NADH는 340nm에서 UV를 강하게 흡수하지만는 그렇지 못하다. 그러므로, 흡광도가 점점 감소한다는 뜻은 malate +가 점점 형성되고 oxaloacetate + NADH +가 점점 감소한다는 것이다. oxaloacetate + NADH +이 점점 감소하고 malate +이 점점 형성된다는 것은 이 반응을 촉매화하는 어떤 요인이 있다는 뜻이고, 이는 Tube2에 넣어준 mitochondrial fraction의 어떤 구성성분에 의해 이루어졌음을 알 수 있다. 즉, Malate dehydrogenase에 의해 위와 같은 흡광도 변화가 형성됐음을 알 수 있다.∴우리가 beef heart에서 추출한 물질에는 Malate dehydrogenase이 포함되어있다.⑵Malate dehydrogenase의 specific activity 계산하기=>흡광도가 시간에 따라 변화하는 그래프에서, 흡광도와 시간(sec)이 y=ax+b 형태의 직선의 방정식 형태로 나타나는 부분이 있다. 이 부분에서/min을 구할 수 있다.①Red 직선의 방정식∴--->/sec은 -0.0087이다. 1 sec : -0.0087= 60sec :이므로,는 -0.?

자연과학| 2009.05.01| 7페이지| 3,000원| 조회(429)

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Activity & Thermal stability of gel-immobilized peroxidase

1. Enzyme immobilization의 목적과 방법⑴Enzyme immobilization이란?①enzyme의 catalytic activity는 그대로 가지면서 movement(or free diffusion) of the enzyme는 공간상에서 severely restricted를 시키는 process를 뜻한다.②Enzyme immobilization는 continuous use와 reuse of the catalyst를 가능케 한다.⑵Enzyme immobilization의 목적=>enzyme은 높은 촉매력과 많은 반응으로의 적용성, stereo-specific reaction에 대한 특이성, 낮은 부반응 발생 가능성의 장점들을 가지나 반면에, 적은 양으로밖에 얻지 못하고 불안정한 분자구조를 가지며 상업적 관점에서 보았을 때 가격이 비싼 단점을 가지고 있다. 그러므로, enzyme을 실제 상업적으로 사용하기 위해서는 이들의 stability가 증가하여야 하며 한번 사용하고 다시 사용될 수 있는, 즉 recycling이 가능하여야 한다. 이 recovery를 위해서 제창된 것이 enzyme immobilization인 것이다.⑶Enzyme immobilization의 장점①이들은 insoluble form으로 존재하기 때문에, reaction mixture에서 분리가 가능하고 product에 의해 오염되지 않는다.=> if the enzymes are in solution with the reactants and/or products it is difficult to separate them. Therefore, if they can be attached to the reactor in some way, they can be used again after the products have been removed.②immobilized된 enzyme은 열, pH 변화, 유기용매, 그리고 다른 여러 불리한 조건에서 free한 form에 비해 더 큰 안정다(enzyme의 conformational change 또는 destruction of its active center가 거의 없다)- suitable carrier을 찾으면, 이 방법은 간단하면서도 값싸다.- 단, weak bond로 attach되어 있으므로, changes in temperature, pH, ionic strength or even the mere presence of substrate의 영향에 의해 desorption of the protein이 나타날 수 있다.- 또한 다른 protein이나 substance들이 non-specific하게 adsorption될 수 있다.②insoluble polymeric support로의 chemical covalent attachment=>the formation of covalent bonds between the enzyme and the support matrix을 이용하는 방법이다. 다음과 같은 반응들에 의해 형성될 수 있다.=>As with cross-linking, covalent bonding should provide stable, immobilized enzyme derivatives that do not leach(스며나오다) enzyme into the surrounding solution. The wide variety of binding reactions and insoluble carriers (with functional groups capable of covalent coupling or being activated to give such groups) makes this a generally applicable method of immobilization.=>intermolecular cross-linking of the protein(other protein molecules 또는 functional groups on an insoluble support matrix작용기의 존재 유무에 기인하므로 많은 종류의 화합물이 UV-Vis영역에서 빛을 흡수하지 못한다. 일반적으로 이중결합이나 삼중결합 등의 불포화 결합을 포함하고 있는 화합물은 UV-Vis 영역에서 빛을 흡수하며, 불포화 결합을 포함하고 있는 작용기(functional group)를 발색단(chromophore)이라 한다.=>이러한 빛의 흡수는 매우 선택적이어서 서로 다른 발색단은 서로 다른 파장에서 최대 흡광 피크를 나타내며 흡수하는 빛의 양에도 차이가 있다. 따라서 특정한 발색단은 시료 중에서 특정성분을 확인할 수 있는 열쇠가 되기도 한다. 흡수되는 모든 에너지는 양자화되어 있고, 전자전이는 분자 내의 다른 전이(진동전이, 회전전이)에 의해 영향을 받으므로 UV-Vis 영역에서의 흡광밴드는 넓게 나타나게 되는데 이러한 현상은 작용기를 확인하는데 제한이 된다. 하지만 정량분석의 경우에는 이러한 전자전이가 분자구조와 밀접한 관계를 가지므로 중요한 역할을 한다. 즉, UV-Vis Spectrophotometer는 미지물질을 정성확인하는데는 좋은 방법이 될 수 없으나, 기지의 물질인 경우에는 그 농도를 정확하게 알 수 있는 방법이다.=>빛이 어떤 물질을 통과하게 되면 반사, 굴절, 산란 또는 흡수 등에 의해 그 세기가 변하게 되며, 흡수된 빛의 양은 시료에 가해준 빛의 세기 대 시료를 통과하여 나온 빛의 세기와의 비율로 표시한다. 흡수되는 빛의 양은 시료 중의 흡광화합물의 농도와 광경로(light pass length)에 비례한다.=>Beer는 시료에 가해준 빛에너지의 감소율은 흡광물질의 농도에 비례함을 증명하였고, Lambert는 농도가 일정할 때의 흡광도는 광경로의 길이에 비례한다고 발표하였다. 이 두가지 원리를 합하여 Beer-Lambert 공식이 제시되었으며, 이 공식은 분광광도계를 이용한측정에서 정량계산의 기초가 된다.①전자가 에너지를 받으면 ground state에서 excited state로 transition이 일어난다. ground state와 exci/analysis/method_analysis.htmhttp://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/phts/phts.htmhttp://user.dankook.ac.kr/~enerdine/uv.htmhttp://lotus.pwu.ac.kr/~shkim/story/uv.htmhttp://bouman.chem.georgetown.edu/S00/handout/spectrometer.htm1. Introduction⑴실험 제목 : Activity of Gel-Immobilized Peroxidase⑵실험 목적 : Enzyme을 Gel immobilization을 이용하여 immobilized 시킨 후, immobilized enzyme의 activity를 측정한다.2. Materials & Procedure⑴시약 및 초자- Potassium phosphate buffer, 0.2M, pH 7.0- Reagents for gel preparation : A (30%-29:1-acrylamide/methylene bisacrylamide solution), B (10% ammonium persulfate solution : 10% APS), C (N,N,N`,N`-tetramethyl-ethylenediamine : TEMED)- Horseradish peroxidase in DDW- 4-aminoantipyrine-phenol solution(In 50㎖ of DDW, 810mg phenol and 25mg 4-aminoantipyrine were dissolved)- Hydrogen peroxidase, 0.0017M in water : A(1/100 diluted 30% hydrogen peroxide with DDW), B(1/50 diluted A solution with 0.2 phosphate buffer, pH 7.0)⑵실험 과정⑴immobilized peroxidase의 준비①3.25㎖ potassium phosphate buffer510nm에서의 absorbance를 읽는다.3. Result⑴각 point에서의 absorbancezero point3min point0.1g0.13100.2g0.0420.1170.3g0.0340.138⑵효소의 활성의 정도=>28㎖ 5000 units의 enzyme을 묽혀서 178 unit/㎖로 만들었다. 실험에서는 peroxidase solution 0.5㎖로 넣어주었으므로, 89 unit/ 0.5 ㎖ 의 활성을 가지고 있다.∴immobilized enzyme의 activity : 89 unist/ 0.5 ㎖⑶immobilized enzyme을 포함한 gel의 전체 무게 : 10(g)4. 결과 분석 및 해석⑴The activity of the immobilized peroxidase=>이 activity는 absorbance의 변화로 계산될 수 있다.(: absorbance의 전체 변화,: 510nm에서 3min point의 absorbance,: 510nm에서 zero point의 absorbance)zero point3min point/min0.1g0.1310-0.131-0.0460.2g0.0420.1170.0750.0250.3g0.0340.1380.1040.0347∴parametererrorA0.03823B=>데이터값이 fitting된 직선과 정확히 들어맞지는 않으나 그 경향성으로 볼 때, enzyme의 양과 absorbance가 어느 정도 비례의 관계를 가지고 있음을 알 수 있다.⑵the units of activity per mg of gel 계산하기=>the units of activity per mg of gel은 다음 식을 이용한다.Units/mg =①위의 식을 이용하여 계산된 Units/mg의 값mg of gel/minUnits/mg100-0.0462000.0253000.0347②차이가 심하게 나는 첫 번째 Units/mg값()을 제외한 나머지 두 값(,)의 평균을 구한 후, 여기에 gel을 부수기 전의 전체 무게를 곱함으로써, 이 gel 다.

자연과학| 2009.05.01| 12페이지| 3,000원| 조회(544)

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