Abstract이번 실험은 Protein분리의 원리와 방법을 알아보는 실험으로 많은 단백질 분리방법 중 gel chromatography를 이용하여 분리하는 실험이었다. 실험에서는 Lysozyme 과-globulin Protein mixture를 protein mixture로 사용하였고 resin은 sephacryl 200(5~250kDa분리범위)과 sephadex G-100(4~150kDa분리범위)를 사용하였다. buffer로는 sodium phosphate buffer(0.1M pH7)을 사용하였다.Buffer를 이용해 resin washing 후 protein mixture를 loading 하고 다시 buffer를 가해 일정한 압력을 유지시켜 준 후 void volume 만큼의 buffer를 제거하고 나서(5ml - protein이 column을 통과하기 전이기 때문에 protein fraction이 존재하지 않기 때문에 측정할 필요가 없다) 1번부터 60번까지 총 60개의 e-tube에 column을 통과한protein fraction을 9방울(약 0.5ml)씩 받는다.fraction을 받는 동안 column에 채워지는 buffer의 양을 일정하게 맞춰주기 위해서 계속 buffer를 가해줘야 하는데 이 이유는 protein들이 column을 통과하는 중에 받게 되는 압력을 일정하게 해주어 일정한 속도로 내려올 수 있게 하기 위함과 resin이 마르는 것을 방지하기 위함이었다. 이렇게 60개의 e-tube에 받은 fraction을 spectrophotometer를 이용해 280nm에서 흡광도를 측정했는데 그 이유는 protein이 가장 흡광률이 좋을 때가 280nm 이기 때문이다.이번 실험에서 우리조의 측정결과는 14번째 e-tube 에서는 peak를 나타냈지만 그 이후의 peak를 찾지 못했다. 48번 e-tube 이후 계속 O.D.값이 올라가는 결과가 나왔기 때문이었다. 하지만 우리와 같은 실험을 한 다른 조와의 결과값을 비교해 55번 e-tube에서이것은 용질이 컬럼을 통해 느리게 이동함을 보여준다. 즉 다른 K 값을 갖는 물질들은 컬럼을 통해 이동하는 속도가 다름으로 쉽게 분리가 이루어 진다.분배이론은 정지상인 흡착제와 용매로 채워진 컬럼의 작동에 의해서 쉽게 설명된다. 용질을 포함한 용액은 흡착제 위에 놓여지고 흡착제 안으로 들어갈 수 있다. 그 다음 용매는 컬럼을 통해 연속으로 흘러간다. 비록 흡착제와 용매가 컬럼의 꼭대기부터 바닥까지 연속적일지라도 컬럼은 두 상을 포함한 많은 수의 각 층(이론적인 층)으로 구성되어 있다고 생각할 수 있다.18 개의 이론적인 판을 갖는 컬럼의 정지상과 이동상에 고루게 분포하는 256 개의 분자를 생각해보자 가장 위의 판에는 각 상에 128 개의 분자들이 각각 분포하게 될 것이다. 그 다음 두 번째 판으로 들어가게 되고 두 상에 64 개씩 고루게 분포하게 된다. 이동상이 이동함에 따라 계속적인 재분배가 일어나게 되고 16 번의 이동 후 그림 3-1과 같이 나타난다겔 크로마토그래피 (gel chromatography)겔 크로마토그래피는 겔 여과(gel filtration) 또는 겔 침투(gel permeation) 크로마토그래피라고한다. 겔 여과 크로마토그래피(이동상은 물)라는 명칭은 생화학자들에 의해 사용되며, 겔 침투 크로마토그래피(이동상은 유기용매)라는 명칭은 고분자화학자가 사용한다. 겔 크로마토그래피는 정지상에 분자체(molecular sieve)를 사용하는데 이들은 세파덱스(Sephadex), 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 또는 아가로오스(agarose) 겔로서 친수성이므로 물을 흡수할 수 있고 팽윤된다.시료 분자의 크기가 팽윤된 겔의 최대 구멍(pore)보다 클 때는, 그 분자는 겔 입자를 통과하지 못하므로 정지상 입자의 공간을 통해서 컬럼 밖으로 나온다. 보다 작은 분자는 겔 입자의 열린 구멍 속에 들어가나 그 크기와 모양에 따라서 통과하는 속도가 다르다. 그러므로 분자의 크기가 감소하는 순서로 용출된다.겔 크로마토그래피에서 겔 베드(gel을 흡수한다. 겔은 그들이 물을 재흡수하여 팽윤하는 능력에 따라서 특성을 나타낸다. 세파덱스 유형의 번호는 물의 재흡수값에 관계된 것이다. 이와 같이 세파덱스 G-10는 마른 겔 1 g당 1 ml의 물을 흡수하며, 세파덱스 G-200은 g당 약 20 ml의 물을 흡수한다. 이들 겔은 물에 녹지 않으며 약한 산화제, 환원제, 약한 염기에 대해서 안정하다.구분메쉬(mesh)입자직경a (μ)분획 범위(MW)물의 재흡수(ml/g dry gel)겔 부피(ml/g dry gel)Sephadex G-1040 - 1207001.0 ± 0.12 - 3Sephadex G-1540 - 1201,5001.5 ± 0.22.5 - 3.5Sephadex G-25Coarse100 - 3001,000 - 5,0002.5 ± 0.24 - 6Medium50 - 150Fine20 - 80Superfine10 - 40Sephadex G-50Coarse100 - 3001,500 - 30,0005.0 ± 0.39 - 11Medium50 - 150Fine20 - 80Superfine10 - 40Sephadex G-7540 - 1203,000 - 70,0007.5 ± 0.512 - 15Superfine10 - 40Sephadex G-10040 - 1204,000 - 150,00010 ± 1.015 - 20Superfine10 - 40Sephadex G-15040 - 1205,000 - 400,00015 ± 1.520 - 30Superfine10 - 40Sephadex G-20040 - 1205,000 - 800,00020 ± 2.030 - 40Superfine10 - 40a 건조입자직경바이오-겔 P(Bio-Gel P)는 보다 화학적으로 불활성한 분자체 겔(molecular-sieve gel)이고 아크릴아미드 중합물이다. 물에 녹지 않으며, 보통의 유기 용매에도 녹지 않는다. pH 2 - 11의 범위에서 사용되며 흡착성은 세파덱스와 다르므로 극성물질의 분리 거동도 다르다.또한 아가로오스겔로서 Phamacition 에 0.5ml의 buffer를 넣어주어 1ml로 맞춘다. spectrophotometer를 이용하여 280nm에서 각 fraction의 흡광도를 측정한다.Data & Result1)O.D.값의 측정gel exclusion chromatography를 시작하기 전 column의 void volume 5ml를 고려하여 처음 column을 통과한 5ml의 용액은 배제하고 측정을 하였다.또한 가장 처음 받은 e-tube의 O.D.값을 control로 하여 0으로 놓고 측정하였다.tube numO.D.tube numO.D.tube numO.D.tube numO.D.tube numO.D.tube numO.D.10110.043210.031310.023410.044510.14520.004120.050220.025320.025420.047520.15630.001130.058230.019330.027430.057530.16940.004140.159240.019340.028440.066540.17950.001150.117250.020350.032450.061550.18960.001160.105260.021360.029460.075560.18370.006170.033270.020370.033470.086570.17980.006180.067280.020380.040480.054580.23290.013190.049290.022390.036490.108590.209100.021200.043300.023400.040500.125600.225table 3-2를 graph화 한 figure 3-5를 보면 1개의 peak를 발견할 수 있는데 이는 원래 실험에서 2개의 peak를 발견해야 하는 이론상의 결과와는 차이가 있어 실험오차로 추정이 되고, 타 조와의 실험데이터 비교 결과 14번째(옳게 나온 앞의 peak)와 55번째에서 peak가 발견이 된다. 따라서 우리는 분자량의 크기가 작은 protein(Lysozyme)이 14번째(A)튜브에 나와있고, 분자량의 크기가 큰 protein(에 녹지 않으며 약한 산화제, 환원제, 약한 염기에 대해서 안정하다 column 또한 density에 따라서 단백질을 분리하는 데에 걸리는 시간이 달랐는데 우리 조가 실험한 column은 density가 높아서 gradient pump를 사용하여 압력을 가해 분리하였다. 먼저 buffer를 흘려주어 resin washing을 해준다. buffer는 column 내의 resins에 nonspecific protein을 씻어주는 역할을 하며 실험하는 중에 계속 일정한 부피(column의 끝까지 채우도록)를 맞춰 loading 해 주는데 이는 resin이 마르지 않게 하는 기능과 함께 압력을 일정하게 해주는 역할도 한다. buffer를 resin이 packing된 곳까지 흘려보낸 뒤 protein mixture(우리 조 실험에서는 [-globulin(169kDa) 0.5mg and Lysozyme(14.4kDa)1mg]를 이용) 를 조심스럽게 loading해 주고 protein 이 resin에 스며들면 다시 buffer를 loading해주는데 이때 pipet을 이용해 조심해서 해주어야 resin이 흐트러지는 것을 막을 수 있었다. resin이 흐트러지면 안되는 이유는 protein이 resin의 틈으로 들어가는데 resin이 흐트러지면서 protein이 빠져나와 버리면 작은 분자의 protein도 큰 분자의 protein과 같이 내려올 수 있기 때문에 protein size 를 이용한 gel chromatography 를 제대로 수행할 수 없기 때문이다. 또한 resin의 윗부분이 평평하지 않으면 내부에서 받게 되는 압력이 달라져 부분에 따라 다른 속도로 protein 이 내려올 가능성이 생긴다. buffer를 loading 해주고 나서는 약 5ml를 conical tube 에 받는데 이는 void volume 으로 protein이 분리되어 내려오기 전 column 속에 남아있는 buffer의 양으로 sample이 분리되어 내려오지 않을 때의 부피이다. 따라서 궂이정한다.
Experiment1. Study of the properties of β-galactosidase이번 실험은 ONPG(O-nitrophenyl-β-galactoside)가 β-galactosidase를 이용하여 ONP(O-nitrophenyl)와 galactose 로 분해되는 과정을 통하여 효소의 반응속도와, 그와 연관된 Vmax(효소 촉매 반응의 최대속도), Km(Michaelis constant) 값을 이해하고, competitive inhibition을 넣어 효소 반응에 어떤 영향을 미치는지에 관해서 알아보기 위해 수행되었다.실험에서 기질은 ONPG(O-nitrophenyl-β-galactoside), 효소는 β-galactosidase, 저해제로는 lactose를 이용하였다. 실험은 ONPG의 농도를 다르게 한 5개의 시험관에 효소를 넣고 1분 간격으로 생성물의 농도(흡광도를 이용)를 측정하는 방식으로 진행하였다. 이 실험에서 β-galactosidase가 ONPG(O-nitrophenyl-β-galactoside)를 galactose와 ONP(O-nitrophenyl)로 분해하는데 이때 ONP는 pH7.7 알칼리 조건에서 이온화하며, 420nm에서 빛을 흡수하여 노란색의 발색작용을 한다. 이를 통해 ONP anion의 O.D. 값을 통해 시간당 생성물의 농도를 구해 효소반응 초기속도를 구한다. 이것을 Lineweaver-burk plot에 대입하여 Vmax 와 Km값을 알 수 있었다. 실제로 Michaelis - Menten equation을 사용하여 graph를 그린다고해도 Vmax값은 근사값으로밖에 구할 수 없기 때문에 기질농도 [S]와 반응속도 Vo에 역수를 취하여 Lineweaver - Burk plot을 이용하여 Km값과 Vmax값을 구하였다. lactose를 넣지 않았을때의 Km값은 0.000042M 이었고, Vmax는 0.0000890M/min 이었다. 저해제를 넣은 실험도 방식은 동일하였고, lactose를 넣었을 때의 Km값은 0.0ase에 의하여 galactose 와 O-nitrophenyl로(ONP)로 분해된다. 이 때 ONP가 노란색의 발색작용을 나타낸다. 이것을 420mn에서 흡광도를 측정하여 반응 정도를 파악할 수 있다.(단, alkaline solution 환경에서만 노란색을 나타낸다)Michaelis-Menten equationVo =Vo=반응초기속도, [S]=기질농도,Vmax=모든효소가 반응참가시 최대반응속도,Km= Vmax의 1/2에 도달하기 위해 필요한 기질의 양Michaelis-Menten 식은 기질농도[S]와 초기속도 Vo의 관계를 나타낸다. Figure1. 에서처럼 대부분의 효소들은 [S]와 Vo의 관계를 일반적인 곡선(rectangular hyperbola)으로 나타낼 수 있다. 메카엘리스 멘텐 식에서[S]는 기질농도, Vmax는 최고속도, Km은 미카엘리스 멘텐 상수를 나타낸다. Km 값은 효소에 따라 매우 다르며, 같은 효소라도 기질에 따라 다르다. 이 값은 때때로 효소의 기질에 대한 친화성의 지표로 사용되기도 한다.Lineweaver-Burk equation==+=미카엘리스 멘텐 식의 변환식이며, 1/Vo의 1/So에 대하여 플롯하면 곧은 직선을 얻을 수 있다. Lineweaver-Burk plot은 단순히 Vo를 [S]에 대하여 플롯하는 것으로는 근사값밖에 구할 수 없는 Vmax를 보다 정확하게 구할 수 있다.Enzyme InhibitionEnzyme inhibitor는 촉매를 방해하여 효소반응을 느리게 하거나 멈추게 하는 분자물질이다. 효소저해물질에는 가역적인 것과 비가역적인 것 2가지 유형이 있다. 가역적 저해는 크게 competitive inhibition, uncompetitive inhibition, mixed inhibition 으로 나뉜다. 이 중에서 실험에서 사용하는 lactose는 competitive inhibition 으로 저해물질이 활성자리에 결합을 하여 효소에 기질의 결합을 막는다. 경쟁적 저해물질은 흔히 기질과 비슷하며, 효소와 결555555조가 각각실험군을 설정(2.5mM ONPG의 양)해서 lactose의 유무에 따라 10개의 실험을 했다. 첫 번째 2.5mM ONPG, 0.1M sodium phosphate buffer(pH7.7)을 15ml conical tube(이하 시험관)에 넣고 30℃ water bath에서 5분간 pre-incubation한다. 그동안 시험관 6개에 1M sodium carbonate를 0.2ml넣어놓는다. Pre-incubation 한 시험관에 cell-extract 0.5ml를 넣어 흡광도 측정의 control로 사용한다. 첫 반응 시작 후 1분 간격으로 5분동안 시험관에서 0.8ml의 반응액을 취하여 0.2ml의 Na2CO3가 들어있는 e-tube로 옮겨 반응을 종결시킨다. 그리고 시험관에 남아있는 반응액은 30℃에서 20분이상 완전히 반응시킨다. 모든 반응이 끝난 후 spectrophotometer를 이용하여 420nm에서 흡광도를 측정한다. 두 번째 실험은 lactose를 첨가하는 실험이므로, 앞에서 실험한 것과 같은 조건을 맞추어 주고 0.1M sodium phosphate buffer의 양을 0.2ml 적게 넣고, 대신 lactose를 0.2ml첨가해주고 앞의 실험과 동일하게 진행한다. 마지막으로 cell extract는 냉동하여 보관한다.Data & Result1. lactose를 넣지 않았을 때1) O.D.값의 측정? lactose를 첨가하지 않았을 때의 시간에 따른 O.D.값LACTOSE가 없을때ABCDE1분0.0411.8980.0400.0100.0182분0.0501.9380.0500.0520.0423분0.0721.9600.0700.0880.0644분0.0871.9730.1020.1260.0725분0.1641.9750.1200.1560.151(시험관 A에는 2.5mM ONPG를 0.1ml, B는 0.2ml, C는 0.3ml, D는 0.4ml, E는 0.5ml 첨가)2) 농도의 측정A(O.D.) = ε·c·l에서ε = 3.73x(mM-1C면 ,시험관 A = 0.05mM시험관 B = 0.10mM시험관 C = 0.15mM시험관 D = 0.20mM시험관 E = 0.25mMABCDE[S] (단위 : mM)0.050.10.150.20.251/[S] (단위 : M)20000100006666.667500040001/Vo1*************08*************1/[S]와 1/Vo 를 Lineweaver-Burk plot에 대입해서 그래프를 그리면(, 기울기=,, y절편=)그러므로= 113120 , Vmax = 0.0000088 M/minKm=0.4719/113120 = 0.0000042 M? lactose를 첨가했을 때의 시간에 따른 O.D.값LACTOSE가 있을때ABCDE1분0.0040.1140.0130.0010.0122분0.0220.1280.0220.0070.0273분0.0250.1420.0350.0130.0584분0.0320.1460.0400.0300.0635분0.0340.1500.0800.0400.076(시험관 A에는 2.5mM ONPG를 0.1ml, B는 0.2ml, C는 0.3ml, D는 0.4ml, E는 0.5ml 첨가)2. 농도의 측정A(O.D.) = ε·c·l에서 ε = 3.73x(mM-1Cm-1) 이고, c=농도(M), l = 길이= 1(Cm)이고 희석률 = 0.8식에 대입LACTOSE가 있을때ABCDE1분0.00000130.00003820.00000440.00000030.00000402분0.00000740.00004290.00000740.00000230.00000903분0.00000840.00004760.00001170.00000440.00001944분0.00001070.00004890.00001340.00001010.00002115분0.00001140.00005030.00002680.00001340.0000255그래프로부터 구한 Vo (=M/min : 그래프의 직선의 기울기; 반응초기속도)시험관 A = 0.0000023 M/min 시험관 B = 0.0000030 M/min시시에 반응속도의 변화를 알아보는 실험이었다. 우리 조는 실험군 A(2.5mM ONPG 0.1ml)의 실험을 하였다.우리가 실험에서 사용한 β-galactosidase 는 ONPG(O-nitrophenyl-β-galactoside)를 galactose와 ONP(O-nitrophenyl) 로 분해하며, lactose를 galactose와 glucose로 가수분해하는 작용을 하는 효소이다. 실흠은 ONPG를 tube에 조별로 각각 다른 양을 넣고 sodium phosphate buffer의 양을 조절하여 총 5ml로 맞추었다. 1분씩 총 4번 흡광도를 측정하고 거기서 얻은 O.D.값을 product(ONP)농도로 바꾸어서 그래프를 그리고 그 그래프에서 기울기를 측정하여 시간에 따른 ONP농도를 얻었다. 첫 번째 실험에서 ONPG의 농도를 다르게 한 각 실험군의 O.D.값을 측정하였다.이 과정에서 각 조별로 진행한 O.D.값에서 2조(실험군B : 2.5mM ONPG 0.2ml)의 O.D.값이 두드러지게 높게 나왔는데 이는 0.2ml를 넣지 않고 2ml정도로 ONPG의 양을 잘못 측정해 넣었을 것으로 추정된다.[ONP]의 흡광도 A는 ε(extriction coefficient; 단위 : M-1Cm-1), c(molar concentration), ι(length; 단위 : Cm) 의 곱을 통해 구할 수 있다. ε값을 측정하기에 앞서 충분히 반응을 시키고 난 후 측정해야 한다. 이렇게 측정한 ε의 값은 ε=3.73x103 의 값이 나와서 ONP의 농도를 얻으면 된다. 그 전에 주의할 점은, 반응액을 고정하기 위해서 0.2ml씩 Na2CO3를 4번 넣어주었으므로 0.8ml의 희석률을 가지기 때문에값을 통해 계산하여 ONP농도를 구한다ONP농도를 얻은 후, 그 농도를 통해 농도에 따른 반응속도 또한 얻을 수 있었다. 이 농도에 따른 반응속도의 변화식이 Michaelis - Menten equation이다. Michaelis- Menten plot 은 일반적으로 hyperb
3.gel exclusion chromatography
KM, Vmax, ONP, ONPG, nitrophenyl
