GOT(Glutamate oxaloacetate transaminase/ AST; Aspartate Amino Transferase), GPT(Glutamate pyruvate transaminase/ ALT; Alanine Amino Transferase) 측정: Reitman-Frankle 법1. 목적 : 간기능 상태 판정 (functional biochemical test : 기능적 생화학적 검사방법)? GOT : 간, 심장, 근육등에 많이 존재하는데 이들 기관이 손상되면 혈액으로 이 효소가 많이 방출되어 혈액 중 활성도가 높아진다.? GPT : 간에 특히 많이 존재하며 간염, 간경변, 담관폐쇄 등으로 간이 손상되면 혈액으로 이 효소가 방출되어 혈액 중 활성도가 증가한다.2. 실험 원리GOTL-Aspartate + α-Ketoglutarate ---------> Oxaloacetate + Glutamic acid( Oxaloacetate는 곧 pyruvate로 변화된다 )GPTDL-Alanine + α-ketoglutarate ---------> Pyruvate + Glutamic acid위의 반응으로 생성된 pyruvate에 발색액( 2,4-Dinitrophenylhtdrazine )을 넣으면 hydrozone이 되고 여기에 0.4N-NaOH를 섞으면 등적색의 발색이 일어난다. 이 발색농도를 Karmen의 지정한 조건에서 작성된 표준검량선에 의하여 측정한다.3. 사용시약① GOT 측정용 기질액(α-ketoglutarate 30.7mg, L-aspartic acid 2.8g 함유)② GPT 측정용 기질액(α-ketoglutarate 30.7mg, DL-alanine 1.87g 함유)③ 발색액(2,4-dinitrophenylhydrazine 21mg 함유)④ 4N-NaOH( 증류수로 정확히 10배 희석하여 0.4N-NaOH로 만들어 사용 )⑤ 표준액(2mM Pyruvate, 리튬피루브산 2.24mg 함유)☞ 효소 단위의 정의Karmen이 지정하는 조건에 근거하여 혈청 1ml당의 단위로 나타내며 1단위는 25˚C, 파장 340nm에서 흡광도가 1분간에 0.001씩 감소하는 Transaminase 활성을 1단위/ml로 한다.4. 실험방법GOTGPTGOT 및 GPT 기질액GOT용 1.0 mlGPT용1.0 ml37℃ 항온수조에서 5분간 가온검사혈청0.2 ml0.2 ml37℃ 수조에서 작용혼합한 후 60 분혼합한 후 30 분발색액1.0 ml1.0 ml잘 혼합한 후 실온에서 20분간 방치0.4N-NaOH10.0 ml10.0 ml충분히 혼합후 실온에서 10분간 방치 후 증류수를 대조로하여 각각 흡광도를 읽는다. 사용파장 : 505 nm* 표준검량선 작성법시험관 번호12345기준액00.10.20.30.4기질액1.00.90.80.70.6증류수0.20.20.20.20.2발색액1.01.01.01.01.0실온에서 20분 방치0.4N-NaOH10.010.010.010.010.0GOT효소단위02461114190GPT효소단위02857971505. 측정상의 주의 사항① 0.4N-NaOH 채취용 10ml 피펫은 5초 이내에 분주할 수 있는 구멍이 큰 것을 사용한다② 혈청을 채취할 때는 정확도가 높은 micropipet을 사용③ 효소반응의 온도와 시간을 정확히④ GOT, GPT 효소는 적혈구 중에 혈청보다 높은 효소가 있으므로 용혈된 혈청은 사용하지 않는다.⑤ GOT, GPT를 동시에 측정할 때는 GOT를 반응시키기 시작한 뒤 GPT를 반응시켜 그 이후의 조작은 동시에 시행⑥ 효소 단위가 높은 혈청은 증류수로 5배 희석(0.1ml+증류수 0.4ml)하여 검사하고 결과에 5배를 곱해준다.⑦ 모든 시약은 2-5℃이 보존하고 0.4N NaOH는 실온에 보존6. 정상치 및 평가GOT 활성치GPT 활성치비고정상치8-40단위(unit)5-35단위경계치40-50단위35-45단위증가50단위 이상45단위 이상? GPT 흡광도 결과GPT 흡광도 1GPT 흡광도 1GPT 흡광도 평균실험자A 10.2500.2500.250실험자A 20.2500.2490.2495실험자B 10.2380.2380.238실험자B 20.2300.2300.230? GOT 흡광도 결과GPT 흡광도 1GPT 흡광도 1GPT 흡광도 평균실험자A 10.2420.2420.242실험자A 20.2430.2430.243실험자B 10.2530.2530.253실험자B 20.2580.2580.258? 이번 실험은 혈청내 GOT. GPT를 Reitman Frankel법으로 측정하는 것이다. 일반적으로 GOT. GPT 수치는 간 기능 검사에 중요한 항목이다. 혈청 GOT의 정상치는 8~40 Karmen 단위이며, 혈청 GPT는 5~30 Karmen 단위이다. 만약 실험값이 이 수치 값 안으로 나온다면 임상적으로 간 기능의 손상은 없다고 판단할 수 있다.실험에서 주의할 점은 혈청 sample 측정 전, 표준 곡선을 작성해야 한다. 이 표준곡선을 기준으로 sample의 흡광도에 따른 GOT, GPT 농도 값을 추정할 수 있다.GOT와 GPT의 흡광도에서 나온 값을 평균을 구하여 GOT와 GPT를 측정하기 위해 그래프에 그려본 결과 해당 표준곡선에 미치지 못하는 값을 보였다.이러한 실험의 오류가 나타난 요인으로는 첫 번째 피펫의 사용의 차이를 들 수 있다. 검사혈청을 넣을 시에 0.2ml를 사용한 조와 0.1ml를 두 번을 넣어 사용한 조가 있었다. 혈청의 농도가 정확한 값을 가지지 않아서라고 생각할 수도 있다.두 번째로는 혈청의 시료가 오래되었다는 것이다. 실험에 사용한 혈청은 헤모글로빈과 헤마토크릿을 측정할 때 뽑았던 시료이기 때문에 효소가 살아있지 않을 수 있다는 가정을 할 수 있다.세 번째로는 실험실안의 온도를 들 수 있다. 실험을 하는 날의 실내 온도가 많이 상승되어 있었다. 이 실험은 효소반응을 측정하는 것이기 때문에 온도를 유지시켜주는 것이 중요하다. 그러나 실험과정에서는 실내의 온도가 계속적으로 높게 유지되었기 때문에 효소가 작용하기 어려웠다는 가정을 해 볼 수 있다.네 번째로는 시료를 방치한 경우도 들 수 있다. 흡광도를 재기 위해서 또는 제시간에 시료를 첨가하기 위해서는 순서를 기다려야 했기 때문에 정확한 시간을 지키기 어려워 시료를 방치하였다가 시간이 지난 후에야 흡광도를 재거나 시료를 첨가하는 경우가 생겨 오차가 발생했을 수도 있다.다섯 번째로는 혈청시료 채취 과정에서의 오류를 생각할 수 있다. 12시간의 공복을 유지하고서 혈액을 채취하여야 하지만 그렇지 못한 사람들도 있었다. 그 결과 값의 오차가 발생하였을 수도 있다. 하지만 다섯 번째 요인에는 우리 조는 해당하지 않는다. 시료채취에 참여한 2명은 12시간의 공복을 지키고 참여를 하였기 때문이다.이번에 시행한 실험은 이러한 여러 가지 이유로 실험결과에 오류가 생겼을 것으로 생각된다.7. 각종 질환에 따른 GOT, GPT 변화- GOT, GPT의 임상적 중요성 :GOT는 간질환, 심장질환(심근경색)의 혈청 중에서 증가하며, GPT는 간질환(급성간염, 알콜성 간염, 간경변 등)일때 혈청중에서 증가함으로, 혈중의 GOT및, GPT는 간질환 및 심장질환 또는 근육질환의 진단에 이용된다. GOT, GPT는 세포중의 세포질에 존재하면서 만약 심장질환이나 간질환의 경우, 심근세포 및 간세포로부터 blood로 방출되기 때문에 혈중에 증가하며, 반대로 이들은 간세포, 심근세포에서는 감소한다.? 급성간염 :급성간염에서는 초기에 GOT와 GPT가 높은 활성치를 보인다. 특히 황달이 있으면 500∼3000 IU/L 정도가지 증가하고 황달이 없어도 100∼800 IU/L 정도 증가한다. 발병 초기에는 90%에서 GOT < GPT를 보인다.? 만성간염 :만성간염에서도 간기능 검사의 이상이 대부분 나타나나 임상상이나 조직 소견과는 비례하지 않는다. GOT, GPT도 정상치를 약간 상회하는 예부터 5∼10배 정도 상승하는 경우까지 개개인에 따라 다양하다. 간경변증, 간암에서는 500 IU/L를 넘는 일은 거의 없고 대개의 경우 GOT>GPT를 보인다. 간염인 경우 급성인가 만성인가 활동형인가 비활동형인가의 결정은 다른 검사 또는 조직검사를 종합하여 진단한다.? 전격성간염 :GOT, GPT 모두 1000 IU/L 이상 현저한 증가를 보인다. 또한 황달이 나타나고 부어있는 간이 갑자기 축소되어 혼수에 빠져 사망하는 경우도 적지 않다. 이와 같은 경우에는 이미 간세포의 광범위한 괴사로 혈중으로 유출되는 효소가 감소되었기 때문에 GOT, GPT 활성은 감소하여 정상치 가까이 된다.
혈액채취 및 원심분리, HEMOGLOBIN, HEMATOCRITS측정1. 혈액을 이용한 영양상태 판정- 철분영양상태 판정채혈방법 :1) 귀 또는 손가락에서의 채혈① 귓볼이나 손가락 끝에서 소량의 혈액을 채혈할 때는 충분히 마찰하여 혈행을 좋게 한 후 알코올을 적신 탈지면으로 소독하고 건조시킨 후 채혈침이나 주사바늘로 찔러 준비된 채혈시험관에 채혈한다. 상처 부분은 되도록 적게하고 2-3mm 깊이로 찌른다.② 귀의 혈액은 손가락이나 정맥의 혈액에 비해 혈구수가 5-10% 정도 높다.2) 정맥에서의 채혈① 구혈대로 팔꿈치 위 5cm 위치를 단단히 감고 채혈자로 하여금 주먹을 꼭 쥐게 한다. 팔꿈치 안쪽면 피부를 소독액으로 닦고 마른 후 채혈한다. 주사침 길이 2-3cm의 18호 크기의 것이 알맞으며 약 50°의 각도로 정맥에 주입한다.② 주사기에 혈액이 나타나면 주사기 프린저(plunger)를 서서히 잡아 당겨 원하는 양의 혈액을 채취한다. 주사침을 빼기 전에 구혈대를 풀고 채혈자의 주먹을 펴게한다.③ 채혈 후 주사기에서 주사침을 빼고 준비된 채혈시험관에 서서히 주입하여 옮겨 놓는다.혈청 분리1) 채혈 후 혈액 1 cc는 곧바로 EDTA(혈액 속의 Ca2+와 반응하여 불용성 칼슘염을 형성함으로써 혈액응고 방지)로 처리된 채혈관에 담는다.2) 남은 혈액은 원심분리관에 담아 원심분리하여 혈청을 분리분리방법 ① 채취한 혈액이 용혈되지 않도록 조심하여 원심분리관에 넣는다.② 3,000rpm에서 5-10분간 (또는 2,500rpm에서 15분간) 원심분리③ 원심분리후, 혈청분리관(serum seperate tube)에 담아 냉동실에 보관한다.A. Hemoglobin 측정( Van Kampan-Zijlstra's Cyanmethemoglobin법 이용 )1) 원리 :혈액에 Potassium ferricyanide를 가하면 약 5분이내에 sulfahemoglobin을 제외한 모든형의 hemoglobin은 methemoglobin으로 전환돤다. 여기에 Potassium cyaniell3) 방법a. 흡광도를 이용하여 계산하는 방법① 시험관에 표와 같이 증류수(blank), 혈액 표준(std)을 넣고 헤모글로빈 시약과 혼합한다. 이 때 피펫에 묻은 혈액이 잘 씻기도록 헤모글로빈 시약에 여러번 헹군다.시험관blanksamplestdHb 시약(ml)5.05.05.0혈액(전혈)(ml)0.02증류수(ml)0.02Hb 표준액(ml)0.02② 실온에서 10분간 방치한 후 증류수를 대조군으로 하여 검체와 표준의 흡광도를Spectrophotometer의 540 nm 에서 읽는다.③ 계산법 : 검체의 Hemoglobin 농도는(g/100 ml) =×기준액의 Hb 농도4) 실험 결과구분12Hemoglobin평균농도(g/100ml)표준액(std흡광도)0.3690.369-실험자A sample0.5510.5522.4 g/100 ml0.5760.58123.5 g/100 ml실험자B sample0.4570.46118.65 g/100 ml0.4690.46619 g/100 ml? 실험자A samaple의 Hemoglobin 농도검체의 Hemoglobin 농도는(g/100 ml)=sample흡광도×기준액의 Hb 농도std흡광도=0.551×15= 22.4 g/100 ml0.369검체의 Hemoglobin 농도는(g/100 ml)=sample흡광도×기준액의 Hb 농도std흡광도=0.55×15= 22.4 g/100 ml0.369? 평균 Hemoglobin 농도는 22.4 g/100 ml검체의 Hemoglobin 농도는(g/100 ml)=sample흡광도×기준액의 Hb 농도std흡광도=0.576×15= 23.4 g/100 ml0.369검체의 Hemoglobin 농도는(g/100 ml)=sample흡광도×기준액의 Hb 농도std흡광도=0.581×15= 23.6 g/100 ml0.369? 평균 Hemoglobin 농도는 23.5 g/100 ml? 실험자B samaple의 Hemoglobin 농도검체의 Hemoglobin 농도는(g/100 ml)=sample흡광도×기준액의 Hb 농액의 Hb 농도std흡광도=0.469×15= 19.1 g/100 ml0.369검체의 Hemoglobin 농도는(g/100 ml)=sample흡광도×기준액의 Hb 농도std흡광도=0.466×15= 18.9 g/100 ml0.369? 평균 Hemoglobin 농도는 19 g/100 ml? 철 결핍성 빈혈을 판정할 수 있는 Hb와 Ht 기준치Age/sexHemoglobin(g/dl)Hematocrit(%)10~11세< 11.5< 3412~14세< 12.0< 3615세 이상비 임신 여성< 12.0< 36임신여성< 11.0< 33남성< 13.0< 39? Hemoglobin 농도의 값은 예민도가 낮은 지표로서 철분결핍의 세 번째 단계에서 판정할 수 있으며, 성별, 연령, 임신 등 조사 목적에 따라서 판정 기준치가 다양하여 판정의 결과가 달라진다. 실험자A의 평균 Hemoglobin 농도가 각각 22.4g/dl와 23.5g/dl 이고, 실험자B의 평균 Hemoglobin 농도가 각각 1.65g/dl 와 19g/dl 로 위에 제시된 Hb 기준치에 비교하면 표준치의 거의 2배 높은 값을 보인다. 이 실험에서 발생할 수 있는 오류로는 ⅰ. 분광광도계의 오류가 있어 흡광도의 값이 잘 못나왔거나, ⅱ. 용액이 혼합이 잘 이루어지지 않은 상태였다거나, ⅲ. 마이크로피펫에 혈액이 묻어서 더 높은 농도의 값을 보이는 것 같다.B. Hematocrit(혈구용적)-PCV or Packed cell volume(%)측정1) 원리2) 준비물 : ① 채혈침② Capillary tube③ Hematocrit 측정용 고속원심분리기3) 방법 :① 손가락 끝을 충분히 마찰하여 혈액을 좋게 한 후, 알코올을 적신 탈지면으로 소독하고 채혈침으로 찔러 채혈한다.② 혈액에 Hepharin으로 적신 모세유리관을 갖다 대어 모세관 현상을 이용하여 2/3 정도 넣는다. 이때 공기가 도중에 들어가는 것을 막기위해 혈액을 다 넣을 때까지 혈액으로부터 관을 떼지 않도록 한다.③ 혈액을 넣지 않은 관 쪽을 Creat씰(또⇒ 전혈액층의 높이75mm25mm⇒50mm⇒혈구층혈장층Hematocrit(Ht) 값 =혈구층의 높이× 100전혈액층의 높이=25× 10075=33.3%? 철 결핍성 빈혈을 판정할 수 있는 Hb와 Ht 기준치Age/sexHemoglobin(g/dl)Hematocrit(%)10~11세< 11.5< 3412~14세< 12.0< 3615세 이상비 임신 여성< 12.0< 36임신여성< 11.0< 33남성< 13.0< 39? Ht 의기준치의 표에서 보면 나의 Hematocrit(Ht) 값은 33.3 %로 15세이상 비임신 여성의 Hematocrit(Ht) 값인 36% 에 미치지 못하는 값을 나타냄으로 철 결핍성 빈혈이라고 판정할 수 있다.? 고찰? Hb농도와 Ht 값을 비교해본 결과, Hb의 농도는 실험의 오류로 인하여 정확한 값을 얻지 못하였다. 그러나 Ht의 값을 기준치에 비교해본결과 철 결핍성 빈혈이라고 판정이 될 수 있다. 이러한 영양상태를 개선하기위해서는 혈액을 생성하는데 도움을 주는 철분, 비타민C, 비타민B12 등의 풍부한 음식을 섭취하도록 하고, 공복 시에 빈혈치료약을 먹도록 하여 효과를 높일 수 있도록 한다. 또한, 식품 중 철분의 형태에 따라 흡수율이 달라진다. 고기, 생선과 가금류에 들어있는 헴철은 계란, 곡류, 채소, 과일 중의 비헴철보다 흡수가 잘 된다. 비헴철의 흡수율은 아스코르빈산과 고기, 생선, 가금류의 존재에 따라 3~8%의 분포를 보인다. 아스코르빈산은 강력한 환원제일 뿐 아니라 철과 결합하여 즉시 흡수 될 수 있는 복합체를 형성한다. 그러므로 비헴철 식품을 섭취할 시에는 아스코르빈산이 함유된 식품과 함께 섭취하도록 한다. 그리고 커피와 제산제는 철분의 흡수를 감소시키므로 철분치료제와 함께 복용하지 않도록 주의하도록 하여야 한다.? 권장식품과 제한식품역할영양소함유식품권장식품혈색소 생성철간, 굴, 계란노른자, 살코기, 조개류(대합, 바지락), 해조류(다시마, 미역), 깨, 푸른잎채소(깻잎, 무청, 시금치, 부추)단백질고기, 생선, 달걀, 콩in 이란 ?헤모글로빈은 전체 적혈구 용적의 약 95%를 차지하고 있는 색소단백질로, 철을 포함한 포르피린 고리와 단백질의 일종(글로빈)을 포함한 헴이라는 구조 4개의 분자가 모여 이루어진다. 철 원자 1개에 대해 한 분자씩의 산소가 결합함으로, 헤모글로빈 한 분자에는 산소 4분자가 결합한다. 헤모글로빈은 생체 내에서 산소를 운반하는 일을 한다. 산소가 풍부한 폐에서는 산소와 결합하고, 산소가 희박한 조직에 이르면 산소를 떼어낸다. 산소의 방출은 pH가 낮아질수록 촉진되므로, 이산화탄소가 많고 pH가 낮은 말초조직에서는 산소를 보다 쉽게 떼어낼 수 있다. 이산화탄소가 혈장 속에 녹아 폐로 운반되어 폐호흡으로 체외에 방출되면 pH는 다시 원상태로 돌아가고 헤모글로빈은 다시 산소와 결합한다.혈액 중 Hb농도를 측정하는 방법에는 여러 가지가 있으나 일반적으로 Cyanmethemethemoglobin법이 가장 많이 이용되고 있다.헤모글로빈은 철의 영양상태를 측정하기 위해 가장 많이 사용되는 지표이나, 철 결핍의 마지막 단계인 빈혈상태에서만 그 농도가 감소하므로 철 결핍의 초기단계를 판정하는 데는 문제가 있다.2) Hemoglobin의 측정목적(측정하는 이유)- 빈혈(anemia) 진단- 빈혈치료에 대한 경과관찰- 탈수(dehydration) / 탈수에 대한 회복 관찰- 심한 빈혈증상에 대한 수혈결정- 반복성 출혈의 관찰3) Hematocrit이란?Hematocrit(Ht)이란 Whole blood(전혈) 중에 차지하는 적혈구 성분의 용적을 백분율로 표시한 적혈구용적 백분율로써 hematocrit을 측정하므로써 polycythemia 및 빈혈정도 파악의 척도가 된다. 또, 백혈구 증가와 황달 및 용혈 여부도 알 수 있다.모세관에 혈액을 넣어 원심분리하여 혈구 성분과 혈장 성분이 분리되는 것에서 붙여진 이름이다(hemato=혈액, crit=분리). packed cell volume(PCV)라고 표현하기도 한다. Hematocrit은 RBC의 수 및 Hb의 양과 동등한 의있다.