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미생물(대장균) 배양의 기초 테크닉- 배지, 멸균, 접종, 배양에 관해

Basic Laboratory TechniquesAbstract미생물을 배양하여 생장시키기 위해서는 각종 영양분이 요구된다. 이 때 필요한 영양분을 모두 가지고 있는 물질이 바로 배지인데 이번 실험에서는 보편적으로 미생물 배양에 사용하는 배지인 LB(Lurea Bertani) 한천 평판 배지를 만들고 E.coli(DH5α)를 streaking하여 배양해 single colony를 관찰해보았다.LB 배지 용액 100㎖는 Tryptone 1g, Yeast extract 0.5g, Sodium Chloride 1g, Agar 1.5g, DIW 100㎖를 잘 섞은 다음 습열멸균법의 하나인 고압증기 멸균법을 이용해 멸균하여 만든다. 이 때 Autoclave라는 내열, 내압성 멸균 장치를 사용하는데 고온, 고압 하에서 증기를 이용해 멸균처리를 할 수 있다. Autoclave를 이용해 121℃에서 15분간 멸균한 후 semi-solid 형태의 배지를 만들기 위해 60℃ waterbath에서 천천히 식히고 20㎖를 멸균된 Peri dish에 담아 굳힌다.한편, 일회용 plastic loop를 사용해 미리 만들어진 Agar plate에 streaking하였다. 이는 미생물의 single colony를 얻기 위해서이다. streaking이란 loop에 E.coli cell을 적당히 묻혀 와 같이 배지 위에 3~4등분 하듯이 지그재그 모양으로 줄을 긋는 것이다. streaking 후 미생물의 생장에 적절한 환경에서(37℃ incubator) 배양하고 나면 streaking을 처음 시작한 부분은 미생물의 농도가 짙어 선이 뭉쳐있는 것을 볼 수 있다. 그러나 streaking이 끝나는 부분으로 갈수록 그 농도가 옅어져 한 개씩 따로 떨어져 있는 single colony의 존재를 확인할 수 있다. single colony란 한 개의 cell로부터 배양되어 만들어진, 유전적으로 동일한 형질을 가진 cell들의 집합이다. single colony를 순수분리하여 계속 배양하면 돌연변이가 없reak plate method)이 있다. 멸균된 백금이에 분리하고자 하는 미생물의 시료를 묻혀 고체배지의 한 쪽에서부터 시작하여 점진적으로 전면에 도말한다. 도말하는 방법에는 여러 가지가 있으나, 한 쪽에서 점진적으로 전면에 도말할 때 inoculum은 차츰 희석되어 마지막 도말 부위에 이르게 되면 한 개 한 개의 독립된 집락(single colony)이 생길 확률이 크므로 그것을 분리하면 된다. 이와 같은 조작을 반복하면 균의 순수배양이 가능하다.미생물의 순수배양을 위해서 선결되어야 할 것이 사용용기, 기구와 배지의 완전멸균이다. 멸균은 어떤 물체에 있는 모든 생명체가 제거되었거나 죽은 상태를 뜻한다. 용기의 성상, 배지의 조성 및 멸균시키고자 하는 미생물의 종류, 성장 상태에 따라 보다 적절한 방법을 택해야 한다.첫 번째로 열처리법(Heat)은 가장 오랜 세월 동안 이용된 수단이다. 경비가 적게 들고, 독성물질을 내지 않으며 빠른 시간 안에 신뢰할 수 있는 멸균효과를 얻을 수 있는 장점이 있다. 그러나 내열성 물질에만 적용이 된다는 제한점도 있다. 열처리법은 단백질을 변성시키고 세포막 유지를 방해하며 그 외의 다른 고분자 물질들도 변성시킨다. 열을 사용한 멸균법은 또 다시 크게 4가지로 나눌 수 있는데, 그 중 화염멸균법(Flaming, 소각 포함)은 가장 확실하고 신속한 멸균법이다. 세균 검사에 사용하는 백금선, 백금 루프 또는 시험관 입구를 멸균하는데 알맞다. 균이 붙어 있는 백금선은 우선 환원염으로 가열시킨 후 산화염으로 빨갛게 달구어질 때까지 불꽃 가운데서 가열한다. 그 다음으로 습열(Moist heat)멸균법으로는 자비법과 고압증기 멸균(autoclave)이 있다. 자비법(자불멸균법)은 물 속에 집어넣고 20분 이상 끓이는 것이다. 탄산소다를 2% 정도 가하면 살균 효과가 높아지며 동시에 금속에 녹이 스는 것을 방지할 수 있다. 끓는 물에 견디는 물체의 멸균에 사용되나 내열성 아포(endospore)가 살아남을 수도 있다. 고압증기 멸균법은 고온ion)멸균법이 있다. 자외선, γ-선, X-선 등은 질량은 없으나 에너지를 갖고 있어 생물세포에 대해 살균성을 발휘하고 있다. 이 중 특히 자외선이 대표적이며 265㎚의 자외선이 가장 강력한 살균효과를 지닌다. 자외선은 핵산에 흡수된 파장이 지닌 에너지에 의해 핵산의 염기인 purine이나 pyrimidine의 구조에 변화가 생겨 핵산의 기능을 마비시키는 것이다. 주로 공기 살균 및 실험대 표면 살균에 사용한다.세 번째로 여과(Filter)멸균법은 열에 불안정한 시료 멸균에 사용하며 전에는 규소의 금속화합물로 된 여과기를 사용했으나 근래에는 셀룰로오스 아세테이트(cellulose acetate)와 같은 여과막을 사용하고 있다. 여과막의 포공의 지름이 0.22μM로 대부분의 미생물을 걸러 낼 수 있다. 그러나 바이러스 등은 여과막을 통과할 수 있기에, 필요에 따라서 바이러스의 존재를 다른 방법으로 확인해야 할 때도 있다.네 번째로 화학약품(Chemicals)멸균법이 있는데, 많은 종류의 화학물질이 미생물의 작용을 억제하는 성질을 갖고 있다. 공간을 소독하기 위해서는 Ethylene oxide 가스를 사용한다. Ethylene oxide는 아미노기(amino), 카르복시기(carboxyl), 황화수소기(sulfhydryl) 등의 유기물질과 잘 반응하여 강력한 살균력을 나타낸다. 보통 0~4℃에서 0.5~1.0%의 용액으로 준비한 후 상온으로 온도를 올리면 기화(bp 10.7℃)되어 섬유물질의 내부나 기구의 표면, 공간의 구석까지 침투되고 처리 후 쉽게 발산되기에 사용하는 데 이점이 있다. 그러나 희석액 상태에서는 Ethylene glycol로 변하고 폭발성과 인체에 독성을 가지고 있기에 사용에 제한이 있다. 의학, 미생물학에 소요되는 플라스틱 제품 생산 공장에서 제품을 대량 살균할 때 많이 쓰이고 있다.마지막으로 평압 증기멸균법은 100℃ 증기 중에서 15~60분 정도 가열하는 방법이다. 대부분의 아포는 100℃에서 죽지 않으므로 1회 가열로는 완전한 멸균이 되으로는 내부까지 열이 충분히 전달될 수 없으므로 30분 혹은 그 이상의 시간이 필요하다. 따라서 종류에 따라 증기가 내부로 쉽게 침투할 수 있도록 하여 멸균할 필요가 있다. 예를 들어 빈 삼각 플라스크를 멸균할 경우에는 물을 넣어 내부에 증기가 발생되는 상태로 멸균하고, 멸균한 후 건조기에서 물을 제거하고 사용한다.2.1기압 121℃에 도달할 때까지 15~30분간 계속 가열한다. 멸균이 끝난 후 증기는 서서히 뺀다. 가열로 변질될 우려가 있는 것은 멸균 온도와 압력을 낮추거나 시간을 단축한다.대개 사멸기준으로 Bacillus stearothermophilus의 포자를 삼는데, 109마리 이상 키워 Autoclave로 멸균처리(121℃에서 15분) 하였을 때의 마리수가 1마리 이하로 감소하면 제대로 멸균기능이 작동하는 Autoclave라고 할 수 있다.한편, 미생물이 생장에 필요로 하는 영양성분을 모두 갖춘 물질을 배지라고 하는데 영양분의 양은 필요한 만큼만 넣어 주는 것이 좋다. 필요 이상으로 영양분을 넣어 배지를 만들면, 오히려 미생물의 성장에 억제효과를 나타낼 수도 있다. 미생물은 종류에 따라 영양 요구성이 다르며, 배지는 대상으로 하는 미생물의 생육에 필요한 영양소를 적당량 가지고 있어야 하며, pH와 물리성이 맞아야 하고 무균적이어야 한다. 배지의 주요성분은 탄소원, 질소원, 무기염류, 생장소(growth factor) 등이다.배지의 종류는 여러 가지 기준에 따라 나눌 수 있다. 물리적 성질에 따라 구분하면 고체배지(Solid)와 액체배지(Broth)가 있다. 고체배지는 액체배지에 agar, 젤라틴, 실리카겔 등을 첨가하여 굳힌 것으로 미생물의 보존, 배양, 순수 분리 등에 사용된다. 고체배지는 평판배지, 고층배지, 사면배지 등이 있으며 목적에 따라 사용 방법이 다르다. 액체배지는 미생물의 생리, 화학적 연구나 미생물의 대량 배양에 사용된다. 사용 목적에 따라서는 보통배지와 특수배지로 나눌 수 있는데, 보통배지는 될 수 있는 한 많은 미생물이 생육할 수 미생물만 선택적으로 배양할 수 있는 조건의 배지이다. (예: Tellulite 첨가배지, Salmonella-Shigella 배지, MacConkey agar 등) 감별배지(Differential medium)란 특수한 생화학적 지시약을 넣어줌으로써 혼합세균 집단에서 특정 종의 미생물을 다른 것으로부터 구별할 수 있게 하는 배지로, 예를 들어 eosine-methylene blue 영양배지(EMB)에서 유당(lactose)를 발효하여 산을 내는 균은 광택있는 적색의 집락을 보임으로 유당을 발효하지 못하는 균으로부터 쉽게 감별된다. 집적배지(Enrichment medium)는 여러 미생물이 혼재하여 있을 경우 목적하는 미생물을 분리하기 위하여 원시료에 목적하는 미생물의 증식에 적당한 배지 조성을 만들어 배양하여 타 미생물보다 우선적으로 생장시켜 분리 배양하는 방법에 쓰이는 배지이다.준비된 배지에 세균을 접종하기 위해서는 다른 미생물이 들어오지 않도록 무균조작을 하여 야 한다. 일반적으로 무균조작을 위하여 Clean bench를 사용하는데, 이는 외부의 공기가 침입하지 않도록 차단 막을 만들고, 외부로부터 오염된 공기가 들어가지 않도록 차단장치를 마련한 박스형의 공간을 말한다. 무균실이 없을 경우에는 실험대를 잘 소독하고 알코올 램프를 여러 개 장치한 다음 일부의 공간에 오염된 공기가 들어오지 않게 한 다음 조작하면 어느 정도의 무균조작이 가능하다.Materials&Method일단 LB(Luria Bertani) 한천 평판 배지 100㎖를 만들기 위해 그 조성에 맞는 재료들을 준비한다. 4명이 1개 조를 이루어 250㎖ 짜리 삼각 플라스크 한 개를 사용한다. Tryptone 1g, Yeast extract 0.5g, Sodium Chloride 1g을 정확히 측정해 플라스크에 넣고 DIW 100㎖를 넣어 잘 녹인다. 마지막으로 Agar 1.5g을 넣어 잘 섞는다.준비된 LB 용액이 담긴 삼각 플라스크를 Autoclave에 넣고 1.3기압, 121℃에서 15분간 한다.

자연과학| 2008.11.16| 7페이지| 2,000원| 조회(180)

미생물, 대장균, 배지, 멸균, 접종

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competent cell 만들기(preparation) 평가A+최고예요

Competent Cell PreparationAbstract이 실험은 앞으로 수행할 재조합 DNA의 형질 전환을 위해 E.coli의 competent cell을 미리 제조하는 실험이다. 박테리아가 DNA를 cell 내부로 흡수하여 형질이 전환되는 것을 transformation이라고 하며 그 능력을 향상시키기 위해 cell에 물리, 화학적인 변화를 주어 외부 DNA를 더 잘 흡수하도록 만든 상태가 competence 상태이다. competence 상태는 자연적으로 일어나기도 하지만 여러 가지 실험적 방법을 사용해 인위적으로 만들 수도 있는데 그 중에 하나가 차가운 CaCl2 용액을 처리한 뒤 짧은 heat shock를 가하는 방법이다.전 실험에서 배양한 E.coli single colony를 inoculation한 뒤 1:100으로 희석되도록 transfer하여 competence가 주로 일어나는 log phase까지 배양한다. 배양액을 원심 분리로 침전시켜 차가운 CaCl2 용액으로 처리하는 과정을 2번 반복하는데 두 번째에는 CaCl2 용액 외에 30% glycerol도 넣어준다. glycerol은 여러 물리, 화학적 변형과 shock로 불안정한 competent cell의 protein-protein interaction을 안정화시켜준다. 모든 실험 과정은 차가운 환경에서 되도록 신속하게 진행해야 하는데, cell의 competence를 잃지 않도록 하기 위해서이다.실험에서 만든 competent cell이 잘 만들어졌는지를 알기 위해서는 cell의 transformation efficiency를 계산해보아야 한다. 실험에서는 항생제 내성 유전자가 없는 strain인 DH5α를 사용하였으므로, DH5α competent cell에 ampicillin 내성 유전자를 포함한 vector를 삽입시켜 형질 전환을 시키는데 형질 전환된 cell이 많을수록 competent cell의 효율이 좋은 것이다. ampicilling 내성 vector를 삽입한 cell을 접종하였을 때 쥐가 2~3일 내에 죽는 것을 관찰하였다. 이 쥐의 혈액에서는 S형의 Type Ⅱ 세포만이 발견되었다. 이 결과 죽은 Type Ⅱ 세포로부터 R형의 세포에 어떤 물질이 전달되었으며 그 결과 새로운 캡슐 구성 물질을 합성할 수 있는 능력을 갖게 되었으며 이 성질은 유전된다는 사실이 증명되었다.1944년 Avery와 McLeod 및 McCarty는 이 형질전환 물질을 화학적으로 정제하더라도 그 전환능력은 유지되고, RNase나 단백질 분해효소의 작용으로는 감소되지 않으나 DNase로 처리하면 급속히 소실되는 것을 통해 이것이 DNA임을 증명하였다. 이것은 또한 DNA가 유전물질임을 직접 증명한 최초의 증거이기도 하다.대부분의 박테리아는 일반적으로 제한된 양의 DNA만을 흡수하며, E.coli는 linear 또는 circular DNA를 받아들일 수 있는데 이러한 과정을 transformation이라고 한다. 이 능력을 더 향상시키기 위하여 물리, 화학적 처리를 한 상태의 세포를 competent cell이라고 한다. 특정 균주만이 competence를 가지고 있으며 그 능력은 유전된다. 더구나 competence의 능력은 세포의 생리적 상태와 생장된 배지에 의해 영향을 받으며 생장주기 단계에 따라 다양하다.미생물은 생장주기 단계에 따라 생육곡선(growth curve)이 있는데, 이는 미생물을 배양할 때 배양시간과 생균수의 대수(log) 사이의 관계를 나타내는 곡선으로 S자를 그리며, 유도기와 증식기, 안정기, 사멸기로 나누어진다. 유도기(lag phase, induction phase)는 균을 새로운 배지에 접종하여 배양할 때 배지에 적응하는 시기로 세포가 새로운 환경에서 증식하는데 필요한 각종 효소단백질을 생합성하는 시기이다. 두 번째는 증식기(logarithmic phase, exponential phase)로, 세포가 대수적으로 급격하게 증식하는 시기이다. 세대시간, 세포의 크기가 일정한 시기로 분열할 수 있는 최고 속도로 성장하고 분열되며H1, DH5, MM294등의 E.coli를 높은 효율(5×108 transformed colonies/μg of supercoiled DNA)로 형질 전환시킬 수 있으며, strain에 따라서 효율이 떨어지기도 하지만 사실상 거의 모든 경우에 사용할 수 있는 방법이다. 보다 간단한 방법인 두 번째 방법은 CaCl2를 이용하며 대략 107 transformed colonies/μg of supercoiled DNA의 효율을 가지고 있다.CaCl2를 처리하여 competence를 증가시키는 방법은 다음과 같다. Transformation 과정에서 competence를 만들어 주기 위해 Ca2+와 같은 양이온을 넣고 0℃에서 incubation하는데, 이 때 Ca2+가 세포막 인지질의 한 종류인 diacylglycerol의 negative charge를 중화시킨다. 또 낮은 온도는 세포막을 응고시켜 인지질의 분포를 안정화하여 양이온에 의해 효과적으로 중화되게 해준다. 이 때 짧은 열충격을 가하면 세포벽이 느슨해지고 세포막 내외의 불균형이 생겨 그 사이에 삽입하고자 하는 유전자를 포함한 벡터가 빨려 들어가고, 다시 급랭시킬 때 세포벽이 수축하는 방식이다. 열충격 외에도 전기충격을 이용하기도 한다.Competent cell로 사용되는 E.coli strain은 여러 가지 종류가 있는데, 필요에 따라 선택하여 사용한다. 우선 DH1은 recombination에 관련된 유전자가 결핍된 균으로 plasmid와 cosmid를 plating하고 성장시키는데 사용하는 균주이다. DH5는 그 특징이 DH1과 같으나 DH1보다 transformation 효율이 높다. DH5α도 DH1과 특징이 같지만 항생제 내성 유전자가 없어 항생물질을 포함하는 배지에서는 자라지 않는다. 또 β-galactosidase의 α-complimentation unit을 암호화하는 유전자를 포함하고 있으며 X-Gal(lactose analogue)를 포함한 배지에서 배양하면 흰색 colony를 형성한다.사 유전자 rpsL이 코드하는 Enforcement Cloning System용 vector pKF3 DNA를 사용함으로써 외래 유전자의 삽입 유무를 streptomycin 첨가 배지에서의 생육으로 간편하게 판별 가능하다. MV1184는 amber suppressor free 균주로 non-amber DNA vector만이 증폭이 가능하므로 amber 변이의 선택에 이용한다. 또한 F' plasmid를 가지고 있기 때문에 M13 phage vector나 phagemid의 host cell로 이용이 가능한 균주이다. HB101은 재조합 DNA 실험의 초기부터 널리 사용되어온, 유전적 형질이 안정하고 사용이 용이한 균주이다.Transformation의 efficiency는 보통 DNA(㎍)당 만들어진 형질전환주(transformant) 개수로 나타낸다. 형질 전환이 잘 이루어졌는지 동정하기 위해 ampicillin이나 tetracyclin 같은 항생제 저항성 유전자를 사용하는데, 한마디로 vector가 숙주세포에 제대로 들어가 발현이 되느냐 그렇지 않느냐를 구분하기 위해서이다. 원래의 숙주세포는 항생제에 저항성이 없어 항생제가 첨가된 배지에서는 살 수 없지만, 항생제 저항성 유전자가 포함된 vector를 가진 형질 전환 세포는 항생제에 저항성을 가지므로 항생제가 첨가된 배지에서 배양할 수 있다. 예를 들어, ampicillin 저항성 유전자가 포함된 vector를 이용해 transformation한 E.coli 10ng의 전체 부피가 2.5㎖가 되었는데, 그 중에 100㎕를 선택배지에 도말하여 배양해서 245개의 colony가 생겼다면, 245*(2500/100)=6125로 총 얻어진 transformant의 개수는 6125개가 된다. Efficiency는 10ng 당 6125개 이므로, 1㎍당 6125*100=612500=6.125*105이다. colony의 양은 형질 전환된 박테리아의 양을 대표하는 것이기 때문에, transformation efficiencyrpm(2700g)에서 10분간 원심 분리한다. 그러면 pellet이 형성되는데, pellet만 남기고 남은 액체는 버린다. pellet에 차가운 0.1M filtered CaCl2 용액을 10㎖ 넣고 vortexing하여 잘 섞어준다.이것을 다시 4℃, 4000rpm(2700g)에서 10분 간 원심 분리하고, 액체는 버려 pellet만 남긴 뒤 차가운 0.1M filtered CaCl2 용액 4㎖와 30% glycerol 4㎖를 넣고 vortexing하여 부유시킨다. 마지막으로 최종 부유액을 100㎕씩 e-tube에 분주하고, 분주액이 든 e-tube들을 액체질소에 빠뜨려 급랭시킨 다음 -80℃에 보관한다.Data&Results- inoculation: E.coli가 잘 자라서 뿌옇게 된 것을 관찰할 수 있다.- competent cell transformation efficiency = 4.5*105 cells/DNA(㎍)High copy plasmid DNA ㎍ 당 105~106개의 cell이 transformation되는 것이 정상이므로 이번에 만든 competent cell의 성능은 좋은 편이다.Discussion이번 실험은 앞으로 수행할 재조합 DNA의 형질전환을 위해 competent E.coli cell을 제조하는 것이었다. Competent cell이란 물리, 화학적 처리를 하여 박테리아가 외부 DNA를 흡수하는 능력을 대폭 향상시킨 세포를 말한다. Competence는 박테리아의 생장 단계 중 두 번째 단계인 증폭기(log phase)에 최대치를 갖는데, competence가 높을수록 외부 DNA를 흡수하는 능력이 좋으므로 우선 E.coli를 log phase까지 배양해야 한다.그러기 위해서는 우선 지난 실험에서 만들었던 E.coli(DH5α) plate에서 single colony를 한 개 따서 LB용액이 들어있는 test tube에 접종해야 했다. 손과 실험대를 알코올로 깨끗이 닦고 알코올램프를 켠 뒤, 불 주변에서 일회용 inoculat이었다.

자연과학| 2008.11.16| 7페이지| 2,000원| 조회(4,703)

competent cell, 대장균, Transformation, 형질 전환, DH5α

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