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Western blotting

Western blotting1. 서론(1) Apoptosis란 무엇인가?생물체의 기본 단위인 세포가 죽는 방식에는 두가지가 있다. 생체 스스로가 사망선고를 내리고 세포를 죽이는 Apoptosis와 급격한 외부 환경의 변화나 요인에 의해 죽게 되는 Necrosis가 있다. 이중, Apoptosis의 과정은 생명체가 태어날 때부터 유전자에 프로그램되어있다는 사실이 밝혀지면서 세포예정사 (programmed cell death)라고도 불린다. 다시 말해서 Apoptosis는 생체의 정상 과정 중 하나로서 태아의 발생시 만약의 사태를 대비해 미리 준비해둔 여분의 세포가 사용되지 않고 남았을 때, 세포가 바이러스에 감염되었을 때, 혹은 DNA의 심한 손상 등으로 정상화가 불가능할 때 일어난다. 이는 생체의 자발적인 반응의 일부이므로 일정한 규칙에 따라 조용히 진행되며 세포막과 핵막이 붕괴되고 세포의 크기가 줄어드는 특징을 가지는데, 크로마틴의 응집과 광범위한 핵구조의 파쇄가 동반된다. Apoptosis에서는 대개 죽음을 대비하는 시간이 충분히 주어지므로 불필요한 조직은 단계적으로 분해하고 사용 가능한 영양물질들은 이웃 세포들에게 전달되기도 한다. 적절한 시기에 Apoptosis가 일어나지 못하면, 각종 질병이 유발될 수 있으며 세포는 정상적인 상태를 벗어나 암으로 발전할 가능성이 크다. 이에 비해 Necrosis는 급격한 온도나 삼투압의 변화, 혹은 독성 물질에 의해 격렬하게 세포가 파괴되는 과정으로서 대개는 세포가 터져서 죽게되어 형태상으로도 Apoptosis와 구분된다.(2) Apoptosis 관련 논문 번역Abstract 해석 : 프리온 질병은 인간과 동물에게 치명적인 신경발생적 상태를 유발한다. 이 리뷰에서는 다양한 표현형의 분자적 배경과 프리온 단백질(PrP)과 신경발생적 질병과 관련된 다른 단백질과의 관계를 요약한다. 다양한 형태로 존재하는 PrP는 질병이 있는 뇌와 질병에 걸리지 않는 뇌 둘 다에서 존재하지만, 질병과 연관된 PrP는 프리온 질병의 병리적인 특징이 있는 조직과, 유전성과 연관되어 있는 조직이 존재한다. 프리온 질병은 발병과 표현에 있어서 인과적인 배경이 다르다. 프리온 단백질 유전자의 돌연변이는 유전자 형태와 관련되어 있다. 단백질분해제인 K의 소화 작용 후에 PrP의 Western blot의 패턴에 있는 129개 코돈의 다형성은 원발성 크로이츠펠트 제이콥 병의 분자적 다형성에 대한 기초를 뒷받침한다. 조직 손상은 비슷하거나 상호작용이 있거나 그에 수반되는 시냅스, 단백질 processing, 산소 스트레스, 자가소화작용과 apoptosis과 연관되는 세포들의 pathway에서 기인한다.2. 실험목적 : Signaling-western blotting을 통하여 세포내 신호전달 기전 확인3. Western blotting의 이론적 고찰Western blottingAntigen-Antibody reaction을 이용하여 여러 단백질의 혼합물로부터 어떤 특정 단백질을 찾아내는 방법이다. 이러한 Western blot방법은 전기영동으로 분리한 단백질의 검출을 쉽게 하고 항원 단백질의 검출 및 steroid-hormone receptor의 검출 등 각종 분석에 이용되고 있다.1) SDS-PAGE분석하고자 하는 단백질을 크기별로 분리한다. SDS-PAGE단계에서는 단백질이 고유한 3차 구조를 잃고 linear상태가 되어 순전히 분자량에 따라 분리가 된다. 분자량에 따른 분리는 전기영동시 glycine과 Tris-HCl에 의한 수소 이온농도 구배를 가져서 단백질이 가진 음전하량에 따른 이동에 의한 것이다.2) Transfernitrocelluose, PVDF 및 nylone membrane같은 filter에 transfer하는 방법이다. 이렇게 transfer하는 과정 동안 단백질로부터 SDS가 제거되고 단백질의 구조가 재생되면서 본래의 항원 결정기를 갖게 된다. Transfer되는 과정 동안 이동 효율은 분자량에 달려 있는데 분자량이 작은 단백질은 큰 단백질에 비해 효율성이 떨어진다. 이러한 문제는 메탄올을 처리함으로써 소수성 결합을 강화시켜 membrane에 잘 결합하도록 한다.3) 1차, 2차 antibody 처리primary antibodySecondary antibodyActinActin -RabbitBcl-2Bcl-2 -Mouse4) ECL 현상ECL (enhanced chemiluminescence)는 Peroxidase의 기질인 luminol이 peroxidase에 의해 산화되면서 푸른색 빛을 내는 것을 x-ray film상에 감광시키는 방법으로 ng수준의 단백질을 검출할 수 있다.Apoptosis 관련 물질Bcl-2 family는 미토콘드리아에 의한 intrinsic apoptosis pathway에 작용하는 단백질로 다양한 종류가 존재한다. Bcl-2 family는 단백질의 종류에 따라 apoptosis를 일으키기도 하고 anti-apoptosis를 하기도 한다.Bcl-2 family의 종류와 작용Bcl-2 family는 크게 pro-survival regulator와 pro-apoptosis regulator로 나눌 수 있다. 이들은 주로 미토콘드리아에서 작용을 하게 되는데 proapoptosis regulator는 cytochrome C의 유출에 관여함으로써 apoptosis를 일으키게 되고 pro-survival는 반대로 유출을 막아 apoptosis를 막는 역할을 한다. 즉, 어떤 신호에 의해 어떤 단백질이 작용하느냐에 따라 정반대의 역할을 하게 되는 것이다.1) Bax sub-familyBak와 Bax는 평상시에는 monomer로 존재하면서 Bcl-2에 의해 그 작용이 저해를 받게 된다. Apoptosis signal이 들어오면 conformational change가 일어나 dimer를 형성하여 미토콘드리아 외막에 작용하여 구멍을 만들고 미토콘드리아 내부의 물질을 밖으로 유출시킨다. 이때 나오는 물질은 cytochrome C, Apaf-1, Smac/Diablo, AIF 등으로 모두 apoptosis에 작용하는 물질들이다.2) BH3 sub-family이 family는 BH3 domain만을 가지고 있어 BH3 only protein으로 분류되기도 한다. 이들은 apoptosis signal 이 들어오면 Bcl-2, Bcl-xL에 결합하여 그 작용을 억제함으로써 Bax와 Bak의 작용을 활성화 시킨다. 특히 Bid의 경우 평상시에는 아무 작용이 없다가 apoptosis 신호에 의해 활성화된 caspase-8에 의해 일부가 잘려 tBid가 되면 Bcl-xL에 작용을 하게 된다.3) Bcl-2 sub-family의 작용평상시에 Bcl-2는 BH3 sub-family인 Bid/Bim과 결합되어 있고 Bax, Bak은 아무것도 결합되어 있지 않은 상태로 미토콘드리아 외막에 존재한다. Apoptosis signal이 들어오게 되면 Bik나 Bad가 Bcl-2 와 결합하게 되고 Bcl-2로부터 떨어져 나온 Bid/Bim은 Bak, Bax와 결합하여 그들의 conformational change를 유도하여 apoptosis를 유발시킨다.즉, Bcl-2는 Bax sub-family와 BH3 sub-family의 apoptosis 기전을 막는 역할을 함으로써 apoptosis를 막는 것이다.4. 실험방법① control, 항산화물질, H2O2, 항산화물질+H2O2의 4개의 그룹을 sample로 준비하여 100㎕가 되도록 하여 SDS-gel loading buffer를 넣고 끓인다.② resolving gel과 staking gel을 굳히고 electrophoresis kit에 장착하고 marker와 나머지 sample들을 20㎕씩 loading한다.③ 150V로 1시간정도 run한다.④ eletrophoresis가 끝나면 transfer blotter에 3장의 whatman paper를 깔고, 그 위에 nitrocellulose membrane을 깔고, 그 위에 gel을 얹고 다시 3장의 whatman paper를 덮는다.

자연과학| 2010.06.06| 5페이지| 2,000원| 조회(346)

생화학, Western blotting, 웨스턴 블랏팅, 웨스턴 블랏

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RNA의 추출과 RT-PCR

RNA의 추출과 RT-PCR1. 실험목적- 세포에서 RNA를 추출하여 그것을 정량하여 전기영동으로 RNA를 확인하고, RT-PCR을 이용하여 cDNA를 합성하고, 합성한 cDNA를 E.coli 형질전환을 한다. 그 원리와 실험방법에 대해 알아본다.2. 이론적 고찰(1) RT-PCRRT란 Reverse Transcriptase의 약자로, RT-PCR이란 reverse transcriptase를 이용한 PCR 실험을 말한다. mRNA는 RT-PCR 실험을 통하여 in vitro에서 DNA로 만들어진다. 즉, mRNA에 대응하는 cDNA를 대량으로 만들어 내기 위한 방법이 RT-PCR인 것이다. RT-PCR로 만들어진 DNA는 direct sequencing, plasmid DNA 제작 등에 사용된다.RT-PCR 실험은 3단계를 거쳐 이루어진다. 첫 단계는 reverse transcriptase를 사용하여 mRNA를 상보적인 DNA(cDNA)로 변환시키는 과정이다. 두 번째 단계는 변환된 DNA를 1차 PCR로 증폭시키는 과정이며, 세 번째 단계는 증폭된 DNA를 direct sequencing, plasmid DNA제조 등에 사용할 만큼의 양으로 더욱 증폭시키기 위한 2차 PCR과정(re-PCR)이다.(2) PCR① Pre-PCR status?PCR이 시작되기 전 실온의 buffer condition에서 추출한 DNA는 안정적인 B form double helix구조를 이루고 있다. 이 추출한 DNA를 원본으로 primer의 biding과 extension이 일어나기 때문에 이를 특히 templates라고 부르기도 한다.② Denaturation?적절한 energy(열)에 의해서 double strand가 single strand로 denature될 때 각 single strand의 backbone chain은 손상 없이 두 가닥의 strand로 풀어진다. PCR에서 base pairs간의 hydrogen bond를 끊기 위해 사용하는 energy는 열인데 보통 90°C까지 열을 가하면 single strand로 풀어진다.?③ AnnealingPCR의 최종적인 sensitivity와 specificity를 결정하는 제일 중요한 과정이다. Primer는 templates 같은 긴 DNA와는 달리 보통 15 bps이상 30bps이하의 oligonucleotide를 사용하는데 이런 짧은 DNA의 hybridization temperature를 결정하는 데에는 length, GC content, pH, salt concentration등 여러 요소가 영향을 미친다.?④ Extension??Taq polymerase가 primer의 3’end의 free OH기를 시작점으로 해서 single strand template의 상보적인 dNTP를 가져와서 붙여 나가며 chain extension을 시행한다. 처음 cycle에서는 template를 기준으로 합성이 되므로 target sequence와는 상관없이 3’방향으로 60 bps/sec의 속도로 계속 합성이 되어 나간다. 이론적으로는 template의 5' end까지 합성이 되어 나갈 수 있지만 extension time이 무한대가 아니므로 다음 cycle의 denaturation step까지 합성이 된다. 보통 500bps 이하의 size는 20초면 충분한 extension이 되는 것으로 알려져 있다.2. 실험과정(1) RNA 추출① MCF-7 cell과 HACAT cell을 Easy blue에 1분간 방치함으로 세포막을 깨고 RNA 멸균 micro tube 옮긴다.② chloroform을 넣고 15초 흔들어 3분간 놔둔다.③ 4℃, 1400rpm에서 15분간 원심분리한다.④ 상층 수용액부분을 새 튜브에 옮긴다.(2) RNA 정량 및 RNA의 손상 여부를 전기영동에 의해 확인① 각 tube에 250㎕의 ice-cold isopropanol을 넣고 잘 섞어준 후 15분 Room temperature 에 놔두어 RNA의 침전을 유도한다.② 4,000rpm에서 15분 동안 원심분리하여 침전된 RNA를 모은다.③ 상층액을 조심스럽게 제거하고, RNA pellet에 75% ice-cold ethanol 500ul를 넣어 침전된 RNA를 세적한 후 5분간 원심분리 하여 다시 침전을 모은다.④ RNA pellet을 30분간 건조시킨다⑤ 건조된 RNA pellet에 20㎕의 DEPC-DW(RNase inhibitor)를 첨가하여 잘 섞는다.⑥ RNA 용액을 DEPC-DW를 넣어 희석한다. (위의 용액 1ug + DEPC-DW 9ug)⑦ 희석된 용액 10ug중 4ug을 oligo dT 1ug과 섞어준다⑧ PCR mix 용액 45ug 중 20ug에 위의 용액 5ug을 섞어준후 PCR을 수행한다.⑨ RNA 손상 여부를 전기영동에 의해 확인한다.(3) RT-PCR① RT(Reverse Transcription)를 통한 cDNA 합성을 한다② PCR mix 용액 23ug에 합성된 cDNA 2ug을 넣고 p53, p21과의 중합효소 연쇄반응(PCR)을 진행한다.③ 중합효소 연쇄반응 산물을 확인한다. (by electrophoresis)④ DNA연결을 위해서 각각의 PCR product를 5ul씩 취하여 연결혼합액에 넣고 16℃에서 overnight한다.(4)PCR①cDNA 2ul와 PCR mix buffer 23ul를 넣고 잘 섞는다.②MCF cell과 HACAT cell 각에서 p53, p21의 발현을 확인하기 p53, p21의 primer 을 사용한다.②thermo-regulator를 이용하여 95℃에서 5분, 59℃ 30초, 72℃ 30초를 30회 반복하 고, 72℃에서 10분간 반응시킨 후 4℃에 보관한다.③증폭된 DNA 1.5ul와 sample buffer 6.5ul를 넣고 agarose gel에 loading하고 전기 영동한다.④UV illuminator로 DNA의 band를 확인한다.(5) E.coli 형질전환① competent cell 20ul을 e-tube에 옮기고, ligation product를 5ul 넣은 후 ice에서 15min간 방치한다.② selective plate(LB agar plate: Amp, X-gal 10ul, IPTG 20ul와 1)에서 얻은product 25ul를 도말한다.③ 37℃ incubator에서 overnight 한다.④ colony 생성 여부를 확인한다.(blue, white colony 비율)⑤ colony형성을 관찰하고 white colony를 피펫팅하여 30ul LB base를 첨가한 후 37℃에서 1시간정도 진탕배양기에 배양한다.⑥ 배양된 균 2ul를 따서 PCR을 진행하여 형질전환된 플라스미드를 확인한 다.(40cycle)3. 결과 및 discussion(1)RNA의 손상 여부를 전기영동으로 확인← RNA 전기영동 결과세포에서 RNA를 추출하여 RNA전기영동을 하면, 다양한 크기의 RNA들에 의해 전기영동 양상이 위의 사진처럼 촘촘하게 나타나게 된다. 그중에 ribosome의 large subunit과 small subunit을 이루는 28S, 18S RNA가 매우 두껍게 나타난다. 결과를 보면 전체적으로 매우 다양한 RNA 크기로 인한 촘촘한 band와 28S, 18S RNA 부근에서 두꺼운 band를 얻을 수 있었다. 이는 MCF-7 cell과 HACAT cell에서 추출한 RNA가 정확하게 추출되었다고 판단된다.(2)PCR 산물의 확인← cDNA PCR 결과? ?MCF HACATP21 P21다음은 MCF-7 cell과 HACAT cell에서 추출한 RNA로 RT-PCR을 실시하여 얻은 cDNA HACAT cell의 band를 에서 각각 얻을 수 있었다. 그러나 p53 band는 MCF-7 cell과 HACAT cell 모두에서 얻을 수 없었다.p53의 밴드가 나오지 않은 이유로 HACAT cell은 p53이 mutation된 세포이기 때문에 p53이 기능이 없기 때문이라고 생각한다. p53의 mutation에는 다음의 두 가지 경우를 생각해볼 수 있다.㉠ p53 gene 전체의 deletion인 경우㉡ primer 이외의 지역의 deletion이나 point mutaion에 의한 p53의 기능 상실인 경우㉠의 경우는 p53의 band가 나오지 않는 것이 맞다고 해도 ㉡의 경우에는 band의 크기차이가 있더라도 band는 나올 것이다. 하지만 이 실험결과만으로 p53의 band가 나오지 않은 이유를 확실히 판단하기 어렵다. 왜냐하면 MCF-7 cell에서는 p53이 발현되고 있으므로 PCR을 통해서 p53 band를 얻어야 했다. 그럼에도 불구하고 band를 얻지 못한 원인은 다음과 같이 생각해 볼 수 있다.

자연과학| 2010.06.06| 5페이지| 2,000원| 조회(1,132)

RNA, 생화학, 실험, RT PCR

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페놀황산법을 이용한 당정량

Phenol-Sulfuric Acid Assay method1. 이론적 고찰< 페놀 황산법 >페놀 황산법은 총당 측정법으로 미량의 시료 분석에 적합하다. 또 황산을 이용하기 때문에 전분, 셀룰로오스 등과 같은 고분자 물질도 미리 가수분해 하지 않고도 시료용액으로 사용 할 수 있다. 특히 이 방법은 칼럼크로마토그래피, 페이퍼크로마토그래피로 분획한 획분의 총당량 측정에 많이 사용되고 있다. 페놀 황산법을 이용하여 식품 중 총당을 측정한다. 환원당을 진한 황산 중에서 처리하면 탈수되어 furfural 혹은 그 유도체가 되며 이와같이 황산과의 반응을 이용하는 방법은 오렌지 옐로우빛을 낸다.simple sugars+phenol+sulfuric acid = orange yellow color오렌지색의 진한 정도는 존재하는 총 탄수화물의 양에 비례한다. 오렌지옐로우색의 정도는 생성물인 furfural 과 그 유도체의 양을 말한다. furfural의 벤젠링 구조는 빛을 잘 흡수하기 때문에 492nm에서 측정한 OD값을 알아내어 당정량을 한다.우리가 알고자 하는 당의 농도를 알아내기 위해서는 먼저 standard curve를 만들어 거기에 대입해서 농도를 알아내야 한다. 표준곡선을 만들기 위해서 글루코스의 농도를 달리하여 OD값을 측정하였다.2. 실험과정① test tube에 1mg/ml glucose를 농도별로 희석하여 놓고 sample도 넣는다. 최종 volume이 200㎕가 되도록 한다.② 5% phenol을 200㎕ 넣고 vortex 한다.③ 1㎕의 concentrated H2SO4를 재빨리 넣는다. 후드 안에서 주의해야한다.④ 300㎕ 씩 micro plate애 뷴주하고 492mm에서 측정한다.⑤ standard의 OD를 이용하여 standard curve를 그린 후 캔커피의 농도를 계산한다.3. 실험결과① 표준 당정량 표당의 농도00.0050.0250.050.250.5OD측정치0.06430.06370.06930.07460.08930.142② 캔커피의 OD값캔커피희석배수1회2회3회평균200배0.0760.0720.0730.073720배0.0760.080.0780.0782배0.0980.1010.1020.1003③ standard curve4. Discussion(1) 우리조의 sample은 캔커피였는데 이를 2배, 20배, 200배 희석을 하여 흡광도를 측정하였다. 반복하여 3회 측정된 OD 값의 평균을 내어 그 값을 standard curve로 추정한 식 y=0.1468x+0.0636의 y값에 대입하여 캔커피의 당의 농도를 추정하였다. 200배의 농도가 0.0686이 나왔고 캔커피 sample을 만들 때 동일하게 100배 희석후 200배 희석한 값을 보정한 농도는 1371.48로 도출되었다. 하지만 이 값은 20배 희석한 sample의 농도는 196.19가, 2배 희석한 sample의 농도는 50.05로 추정되었다. 농도간의 차이가 크게 나는 것은 실험적인 미숙에 의한 것으로 생각된다.(2) 희석이 가장 적게 한 2배의 경우 50.05㎍/㎕가 들어있으므로 전체 200㎖속에는 10.10g의 당성분이 들어 있음을 알 수 있다. 하지만 이 값은 실제 밀크티 속의 당과 차이가 있을 것으로 보인다. 또한 200배, 20배, 2배 희석한 경우의 당 농도의 편차가 큰데 이는 다음과 같은 이유를 생각해보았다.

자연과학| 2010.06.06| 2페이지| 1,000원| 조회(4,357)

생화학, 당정량, 페놀황산법, phenolsulfuric acid

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적혈구 용혈 실험 평가A+최고예요

실험결과 및 분석1.표준곡선(standard curve)측정치Hemolysis(%)12.5255075 (유추)100Transmittance0.0060.10.2450.4200.591→ 추정식 : y = 0.0066x - 0.0751 (R² = 0.9988)2. 삼투질 농도에 따른 적혈구 용혈 측정NaCl 농도0.15M0.135M0.12M0.105M0.09M0.075M0.06M0.045M0.03M0.015M0.0Mhemolysis(%)12.4412.8914.8614.7113.0568.6591.6899.8697.7497.7497.59흡광도0.0070.0100.0230.0220.0110.3780.5300.5840.5700.5700.5693. 아래 용액에 노출되었을 때의 용혈 여부 및 그 이유에 대해 쓰시오.용액의 종류hemolysis(%)흡광도용혈 유무용혈 유무의 기전0.15M NaCl용혈안됨(13.20)0.012×등장성 용액이라 용혈이 일어나지 않음.0.15M NaOH43.20%0.210○NaOH 0.15M은 등장성 염기성 용액으로 OH기가 적혈구 막의 단백질과 반응하여 단백질을 가수분해 시켜 세포막에 구멍이 생기며 세포막이 용혈된다. (비삼투성 용혈)0.3M Urea82.74%0.471○Urea는 세포막을 자유롭게 통과할 수 있어 Urea 농도가 낮은 세포 안으로 Urea와 물이 이동한다.0.6M Urea100%0.589○Urea는 세포막을 자유롭게 통과할 수 있어 Urea 농도가 낮은 세포 안으로 Urea와 물이 이동한다.0.15M NHCl82.59%0.470○NH₄Cl → NH4? + Cl?NH₄→ NH₃+ H?NH3가 세포막안으로 들어가 용혈된다.0.1% Saponin89.71%0.517○적혈구막 속의 콜레스테린이 사포닌과 강하게 결합하여 막구조가 파괴되기 때문이라고 생각되고 있다.(비삼투성 용혈)0.1% Saponin/0.15M NaCl90.92%0.525○적혈구막 속의 콜레스테린이 사포닌과 결합하여 막구조가 파괴되고 파괴된 막에 의하여 NaCl이 통과할수 있음에 따라 세포의 용혈작용이 더 크게 작용한다. (비삼투성 용혈)0.3M Urea/0.15M NaCl용혈안됨(12.89)0.010×아래에 기술① 부피 = 1배 : 세포질의 삼투질 농도는 300mosm/L이다. 그리고 세포 외부의 삼투질 농도는 0.15M/L NaCl의 경우 300mosm/L이고, 이온화 되지 않는 0.3M/L Urea는 300mosm/L이므로 합해서 600mosm/L이다. 즉, 세포질의 삼투질 농도보다 세포 밖의 삼투질 농도가 더 높은 상태이다.② 부피 = 0.5배 : 세포질의 삼투질 농도보다 세포 밖의 삼투질 농도가 더 높기 때문에 세포 내부에서 외부로 용매가 빠져나가고, 부피는 반으로 줄어들고 세포질 내 농도는 600mosm/L로 세포 밖과 같아진다.③ 부피 = 0.5배 : 세포질의 Urea 농도가 0이기 때문에 세포막을 자유롭게 통과할 수 있는 Urea가 세포 밖에서 내부로 Urea가 확산되어 들어온다. 이 단계에서는 용질의 이동만 있었기 때문에 부피는 ②와 같은 0.5이다.④ 부피 = 0.75배 : Urea의 유입으로 세포질의 농도가 외부의 농도보다 높아졌기 때문에 삼투에 의해 용매가 세포 내부로 유입된다. 이 때 부피는 0.75로 증가하고, 삼투질 농도는600mosm/L (400mosm/L Solis + 200mosm/L Urea)로 세포 외부와 같아진다.즉, 외부의 농도와 같아질 때 까지 용매가 유입된다고 볼 수 있다.⑤ 부피 = 1배 (물질이동 종결) : ④에서 용매의 유입으로 세포질 전체의 삼투질 농도는 외부와 같아졌지만 Urea의 농도는 200mosm/L로 세포밖의 300mosm/L보다 낮아졌다. 이 차이를 없애기 위해 외부의 Urea가 유입되고 세포내부의 농도는 700mosm/L로 높아진다. 다시 형성된 농도경사에 의해 외부의 용매가 유입된다. 이로써 세포의 부피는 처음과 같은 1이되고, 세포 내외의 총 삼투질 농도가 같아질 뿐만 아니라, 각각의 삼투질 농도를 구성하며 세포막을 자유로이 통과할 수 있는 Urea의 농도도 같아지므로 더 이상의 물질이동이 일어나지 않는다.4. 용질의 크기에 따른 용혈 효과(각각의 용액은 300mM임)용액의 종류㉠증류수㉡urea㉢glycerol㉣glucose㉤sucrose용혈이 발생한 시간1초1초5분이상용혈안됨용혈안됨* ㉠에서 ㉤까지 용액의 종류에 따라 용혈 발생 여부 및 용혈이 발생하는 시간에 차이가 나타나는 이유에 대해 기술하시오.㉠ 증류수 (용혈이 일어남 : 1초)물의 삼투질농도는 0osm/L이므로 혈액의 삼투질농도보다 낮다. 이 경우 농도경사가 발생하여 용매는 농도가 높은 곳에서 낮은 곳으로 이동하게 된다. 즉, 여기서 용매는 H2O이므로 수분이 적혈구 내로 들어가 결국 용혈 현상이 일어난다.㉡ Urea (용혈이 일어남 : 1초)urea는 σ=0으로 용질임에도 불구하고 자유롭게 반투막을 이동할 수 있다. 용혈은 비록 농도가 같은 등장성 용액일지라도 이러한 경우라면 일어날 수 있다. urea는 적혈구 안팎에 동일하게 분포한다. 적혈구막은 큰 분자는 세포를 빠져나갈 수 없어 세포 내 삼투압이 urea의 유입에 따라 바깥보다 높아진다. 따라서 농도 경사가 발생하고 수분이 농도가 높은 세포 내로 유입되어 세포막을 기계적으로 파괴시킨다.㉢ Glycerol (용혈이 일어남 : 5분이상 걸림)① 부피 = 1배 : 삼투질 농도(Osmolarity)는 용질의 종류와 무관하고 용질의 수에만 관계있으므로 이온화 되지 않는 0.3M/L 글리세롤의 삼투질 농도는 300mosm/L로 세포질의 농도와 같다.② 부피 = 1배 : 세포질 농도와 글리세롤의 농도가 같지만, 글리세롤은 지용성 물질로 세포막을 통과할 수 있으므로 isotonic하다고 할 수 있다. 따라서 글리세롤 용질이 세포 안으로 들어간다. 아직 부피는 그대로 1이다.③ 부피 = 2배 : 글리세롤이 세포 안으로 들어감으로써 세포질의 농도가 세포 밖의 농도보다 더 높아져서 용매가 세포 안으로 들어오고 부피는 두 배가 된다.④ 부피 = 2배 : ③에서 용매가 세포 안으로 유입되면서 세포질의 글리세롤 농도는 다시 세포밖 보다 낮아지게 된다. 따라서 외부의 글리세롤이 다시 확산되어 들어온다.⑤ 세포막 파괴 : 확산되어 들어온 글리세롤에 의한 농도경사 때문에 용매가 유입되고, 또 다시 낮아진 글리세롤 농도를 맞추기 위해 외부의 글리세롤이 확산되어 들어오는 ②~④의 과정을 반복한다. 점점 세포의 부피는 증가하고 더 이상의 장력을 버텨내지 못하는 시점에서 세포막이 파괴되는 용혈현상이 일어난다. 이러한 과정을 거치게 되므로 세포막의 용혈현상이 일어나기까지 오랜 시간이 걸리게 된다.㉣ Glucose (용혈이 일어나지 않는다)Glucose는 촉진확산에 의하여 적혈구 내로 들어간다. symport에 의한 glucose와 Na의 수송과 glucose의 uniport가 있는데 세포밖에 Na가 없으므로 세포막을 통과하지만 오랜 시간에 걸쳐 천천히 세포내로 이동하기 때문에 용혈현상을 관찰할 수가 없었다.㉤ Sucrose (용혈이 일어나지 않는다)Sucrose는 세포막을 투과하지 못하므로 용혈 작용이 일어나지 않는다.5. 용질의 지방 용해도에 따른 용혈 효과(각각의 용액은 300mM 임)용질의 종류㉠ methylalcohol㉡ ethylalcohol㉢ propylalcohol㉣ isobutylalcohol㉤ n-butylalcohol용혈이 발생한 시간4 초5 초10 초1 초1 초* ㉠에서 ㉤까지 용액의 종류에 따라 용혈 시간에 차이가 나타나는 이유에 대해 기술하시 오.- ㉣isobutyl alcohol과 ㉤ n-butyl alcohol은 분배계수가 가장 크다. 그에 따라 지질투과성이 커서 적혈구 막 투과성이 크다고 할 수 있으므로, 가장 먼저 용혈이 된다.- ㉢ propyl alcohol의 경우는 분자 크기에 비해서 ㉣ isobutyl alcohol과 ㉤ n-butyl alcohol에 비해 분배계수가 크지 않아서 ㉣ isobutyl alcohol과 ㉤ n-butyl alcohol에 비해 용혈시간이 오래 걸린다.- ㉠ methyl alcohol, ㉡ ethyl alcohol의 경우 극성을 띄면서도 분자의 크기가 작기 때문에 적혈구 투과성을 보인다. 하지만, 분배계수가 가장 작은 값을 가짐에 따라 ㉣ isobutyl alcohol과 ㉤ n-butyl alcohol보다는 용혈시간이 길지만, 분자의 크기가 작아 ㉢ propyl alcohol보다는 짧은 용혈시간을 보인다.

의/약학| 2010.06.06| 5페이지| 2,000원| 조회(10,948)

의학, 생리학, 생리학 실험, 적혈구 용혈, 삼투질

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