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뼈세포의 분화

Ⅰ. Introduction1. 실험 목적뼈의 precursor cell은 다양한 형태의 cell로 분화하게 된다. 이번 실험에서는 뼈에서 bone marrow macrophage(BMM)을 분리한 다음, 특정 signal을 주는 조작을 통해서 BMM을 osteoclast로 분화시킨다. 그런 뒤에 TRAP staining을 통해 osteoclast가 분화되는 과정을 살펴본다.2. Osteoclast다핵성 cell로 red bone marrow에서 만들어진 macrophage에서 분화되어 생성될 수 있다. Osteoclast는 혈중 calcium 농도가 낮을 때, parathyroid에서 나온 호르몬(PTH)에 의해서 bone을 파괴하여 calcium ion을 혈액으로 공급한다. 반면 osteoblast는 혈중 calcium 농도가 높을 때, thyroid에서 분비된 calcitonin에 의해 뼈에 calcium이 축적되게 하여 뼈를 생성한다. 이렇게 osteoclast와 osteoblast의 서로 상반되는 작용을 통해서 calcium homeostasis가 유지된다.Ⅱ. Materials and Methods1. Materials쥐의 다리뼈, α-MEM, Gey’s solution, PBS, 1ml 주사기, Strainer, 100π, Hematocytometer, Cover glass, Microscope, 30ng/λ M-CSF, 100ng/λ RANKL, Pipette, Pipette aid 등.2. Methods1. Fluxing1) 쥐의 다리뼈를 경골, 대퇴골 다 harvest한다.2) 다리뼈 한쪽 끝에 구멍을 뚫고, 1ml의 주사기를 사용하여 α-MEM media를 골수 내로 흐르게하여 반대쪽에서 cell이 포함된 media를 받아낸다.3) 3-5번 bone의 양쪽으로 이 과정을 반복한다.4) 1500rpm으로 5분간 centrifuge한다.2. Gey’s sol : PBS = 3:1 로 용액을 resuspansion한 후, 1500rpm으로 5분간 centrifuge한다.3. α-MEM 7ml를 넣어 용액을 resuspansion한다.4. 거르고 배양하기1) Strainer를 통해서 불필요한 조직을 거른 다음 100π에 하루 동안 둔다.2) 1)을 통해 위에 suspension된 cell만 얻어 BMM을 centrifuge한 후, 1ml씩 나눠 100 π에서 3일간키운다.5. Counting1) Cell이 들은 media를 흔들어 섞어준 후, hematocytometer에 cover glass를 살짝 누르면서 10μl만큼 넣는다.2) 가운데 정사각형 부분의 cell을 counting한다. – 결과 : 20개6. Cell plating1) Cell이 포함된 media 500μl에 pipette aid로 α-MEM 2000μl를 넣는다.2) 1)의 용액에 30ng/λ인 M-CSF 2.5μl와 100ng/λ인 RANKL 2.5μl를 넣고 섞어준다.3) 2)의 용액을 500μl씩 5개의 well에 plating한다.7. TRAP staining을 한 후 0-4일간 osteoclast의 모습을 관찰한다.※ 분화되는 동안 media의 영양분이 계속 소모되므로 2일에 한번 media를 갈아줘야 한다.(cell counting 시 넣은 media volume만큼 갈아준다.)※ 모든 cell culture는 contamination을 방지하기 위해 clean bench 안에서 이루어진다.Ⅲ. Results1. 분화 사진< 0일 >< 1일 >< 2일 >< 3일 >< 4일 >2. Counting과 cell plating에서의 계산과정1) ① “Cell 포함 media”Counting 결과 cell의 개수 : 20개Concentration of cells :② “48 well” plateConcentration of cells : (1 well = 500μl)⇒ 1 well 당 필요한 “cell 포함 media” volume :2) 총 5 well에 cell을 plating하므로,① 5 well volume :② 총 필요한 “cell 포함 media” volume :⇒ α-MEM 필요량 :3) 총 media volume이 2500μl(=2.5ml)이므로,① 30ng/λ M-CSF 필요량 : .② 100ng/λ RANKL 필요량 : 2.5μl .따라서 30ng/λ M-CSF와 100ng/λ RANKL는 각각 2.5μl씩 필요하다.Ⅳ. Discussion1. Cell concentration 계산 과정C : Cell concentrationN : 1mm2 당 cell의 수V : Volume = ml(Hematocytometer의 counting chamber depth는 0.1mm이므로,1mm2 한 칸의 volume은 이다.)따라서 cell concentraion은 C로 구할 수 있다.2. Hematocytometer의 원리Cover slip과 counting chamber 사이의 depth가 0.1mm밖에 안 되기 때문에 cover slip의 한쪽 끝부분에서 용액을 loading하더라도 모세관 현상에 의해서 용액이 counting chamber에 골고루 얇게 퍼지기 때문에 cell을 counting할 수 있게 된다. 그러므로 모세관 현상이 잘 일어나도록 cover slip과 counting chamber가 실험 시에 청결하게 유지되어야 한다.3. 실험에서의 오차정확한 측정을 위해서는 1mm2 한 칸에 들어있는 cell 수가 15-50개 사이여야 한다. 이번 실험에서는 20개로 측정되었으므로 cell이 들은 media의 농도가 적절한 것으로 보인다. 그러나 가장자리에 있는 cell 중 윗부분과 왼쪽부분의 cell만 counting 했어야 하는데, 가장자리의 모든 cell을 counting한 값이기 때문에 약간의 오차가 생겼을 것이다.또한 cell이 들은 media에서의 cell 농도가 전체적으로 일정할 것으로 보고 hematocytometer를 통해 필요한 volume을 구하지만, 실험 전에 cell이 들은 media를 흔들어 섞는다고 하더라도 cell끼리 뭉쳐서 존재할 수도 있기 때문에 cell 농도가 전체적으로 일정하다고 보는 것은 무리가 있고, 이로 인해 실험에 오차가 생길 수 있다.4. 각 시약의 역할① PBS(phosphate buffered saline)완충 용액으로 작용하여 급격한 pH 변화를 막아주면서, 이온의 세기를 맞추어 주어 cell이 삼투압에 의해 터지는 것을 방지한다.② Gey’s solutionRed blood cell이 bone marrow cell에 많기 때문에 red blood cell을 lysis하기 위해서 쓰인다.③ M-CSF & RANKLM-CSF(Macrophage colony stimulating factor)는 growth factor로 작용하여 osteoclast로의 분화를 유도한다. 그리고 osteoclast precursor는 세포 표면에 RANK(Receptor Activator of Nuclear factor-Kappa B)라는 receptor를 가지고 있어, 주변 osteoblast에서 생성된 RANKL(RANK Ligand)이 이 receptor에 결합함으로써 osteoclast로 분화하도록 유도한다.

자연과학| 2014.11.22| 4페이지| 1,500원| 조회(241)

분화, 뼈세포, 뼈세포 분화

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뼈조직의 해부학적 관찰

뼈조직의 해부학적 관찰Ⅰ. Introduction1. 실험 목적뼈 조직을 해부학적으로 관찰하기 위해서 histology 과정을 수행함으로써 쥐에서 얻은 다리 조직을 현미경을 통해 관찰할 수 있도록 제작하도록 한다. 또한 이를 통해 histology 방법을 익히도록 한다.2. Histology란?Histology는 생물체의 세포와 조직을 연구하기 위해서 sectioning과 staining을 함으로써 현미경을 통해 해부학적인 구조를 관찰할 수 있도록 하는 학문이다. 이를 이용하여 환자의 몸에서 조직을 채취하여 병을 정확하게 진단할 수 있으므로 생물학뿐만 아니라 의학에서도 중요한 역할을 맡는다.Ⅱ. Materials and Methods1. Materials마취통, Ether, 10% Neutral formalin, 11% Formic acid, Ammonia solution, Paraffin, Tissue processor, Cassette, Mold, Forceps, Ethanol, Microtome, Glass slide, Xylene 등.2. Methods1) Harvest마취통에 마취제인 ether를 충분히 적신 솜을 넣어 쥐를 마취시키고, 쥐의 목 뒷부분을 누른 채 꼬리를 잡아당겨 경추를 탈골시킨다. 그 뒤 다리 조직을 관절이 상하지 않게 주의하며 꺼낸다.2) Fixing10% Neutral formalin으로 24-48 시간 동안 상온에서 조직을 고정한다.(Formalin 용적은 조직 용적의 10-20배로 맞추고 formalin이 새지 않도록 뚜껑을 꼭 덮어야 한다.)3) Decalcification⑴ 조직을 실에 묶어 용기에 매달아 11% formic acid에 10-15일간 담가둔다.(Decalcification이 끝날 때까지 매일 새로운 용액으로 바꿔야 한다.)⑵ ⑴이 끝난 후, 흐르는 물에 잠시 씻고 ammonia solution으로 30분간 남아있는 산을 중화시킨 후, 다시 흐르는 물로 하루 동안 완전히 씻어낸다.※ Specimens는 완전히x2) (각각 20분씩)→ Xylene 20 min (x2) → Paraffin (65°C) 30 min. (x1) → Paraffin (65°C) 30 min (x1) with vacuum.5) Embedding⑴ Cassette채로, process된 조직을 65°C paraffin bath에서 15분간 녹인다.⑵ Mold를 hot plate에서 데운 후 소량의 녹은 paraffin을 붓는다.⑶ 가열한 forceps로 조직을 mold에 원하는 orientation이 되게 옮긴다.⑷ Mold를 cold plate로 옮기고 tissue cassette를 mold의 상단에 덮고 눌러준다.⑸ Cassette의 표면을 덮도록 충분한 양의 hot paraffin을 가한다.⑹ Paraffin을 30분간 완전히 식혀 딱딱하게 한 후, mold에서 떼어낸다.6) Section⑴ Embedding된 block을 microtome에 blade와 block 면이 평행하도록 고정한다.⑵ 10μm 로 pre section하다가, 조직이 잘려 나오면 4-6μm로 눈금을 조정한 후 천천히 진행한다.⑶ Paraffin ribbon이 전체적으로 깎일 때부터 숫자를 세면서 20번 정도 block을 깎는다.⑷ Forceps로 괜찮은 것을 골라 water bath(35-37°C deionized water)에 띄우고 glass slide로 건져낸다.⑸ Warmer로 paraffin을 녹여 조직을 glass에 고정시킨다.7) Staining⑴ H&E① Paraffin 제거 : xylene에 2분 담근다. (x3 changes)② Rehydrate : 100% EtOH (x2) → 95% EtOH → 80% EtOH → H2O③ Harris hematoxylin으로 3분간 염색 후 흐르는 물로 씻는다.④ 1% HCl(3회 dips) → Ammonia(3회 dips) → 흐르는 물로 씻음.⑤ Eosin으로 30초 염색한다.⑥ Dehydrate : 80% EtOH → 95% EtOH (x2) → 100apthol-Ether Substrate를 첨가하고 slide를 넣어 37°C 에서 1시간 incubate한다.④ 3이 끝나기 몇 분전, 1ml Sodium Nitrite Solution과 1ml Pararosaniline Dye를 30초간 섞고, 2분간 놔둔다.⑤ 다른 coplin jar에 ④의 solution을 넣고 잘 섞은 후, 첫 번째 jar에서 slide를 옮긴다.⑥ 37°C 에서 5분간 incubate하고 물로 씻어낸다.⑦ Hematoxylin으로 40초간 counterstain하고 다시 물로 씻어낸다.⑧ H&E의 ⑥-⑦과 동일한 과정을 거친다.Ⅲ. Results1. 뼈 조직 관찰1) 성장판 : 성장판은 연골세포층이 연속적인 종 배열구조로 되어있어, 연골세포들이 성숙해져 Hyperlink "http://terms.naver.com/entry.nhn?docId=938753" 뼈 조직이 된다.⑴ resting zone : 비활성화된 연골세포가 흩어져 있다.⑵ proliferation zone : 연골세포가 쌓이면서, mitosis를 한다.⑶ hypertrophic zone : 연골세포가 비대해지며 칼슘이 축적된다.2) Trabecular bonehypertrophic zone에서 자라나와 생성된 bone으로 trabeculae라는 branch가 network를 구성한다. 표면적이 넓으므로 calcium ion교환과 같은 metabolic activity에 효과적이며, 여러 pattern의 stress에도 잘 견뎌낼 수 있어, 뼈를 잘 지탱하고 이 부위가 많을수록 뼈가 튼튼하다.3) Bone cells⑴ Osteocyte : osteoblast가 bone matrix에 의해 둘러싸여 isolate된 것이다.⑵ Osteoclast : 매우 큰 multinucleated cell로 bone tissue를 파괴하는 bone resorption을 일으킨다.⑶ Osteoblast : mononucleate cell로 matrix와 mineral을 생성하여 bone준다.4) Osteoclast surface가 몇 mm고 해당되는 osteoclast의 개수가 몇 개인지를 확인한다.5) 1mm 당 osteoclast의 개수를 얻은 자료를 평균값을 내어 data를 얻고 그것을 graph로 그린다.Ⅳ. Discussion1. 뼈의 3가지 기능1) Mechanical뇌와 장기를 보호하고 body를 support한다. 또한 뼈는 connective tissue로 뼈 사이의 joint를 통해서 다양하게 움직이는 게 가능하며 muscle과 interaction을 통해 운동능력을 부여한다.2) Synthetic뼈 안의 red bone marrow에서 조혈모세포를 생성한다. 조혈모세포가 분화하여 erythrocyte, 모든 white blood cell, lymphocyte, platelet, macrophage, osteoclast 등을 만들 수 있다.3) MetabolicMineral을 저장하고(주로 Calcium, phosphorous) mineral homeostasis를 유지한다. 그리고 yellow bone marrow에 fat을 storage한다.2. 뼈 구성 성분1) 무기질주요 bone mineral은 carbonated hydroxyapatite(calcium, phosphate)이다. 또한 이 외에도 magnesium, fluoride 등이 뼈를 구성하는 무기질 성분이다.2) 유기질collagen fibers와 glycogen ground substances, 다양한 growth factors가 존재한다. proteoglycans, glycosaminoglycans, osteocalcin 등이 포함된다.3. 실험 내용 이해1) Fixing세포에 산소공급이 중단되면 가수분해효소를 가두고 있던 세포막 성분이 유지되지 못해 가수분해효소가 나와서 세포가 분해되기 시작한다. 그러므로 조직을 원래 상태로 보존하기 위해서 fixation이 필요하다. Formalin은 formaldehyde를 물에 포화시킨 것으로, 단백질간의 cro에서 완전히 수분을 제거해야 한다. 여기서 alcohol을 이용하면 확산작용에 의해 물을 밀어내게 된다. 갑작스런 탈수는 조직에 손상을 줄 수 있으므로, 단백질이 응고되는 alcohol 농도인 70%부터 단계적으로 alcohol 농도를 높여가며 탈수를 진행한다.⑵ Clearing침투제인 paraffin은 alcohol과 섞이지 않으므로, alcohol을 대체하기 위해 xylene을 사용한다. xylene은 알코올, 파라핀과 모두 섞이므로, alcohol 속에 담겨있는 재료를 xylene에 옮기면 alcohol이 xylene으로 대체되면서 침투제인 paraffin과도 잘 혼합될 수 있다.⑶ Infiltration연한 조직을 얇은 두께로 자를 수 있도록 조직을 paraffin으로 채워 단단하게 하는 과정으로, 조직을 녹은 paraffin 속에 넣어 다시 xylene을 제거하고 paraffin을 침투시킨다.4) EmbeddingParaffin embedding은 과정이 신속하며 얇은 연속 절편을 얻을 수 있으며, 장기간 보존이 가능하다. 그러나 고온의 paraffin에 의해 조직의 조직의 경화 및 뒤틀림이 생길 수 있다.5) Stain⑴ Stain을 하기 전에 paraffin을 제거하는 이유염색약은 대부분 수용성인데, paraffin은 소수성이므로 염색을 하기 위해선 xylene을 써서 파라핀을 제거해 주어야 한다. 그 뒤 alcohol로 xylene을 제거한다.⑵ 시약의 염색 원리① H&E stainingHematoxylin은 무색에 조직에 달라 붙지도 않고, 그것을 산화시킨 hematein은 색이 있으나 여전히 조직에 잘 달라 붙지 않는다. 그러므로 hematein이 조직에 잘 달라 붙도록 매염제인 백반을 사용한다. 백반은 조직내의 산성 원자단과 hematein을 결합시키는 작용을 하므로, hematein은 인산기(산성)가 많이 포함된 세포핵에 달라붙어 파란색을 띠게 된다.Erosin은 산성 염료이므로 단백질의 아미노기(염기성)와 결합하여 붉은빛을 띤다. 핵에도.

자연과학| 2014.11.22| 5페이지| 1,500원| 조회(337)

생명과학실험, 뼈조직, 뼈 조직 관찰

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construction of new auxotrophic mutant

Construction of new auxotrophic mutantⅠ. Introduction1. Purpose서로 다른 auxotroph type을 가지고 있는 두 yeast를 mating시켜서 원하는 new auxotrophic mutant를 얻는 것이 이 실험의 목적이다. 이 실험에서는 MS10(MAT a; ura, leu, ade)과 ECY36-3A(MAT α; ura, leu, trp)를 사용하여 MAT a; ura, leu, ADE, trp을 얻고자 하였다.2. Principle1) Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae는 single cell인 yeast로 자낭균류로 분류된다. 이 yeast는 life cycle에서haploid와 diploid 둘 다로 존재할 수 있고, haploid와 diploid 어느 쪽이든 budding(무성생식, mitosis)을 통해서 reproduce할 수 있다. 그리고 haploid의 경우 서로 다른 mating type(a와 α)의 mating을 통해서 diploid를 형성할 수도 있다.앞서 말했듯이 이 yeast는 자낭균류에 속하는데, 자낭균류란 자낭이라는 주머니에 자낭포자를 만드는 과정을 통해 reproduce를 하는 균류를 뜻한다. Yeast의 경우에는 다른 자낭균류와 달리 균사가 없으나 주변 환경이 좋지 않을 경우, diploid가 meiosis를 통해 4개의 haploid인 자낭포자(a와 α 각각 두 개씩)를 만들 수 있다.2) AuxotrophOrganism이 생존하기 위해 필요한 특정한 organic compound를 직접 합성할 수 없기 때문에 배지에 그 물질을 넣어줘야 하는 경우, 이런 특성을 가지는 organism을 가리켜 auxotroph라 한다. 이와 반대되는 개념은 prototroph로 이 organism은 wild type이 합성하는 모든 coumpounds를 합성할 수 있다.3) MatingSaccharomyces cerevisiae에서의 nation이라고 한다.Ⅱ. Materials and Methods1. MaterialsMS10(MAT a; ura, leu, ade), ECY36-3A(MAT α; ura, leu, trp), YPD and selection media, 벨벳, 핀셋, alcohol, incubator, 2% potassium acetate solution, zymolase, microscope, waterbath, DW, pipet, glass spreader 등.2. Methods※ 각각의 과정에서 yeast는 30℃에서 incubation시키며 균의 침투를 막기 위해 되도록 불 가까이에서 실험하여야 한다.1) Mating of haploids① Platinum loop나 일회용 loop를 사용하여 MS10과 ECY36-3A를 한 colony씩 채취하여 YPD에 Mating시킨 후 30℃에서 incubation시킨다.② Mating시킨 것을 벨벳을 사용하여 selection media에 replica시켜서 diploid 여부를 확인한다.※ YPD에 맨 마지막에 replica시켜야 한다.2) Selection of diploid① Streaking of diploid② ①에서 colony를 이쑤시개로 옮겨 Master plate를 만들고 YPD plate와 ura+leu plate에도 같은 방법으로 colony를 옮긴다.③ ②의 master plate를 selection media에 replica시킨다.3) Generation of haploid by sporulation① Sporulation of diploidⅰ) Diploid가 late log phase가 될 때까지 배양한다.(OD 8-9)ⅱ) Diploid를 덜어내어 2% Potassium acetate solution을 10ml 넣는다.ⅲ) 30℃에서 shaking incubation한다.ⅳ) Microscope로 tetrad를 확인한다.② Germinationⅰ) Sporulation cell 200μl와 zymony) MS10, ECY36-3A와 각각 mating시킨다.② Selection media에 replica시켜서 mating type을 확인한다.Ⅲ. Results1. Mating of haploids1) Yeast mating :2) Replica on selection media2. Selection of diploid1) Streaking of diploid :2) Master plate3) Replica on selection media3-4. Generation of haploid by sporulation & Genotype 확인1) Sporulation2) Germination3) Master plate4) Replica on selection media5. Mating type 확인1) Mating :2) Replica on selection mediaⅣ. Discussion1. 결과 분석1) Mating 후 replica한 결과ura+leu 배지를 확인해본 결과 mating이 후에 diploid가 생성되었다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 다른 실험 결과도 예상했던 것과 동일했다. 단 ura+leu+his 배지의 경우, ura+leu 배지와 같은 결과가 나올 거라고 예상되었으나 yeast가 전부 잘 배양되지 않았다. 그런데 his가 생장을 방해하는 요인으로 보이지는 않으므로 replica를 제일 마지막에 한 것이 yeast가 잘 배양되지 않은 원인으로 여겨진다.Replica 실험을 할 때에는 YPD를 마지막에 찍어서 yeast가 잘 자라지 않을 경우, 그것이 배지의 영향으로 인한 것인지 yeast가 적어서 잘 안 찍혀서 나온 결과인지 알 수 있는데, YPD에 첫 번째로 replica했기 때문에 정확한 판단인지 여부가 확실하지는 않다.2) Streaking 후 master plate를 replica한 결과Diploid로 만든 master plate를 replica한 결과 YPD와 ura+leu+ade 배지의 경우를 제외하고는 yeast가 잘 자을 얻기 힘들다. 그리고 원래는 ura, leu, ade, trp이 다 들어간 배지와 하나도 들어가지 않은 배지까지 실험이 끝나고 따로 replica시켜야 했으나, mating type 확인 실험만 할 수 있었다.주어진 selection media 세 곳에서 모두 yeast가 자라지 않았으므로 genotype이 ura, leu, ade, trp일지도 모른다고 여겨지나 12개의 colony가 다 이 genotype을 가질 확률도 낮을뿐더러, 5가지 selection media에 실험하지 못해서 정확한 판단을 내리기는 어렵다. 단지, 이 실험에서는 YPD를 제일 마지막에 replica시킴으로써 yeast가 적게 찍힌 것 때문이 아니라는 것은 알 수 있었다.또한 replica 시에 colony가 겹치지 말라고 master plate를 만든 건데 실험 결과 너무 colony 사이의 거리가 가까워서 YPD에서의 경우, 거의 주변의 colony끼리 결합하게 되었다. 이것은 master plate를 만들 때 colony 사이 거리를 너무 가깝게 만들었거나 replica 과정에서의 미숙한 실험 시행으로 인한 것으로 보인다.4) Mating type 확인 결과Mating 결과 ura+leu+trp의 배지에선 양쪽 다 잘 자랐으나, ura+leu+ade 배지에선 MS10과 mating한 부분만이 잘 자랐다. 또한 ura+leu 배지에서는 ECY36-3A 쪽에서는 yeast가 생장하지 못했으나 MS10과 mating한 경우에는 ECY36-3A와 비교했을 때 더 잘 생장한 것으로 보였다. 그러므로 X의 mating type은 MS10의 MAT a에 대응되는 MAT α로 추정된다.2. 같은 성끼리 mating이 안 되는 원인α type과 a type이 각각 pheromone인 α-factor와 a-factor를 분비하면 이 pheromones가 서로 상대방의 cell surface receptors에 작용하여 세포에 small bud가 생기도록 변형시킴으로써 mating이 일어난다.아보는 실험 Halo assay는 mating의 원리를 이용하여 mating type을 알 수 있는 방법 중에 하나이다. 배지에 α-factor를 뿌려두고 그 위에 mating type을 모르는 yeast를 배양할 때 yeast의 mating type이 a일 경우에만 yeast의 주변에 halo가 나타나게 되고, mating type이 α인 경우에는 halo가 나타나지 않는다. 이렇게 mating이 일어날 경우에만 halo가 나타나는 이유는 MAT a를 갖는 yeast의 cell cycle이 멈추게 되었기 때문이다. α-factor는 mating type이 a인 yeast의 cell cycle을 G1에서 멈추게 하여 growth를 inhibition한다. 그러므로 cell 주위에 halo가 나타나게 된다.5. Potassium acetate solution(KAC)의 역할KAC에는 질소와 탄소가 없기 때문에 이를 첨가함으로써 diploid가 극한 환경에 놓이도록 만들어서 meiosis를 통해 sporulation을 하여 tetrad를 형성하도록 만든다.6. Zymolase의 역할Zymolase solution의 구성은 zymolase와 sorbitol로 나뉜다. 두 가지의 작용은 다음과 같다. Saccharomyces cerevisiae는 thick하고 tough한 cell wall로 쌓여 있기 때문에 intracellular products를 얻기 위해서 extraction을 하기 힘들다. 그래서 cell wall을 제거하기 위해 digestion enzyme인 zymolase를 넣어서 tetrad를 각각 따로 분리할 수 있다. 그리고 Sorbitol은 hexose alcohol의 일종으로 yeast는 이 당을 이용할 수 없기 때문에 sorbitol은 cell wall이 제거되었을 때 세포를 osmosis의 영향으로부터 stabilize시켜준다.7. Streaking과 spreading 방식의 차이점도말이란 single colony를 얻기 위해 plate에 다.

자연과학| 2014.11.22| 7페이지| 2,000원| 조회(121)

Mutant, Saccharomyces cerevi, Auxotroph, ye..

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우리나라의 방사능 폐기물 처리 실태와 원전 증가 계획의 문제점

우리나라의 방사능 폐기물 처리 실태와 원전 증가 계획의 문제점1. 조사 동기이번에 위험 판단 심리학을 듣는 동안, 한 학기 전반에 걸쳐 원자력에 대한 내용을 계속 다루게 되면서 중학교 시절에 학교 과제로 부안군 방사능 폐기장(방폐장) 건설에 대한 반대 시위를 조사했던 것이 생각나게 되었고, 그 이후에 우리나라의 방폐장 건설이 어떻게 되었는지에 대한 궁금증이 생겼다. 그래서 이번 과제를 통해서 부안군 사건 이후에 방사능 폐기장 문제가 어떻게 진행되었는지에 대해 조사해보기로 하였다.2. 우리나라의 방사능 폐기장 건설 현황우리나라가 방폐장 건설을 추진한 것은 1980년대 말로 그 동안 여러 번의 실패사례가 있다. 그예로 부안군의 사례를 들 수 있는데, 2003년 7월 24일 방폐장 유치 신청에서 전북 부안군이 단독으로 신청함으로써 부지로 결정되었다. 그러나 부안군수가 주민들의 의사 반영 없이 유치 신청을 한데다가 정부가 현금 보상을 약속했다가 취소함으로써 주민들은 방폐장 유치에 반대해 시위를 하고 폭력사태까지 발생하였다. 결국 정부는 주민의 뜻에 따르기로 결정했고, 주민 투표제를 실시한 결과 방폐장 유치가 취소되었다.그 뒤 정부는 이전의 실패를 교훈 삼아, 원전용 작업복, 장갑 등 방사능 오염도가 상대적으로 낮은 중, 저준위 방폐장만 먼저 짓기로 하면서 해당 지역의 경제적 지원을 보장하는 특별법을 제정했다. 그리고 나서야 거의 방폐장 유치를 시작한 지 20년만인 2005년, 주민 투표를 통한 경주 방폐장 유치가 확정되었다.그러나 비록 경주 방폐장 유치가 주민들의 투표를 통해 결정되었다는 의의를 가지고 있기는 하나, 이 방폐장은 중, 저준위 방폐장일 뿐, 아직 고준위 방폐장 유치에 대한 사안은 처리하지 못한 채 그대로라는 한계점을 가지고 있다.또한 경주의 경우 이미 2004년 지질조사에서 지하수가 많고, 방사능 폐기물 저장소가 설치될 지하 130m 지질이 약하다는 조사 결과가 나왔으나 한국 수력원자력은 이 사실을 감추고 건설을 진행했고, 사실이 알려진 이후에도 보강 조치를 거치면 문제가 없다는 태도를 보였다. 그 결과 지하수를 퍼내느라 공사가 2년 넘게 지연되었고 지하수를 통한 방사능 누출 가능성도 제기되었으나, 결국 2010년 12월 24일에 경주 방폐장에 폐기물이 첫 반입되었고 2012년 말에는 방폐장이 완전히 완공될 예정이다.3. 우리나라 원전 증가 계획의 문제점우리나라의 경우, 그간 고준위 방폐장(사용 후 핵연료 처리장) 선정은 주민들의 반발로 단 한 번도 성공하지 못하였기 때문에, 일단 사용 후 핵연료를 저장할 중간 저장 시설부터 만들고자 추진하고 있다. 그러나 경주의 경우를 포함하여 그 동안의 원전 사고가 발생했을 때 문제를 숨기는 데에만 급급했던 정부의 태도 때문에 정부에 대한 신뢰가 전보다 더 떨어진 상태이므로, 이마저도 해당 지역 주민들의 반대가 예상되어 성사될 수 있을지 불투명하다.현재 우리나라는 임시방편으로 사용 후 핵연료를 원전 내 저장수조에 넣어둔 상태인데, 저장수조는 2016년을 시작으로 2024년이 되면 포화상태에 이를 것으로 전망된다. 그런데도 정부는 2030년까지 전체 전력 중 원전 비중을 59%까지 끌어올린다는 계획을 가지고 있다.4. 원전을 늘려야 하는 원인 분석1) 전력사용 문제과거 80-90년대 우리나라는 원전을 집중 건설하면서 전력이 남아돌게 되었고, 저장이 불가능한 전력을 소비하기 위해 전기를 값싸게 공급함으로써 사람들의 전력 소비가 급증했다. 이로 인해서 우리나라는 GDP대비 전력 사용량이 OECD 평균의 1.7배에 달하는 전기 과소비 국가가 되었고, 지금은 전기가 부족하게 되면서 다시 원전을 늘리는 선택을 취하고 있다.2) 대체 에너지 개발에 대한 무관심우리나라와 같이 전기 수요가 많은 산업국가인, 독일에서는 체르노빌 사건을 교훈 삼아 지난 20년간 전 국토에 재생 에너지 생산 시설을 확충함으로써 새로운 일자리 37만개를 창출하였고, 재생 에너지 분야가 강한 산업분야로 성장하였다. 또한 2020년까지 원전을 모두 폐쇄하고 2050년까지 전력을 재생에너지로 100% 충당한다는 목표를 세워놓고 있다.반면에 현재 우리나라의 신재생 에너지 비중은 OECD 평균의 10분의 1로 30개국 중 꼴찌로, 선진국처럼 대체 에너지 개발에 투자하는 것이 아니라 오히려 예산이 바닥났다는 이유로 태양광 발전에 대한 지원금을 없애고 원전을 늘리는 데만 신경을 쓰면서 신재생 에너지 공급을 대형 발전사들에게 떠넘기는 태도를 취하고 있다. 그러나 대형 발전사들은 자신들의 할당량을 채우기 쉬운 조력발전소 건설에만 몰려들어 신재생 에너지 발전이 균형적이지 못하며 갯벌 파괴라는 부작용까지 생기고 있다.5. 결론 및 대안우리나라에서는 몇 년 전에서야 중, 저준위 방폐장의 건설이 겨우 추진되었지만, 그 이후에 정부에 대한 불신이 여러 번의 원전 고장 사고로 인해 강화되었고, 일본의 방사능 유출 사고로 인해서 사람들의 불안이 가중되어 사용 후 핵연료를 저장할 중간 저장 시설 부지를 찾는 것은 몇 년이 걸리게 될지 기약할 수 없다. 또한 원전 내 저장고도 거의 포화가 된 시점에서 아무런 대처 방안도 확정되지 않은 상태로 정부가 원전을 늘리려고 한다고 해도, 원전을 늘릴 부지를 찾는 것 또한 쉽지 않은 일이 될 것이다. 그러므로 정부는 원전을 가동하는 것이 불가능해지는 만약의 상태를 대비하면서 지금의 전력난을 해결할 방법을 모색해야 한다. 일단 무조건 전력이 부족하면 원전을 늘려야 한다는 현재의 태도를 지양하면서 신재생 에너지에 대한 투자를 늘리고 전력난의 원인이 되는 전기 과소비를 줄일 방안을 찾아야 한다. 그리고 각 가정과 기업 또한 전기를 절약하는 것을 생활화하기 위해 노력해야 한다.또한 정부는 일반인들의 신뢰를 다시 얻기 위해서 원전의 관리에 더욱 신경을 써야 하며, 경주에 건설한 방폐장 관리에 대한 내용도 투명하게 공개하여 일반인들의 불안감을 해소시키려는 노력을 보여줄 필요가 있다. 그리고 방폐장을 선정할 때에도 몇 년 만에 급하게 끝내려고 하지 않고 조사를 철저히 하면서 그 과정을 제대로 공개함으로써 경주와 같은 일이 다시 일어나지 않도록 해야 할 것이다.

생활/환경| 2014.11.22| 2페이지| 1,000원| 조회(265)

방사능, 폐기물, 원전

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b-Galactosidase test with ONPG

β-Galactosidase test with ONPGⅠ. 입문 (Introduction)1. lac-Operon1) lac-Operon 정의Operon이란 연관된 유전자들이 통합적으로 조절될 수 있도록 하나의 전사 단위로 묶여 있는 것을 말하며, lac-Operon 은 lactose를 glucose+galactose로 분해할 때에 관여하는 operon이다.2) lac-Operon 구성① Promoter : RNA Polymerase(RNAP)가 결합하는 부위② Operator : repressor가 결합하는 부위③ Structure genes : a) lacZ - β-galactosidase 발현b) lacY - lactose permase 생성 (lactose를 박테리아 내부로 운반)c) lacA - thiogalactoside transacetylase 생성2. Positive & negative Regulation1) Negative Regulation① Lactose가 없을 때Regulatory gene에서 repressor 항상 발현 ⇒ operator에 결합하여 RNAP의 결합 방해② Lactose가 있을 때Lactose가 isomer인 allolactose로 일부 변환⇒ allolactose가 repressor와 결합⇒ repressor의 단백질 3차 구조가 변화되어 operator에서 떨어짐⇒ RNAP가 promoter에 결합 하여 lac transcription 시작2) Positive Regulation① Glucose가 적을 때cAMP (Hunger Signal) ↑⇒ cAMP가 CRP(Catabolite Regulation Protein)와 결합⇒ CRP-cAMP complex가 promoter 옆에 결합⇒ RNAP의 promoter 결합 촉진② Glucose가 많을 때cAMP ↓ ⇒ CRP가 inactive ⇒ lactose가 있더라도 낮은 수준의 lac transcription3. DiauxieDiauxie란 두 가지 당의 혼합물에서 먼저 다 사용한 후에 다른 당을 쓰는 것으로 인해 2단생장곡선을 보이는 것을 말한다. glucose와 galactose의 경우 glucose가 첫 번째로 다 사용된 후에 galactose가 쓰인다.4. PrincipleLactose 분해 시 필요한 β-galactosidase의 activity를 조사하여 박테리아의 lactose 이용여부를 알 수 있다. β-galactosidase activity를 조사할 때 쓰이는 ortho-Nitrophenyl-β-galactoside(ONPG)는 β-galactosidase에 의해 galactose와 ortho-Nitrophenyl(ONP)로 분해된다. 이 때 ONP가 알칼리성에서 노란색을 띄게 되므로 색상의 intensity를 조사하면 β-galactosidase activity를 측정할 수 있다.5. Purposeβ-galactosidase activity의 값을 측정하여 박테리아의 lactose 분해 능력을 조사한다.Ⅱ. 실험재료 및 방법 (Materials and Methods)1. 재료최소배지, 0.1M Glucose, 0.1M Lactose, 1차배양액(E. coli + Glucose / Lactose / Glucose+Lactose),Reaction buffer(10ml), 2-Mercaptoethanol(27ml), 0.1% SDS, Chloroform, H2O, ONPG(4mg/ml in H2O),1M Na2CO3, 시험관, 알코올램프, 장갑, timer, ice, pipet, 스포이트, shaker, spectrophotometer,vortex mixer, centrifuge, eppendorf tube, cuvette2. 방법1) 2차배양① 시험관에 표와 같이 넣는다. (물질이 가라앉아 있으므로 vortex한 후 넣는다.)조성최소배지Glucose (0.1M)Lactose (0.1M)1차배양액A5ml0.3ml∙Glu 1.5 mlB5ml∙0.3mlLac 1.5 mlC5ml0.3ml0.3mlGlu/Lac 가까이에서 작업하도록 한다.② ①의 시험관을 37°C의 shaker에서 1.5시간 배양한다. (2차배양액)③ Cuvette에 2차 배양액을 덜어 spectrophotometer(600nm)를 이용하여 흡광도를 측정한다.2) 용액 준비Reaction buffer 10ml에 2-Mercaptoethanol 27ml를 넣는다.※ 2-Mercaptoethanol은 유독성 물질이므로 장갑을 끼고 흉후드에서 작업한다.3) Test 준비① 12개의 짧은 시험관에 1~12까지 번호를 표시한다.② 각각의 시험관에 Reaction buffer(2-Mercaptoethanol 함유)를 0.8ml씩 넣는다.③ 각각의 시험관에 스포이트를 사용하여 Chloroform을 3방울씩 넣는다.※ Chloroform은 유독성 물질이므로 장갑을 끼고 흉후드에서 작업한다.④ 각각의 시험관에 스포이트를 사용하여 0.1% SDS를 2방울씩 넣는다.4) Test 시작※ 반드시 시간을 맞추어 실험을 하도록 한다.① Timer를 맞춰 두고 12개의 시험관을 하나당 15초 간격으로 실험한다. Blank에는 H2O 0.2ml를 나머지에는 각각에 해당되는 2차배양액 0.2ml를 넣고(at 3~5초) vortex(6~15초간)한다.② 5분간 RT에서 incubation한다.③ START : 5분이 되면 ①과 동일한 순서로 12개의 시험관을 하나당 15초 간격으로 실험한다.각각의 시험관에 ONPG를 0.2ml 넣고(at 10~12초) vortex(13~15초간)한다.④ 용액의 색이 노란색이 될 때까지 RT에서 incubation한다.⑤ STOP : 용액의 색이 노란색으로 변했을 때, 다시 원래의 순서대로 시험관 하나당 15초 간격으로 Na2CO3(1M)를 넣고(at 10~12초) vortex(13~15초간)한 후 얼음에 꽂아 놓는다.※ ONPG를 넣는 start부터 Na2CO3를 넣는 stop까지의 시간이 30분을 넘지 않도록 한다.⑥ 반응액 전부를 eppendorf tube에 덜고 13,000rpm으로 5분간 pipet으로 덜어 uv용 cuvette에 넣는다.⑧ Spectrophotometer를 사용하여 E420을 측정한다.Ⅲ. 결과 (Results)1. 실험결과【 모든 측정값과 결과인 Miller-Unit을 나타낸 표 】A(Glucose)B(Lactose)C(Glucose+Lactose)OD6000.4820.3810.503E42010.0131.6970.73020.0081.6630.72730.0371.8930.713Average0.0191.7510.723IncubationTime[min]25911Activity(Miller Unit)02553653* Glucose의 경우 incubation time이 25분이 되어도 색이 변하지 않아 실험을 종료했다.2. Miller-Unit 계산C (Glucose+Lactose)의 경우를 예로 들어 β-Galactosidase activity를 계산해보자.Ⅳ. 고찰 (Discussion)1. 실험결과 해석1) A (Glucose)에서 β-galactosidase activity가 없는 이유Repressor의 Negative regulation ⇒ lactose가 없으면 RNAP가 promoter에 결합하지 못함⇒ β-galactosidase activity가 없다.2) B (Lactose)에서 β-galactosidase activity가 큰 이유① Lactose가 repressor에 결합 ⇒ repressor inactive⇒ promoter에 RNAP가 결합 ⇒ lac transcription 시작② Glucose 없음 ⇒ cAMP ↑ ⇒ cAMP-CAP complex의 positive regulation⇒ promoter에 RNAP가 결합하는 것 촉진 ⇒ lac transcription 촉진3) C (Glucose+Lactose)에서 β-galactosidase activity가 A, B 사이 값인 이유① 반응 초기 : lactose가 존재 ⇒ promoter에 RNAP가 결합할 수 있음BUT, 다량의 glucose ⇒ C transcription만 가능② Glucose 소진 시 : 남는 당인 Lactose를 이용 ⇒ B와 같은 반응 진행2. 각각의 배양조건에서 어떤 Enzyme activity를 예상할 수 있는가?A : Lactose가 없음 ⇒ β-galactosidase activity가 0일 것B : Lactose만 있음 ⇒ β-galactosidase activity값이 클 것C : Glucose+Lactose ⇒ β-galactosidase activity가 A, B 값의 사이 값일 것.→ 이는 실험결과와 모두 일치했다.3. 다음 배양액의 β-galactosidase activity를 높음-중간-낮음의 차이로 예측하시오.1) Lactose : 높음2) Glucose : 낮음3) Glycerol : 낮음4) Latose+Glucose : 중간5) Lactose+Glycerin : 높음4. OD600 흡광도 측정 시 Lactose만 넣은 B의 값이 작게 나온 이유1) 실험 시에 cuvette의 아래 부분을 손으로 잡았기 때문에 오차가 생겼을 수 있다.2) Glucose가 존재하는 A, C와는 달리, B에서는 Glucose가 없기 때문에 초반에 박테리아가 생장을 멈추고 Lactose를 분해하기 위한 효소인 β-galactosidase를 합성하는 시간이 필요하므로 그로 인해 A, C보다 OD가 낮게 나온 것으로 보인다.5. 반응 stop시에 넣는 Na2OH3의 역할Na2CO3는 알칼리로서 용액에 1M의 Na2CO3를 첨가하면 용액의 pH가 11까지 증가하게 된다[1]. 이 pH에서 enzyme은 inactive하게 되므로 반응이 stop되고, ONP가 노란색을 띄게 되는 환경이 생성된다.6. β-galactosidase activity값의 오차 여부B(Lactose)의 경우, 다음 이유 때문에 효소의 activity 측정값에 어느 정도 오차가 있을 것으로 예상된다.1) 측정된 OD600 값이 0.5보다 작다.2) 측정된 E420 값이 너무 크다. (activity를 정확히 측)1

자연과학| 2014.11.22| 4페이지| 1,500원| 조회(510)

galactosidase, lac operon, ONPG

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