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소독 disinfection

1. 실험 제목 : 소독(disinfection)2. 실험 목적 : 소독한 sample(희석된 e.coli)을 spreading 함으로써 배지에 생긴 colony의 개수를 셈하여 소독이 미생물에 미치는 영향을 예측한다. 이번 실험은 시간에 따른 소독능력을 볼 것이다.3. 실험 기구 및 시약3.1 실험 기구-무게를 잴 때 사용하는 것 : 저울, 저울용 수저, weighing paper-손에 장착해야 하는 것 : gloves-serial dilution 할 때 사용하는 것 : 15ml 튜브, 피펫, 팁-spreading 할 때 사용하는 것 : 피펫, 팁, 알코올램프, 도말봉3.2 실험 시약-배양액을 만들 때 사용하는 것 : LB, Agar, 증류수-손을 소독할 때 사용하는 것 : 물에 희석한 에탄올-serial dilution 할 때 사용하는 것 : e.coli 10³ , phosphate buffer(증류수대신 사용)-spreading 할 때 사용하는 것 : 알콜 램프4. 실험 방법1) 미생물을 배양할 plate 54개를 준비한다.2) LB broth 25 g, LB Agar 15 g, 물 1 L을 넣는다.3) Autoclave를 이용해 멸균한다.5) Autoclave에서 멸균이 끝난 배지 액을 플라스틱 원심관에 50 mL씩 담고 플레이트에 약 15 mL(플레이트 바닥이 안보일만큼)를 부어주고 굳을 때까지 기다린다.(굳으면 뒤 집어준다)6) 준비된 E.coli 용액(10² 희석)을 Serial dilution을 이용해 10³, 10⁴, 10를 각각 6개씩 만든다.7) 소독에 쓰일 1 ppm NaOCl과 200배 희석한 가글을 만든다.8) 준비된 소독제들을 각각의 희석된 E.coli 용액에 1 mL씩 넣은 후 LB Agar 배지액이 굳은 plate에 0.1 mL 떨어뜨려 준 뒤 알코올 램프로 가열한 유리막대로 도말한다.9) 5분, 10분 경과함에 따라 소독효과를 알 수 있게 미생물을 배양한다.10) 24시간이 지난 후 미생물의 수를 관찰한다.5.실험 결과 및 고찰5.1 실험 결과10³Sample No.경과시간가글1가글2가글3Naocl1Naocl2Naocl30------5------10------10⁴Sample No.경과시간가글1가글2가글3Naocl1Naocl2Naocl30-227018004123-32535-157312852061-185810-*************111510Sample No.경과시간가글1가글2가글3Naocl1Naocl2Naocl30858957876---5-232119--450105346--378129* - : 개수를 셀 수 없었던 plate5.2 실험 고찰이번 실험의 목적은 소독한 sample(희석된 e.coli)을 spreading 함으로써 배지에 생긴 colony의 개수를 셈하여 소독이 미생물에 미치는 영향을 예측해 보는 것 이였다. 이번 실험에서 10³, 10⁴, 10 배로 희석한 e.coli를 사용했다. 실험을 통해 두 가지 결론을 얻었다. (1) 소독제를 넣으면 미생물의 활성이 낮아진다. (2) 소독제를 넣은 시간이 오래 될수록 더욱 소독 효과가 좋아진다.하지만 실험이 잘 안된 실험이 많았다. 그 이유를 생각해 보니첫째. 실험을 하면서 실험자의 타액이 들어가서 배지가 오염 된 이유둘째. 우리의 배양된 배지에 미생물에 한곳에 뭉쳐있는 것으로 보아 도말을 할 때 잘 펼쳐주지 않은 이유배양할 때 말을 하지 말고 도말을 할 때에는 잘 펼쳐서 해야함을 느꼈다.Autoclave.고압증기멸균고압증기 멸균기(autocalve)에 멸균할 물체를 넣고 밀폐하여 1kg/cm2(15lb/in2)의 증기압(121°C)에서 15-20분간 처리하여 멸균하는 방법이다. 이때 주의해야 할 사항은 고압증기멸균기 내에 들어 있는 공기를 100% 의 수증기로 교체한 후 배기밸브를 닫아 멸균하는 것이다 왜냐하면 공기가 혼입된 수증기는 같은 압력(15lb/in2)하의 100%수증기보다 온도가 낮아 효과적인 멸균을 기대할 수가 없기 때문이다. 주의하여야 할 또 다른 한 가지는 액체배지와 같은 액상물질을 이 방법으로 멸균한 후 갑자기 배기밸브를 열어 15lb/in2의 압력을 대기압으로 내리면 액체가 끓어 넘치게 되므로 끓어 넘치지 않도록 배기밸브를 서서히 열어서 압력을 내려야 한다. 이 방법은 짧은 시간에 1회의 멸균으로 포자까지 사멸시킬 수가 있으므로 배지와 기구 등의 멸균에 널리 사용되고 있다. *출처 네이버 지식백과-[autoclave]

자연과학| 2015.03.28| 3페이지| 1,000원| 조회(183)

미생물, 실험, 소독, 실험레포트, Disinfection

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성장곡선

1. 실험 제목 : 흡광도를 통한 미생물 성장곡선2. 실험 날짜 : 2014년 9월 24일 (수)3. 실험자 및 조 : 이 승 진 6조4. 실험 방법 :1) 삼각플라스크에 액체 LB배지(증류수 200mL+LB 5g)에 PA(pseudomonas)를 0.1mL 넣는다.2) 미생물이 잘 자랄 수 있게 미생물배양기에 넣는다.미생물배양기의 배양조건은 29.9℃, 143RPM 이다.▲미생물배양기3) 4(16)시, 7(19)시, 10(22)시, 12(24)시, 익일 8시, 11시, 1시 총 7번 흡광도를 측정한다.4) 미생물의 생장정도를 UV분광광도계(600nm)를 이용해 흡광도(O.D., Optical Density)를 측정한다. 아무것도 넣지 않은 LB를 기준점으로 놓고 측정한다.→ 분광광도계를 이용해 흡광도를 측정하는 원리 : 빛이 물체에 닿았을 때, 그 물체에 의해 흡수되는 빛의 양은 그 농도에 따라 다르다. 그러므로 빛의 흡수현상을 이용하면 시료 중에 빛을 흡수하는 화학물질의 양을 정량화 할 수 있다. 아래 그림에서와 같이, 미생물이 많이 성장했을 경우, 미생물에 닿아 흡수되거나 굴절되어 detector에 닿지 않는 빛이 증가한다. 따라서 미생물이 많이 성장할수록 분광광도계 측정판(Spectrophotometer meter)에 표시되는 측정값이 작게 나온다.▲우리가 사용한 UV분광광도계5) 모든 측정을 마치고 Growth Curve를 그려본다.5). 실험결과 및 고찰5.1 실험결과4(16)시7(19)시10(22)시12(24)시익일 8시11시1시값0.0070.0560.3220.6791.1801.3461.3895.2 실험고찰이번 실험의 목표는 흡광도 측정을 통한 미생물 성장곡선(growth curve)을 알아보는 실험이었다. 하지만 실험결과의 그래프에서도 볼 수 있듯이 우리의 실험은 성장기인 구간에서 끝난 것을 알 수 있다. 11시와 1시 사이의 기울기가 0에 가까워 진 것으로 보아 실험을 중단하지 않고 계속 진행할 경우 최고치를 기록하고 대수기를 거친 뒤 사멸기에 들어서 미생물의 수가 감소할 것을 예측할 수 있다.cf) 미생물 성장 곡선 (Growth````Curve) : 폐쇄상태(closed system)에서의 집단성장- 새로운 영양분 공급과 대사산물의 제거가 안 된 상태- 여건이 허락하는 시간범위 안에서 대수적 증가- 영양분 소모, 고갈되고 독성 대사산물의 축적 →생장률 점차로 저하 → 생장 멈추고 → 사멸- 지체기, 성장기, 대수기, 사멸기로 구분(1) 지체기(Lag phase)- 접종균이 새로운 환경에 적응하는 시기- 성장에 필요한 효소나 세포 구성성분의 합성이 완비된 상태 X → 재합성이 이루어 질 때까지 걸리는 시기

자연과학| 2015.03.28| 4페이지| 1,000원| 조회(156)

미생물, 실험, 실험레포트, 성장곡선

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미생물 배양

1. 실험 제목 : 미생물 배양 도말평판법(spreading)2. 실험 날짜 : 2014년 9월 22일3. 실험자 및 조 :4. 실험 방법 1) 플라스크에 증류수 200ml, LB 5g + Agar을 넣은후 녹을 때 까지 섞는다.▲증류수에 LB를 섞은 용액2) Autoclave를 이용하여 멸균한다.여기서 우리는 조교님께서 만들어 놓은 macconkey를 사용했다. LB도 같이 사용하려고 했지만 Agar를 넣지 않아서 모든 조가 macconkey를 사용했다.*Agar : 영양분들을 plate에 배양하기 위해 굳히는 데에 사용. Agar를 배지에 넣어주면 영양갱처럼 굳게 되고 멸균 후 petri dish에 일정량 담아 두고 상온에 두면 굳게 된다. Agar를 넣지 않고 영양분들을 그냥 제조하면 액체배지가 된다.3) 실험에 사용할 농도별 PA(pseudomonas)희석액을 serial dillution(순차적 희석)을 통해 만든다. 농도는 10⁴, 10, 10으로 만든다. PA(pseudomonas) 1mL에 9mL의 Buffer를 넣을 때 농도가 10배씩 낮아진다. 처음 PA(pseudomonas)원액에 4~6번의 희석과정을 반복하면 10⁴, 10, 10의 농도로 낮아진다.*우리는 처음 PA(pseudomonas)용액이 10⁴농도였다.4) plote에 15ml씩 넣고 굳을 때 까지 기다린다.5) dilution 한 용액(10⁴, 10, 10) 0.1ml를 넣고 멸균한 유리막대를 이용 배양.Spreading에 사용된 희석액의 농도를 쓰고 테이프로 밀봉한다.5). 실험결과 및 고찰5.1 실험결과1조2조3조(E-coil)4조5조(PA)6조(PA)7조(PA)10⁴xx40 CFUx89 CFU80 CFU120 CFU10xx3 CFUx26 CFU16 CFU15 CFU10xx0 CFUx3 CFU1 CFU1 CFU우리 조(6조)는 10⁴용액에서는 80개의 colony 10,10용액에서는 각각 16개의 colony와 1개의 colony가 관찰되었다.counting하는 방법 (1) 적을 때 : 네임펜을 이용해 colony를 하나씩 찍으면서 센다.(2) 많을 때 : plate를 2등분하여 한쪽만 센 후 그 개수를 2배한다, colony가 너무 많은 경우 2등분 대신 4등분, 8등분을 한 후 각 4배, 8배를 한다.5.2 실험고찰이번 실험의 목적은 도말평판법을 통해 배지에 생긴 colony의 개수를 셈으로써 사용한 sample에 들어있는 미생물의 개수를 예측해 보는 것이였다. 이번 실험에서 우리 조가 사용한 sample은 10⁴,10,10배로 희석한 pseudomonas(PA)를 사용하였고 각각의 미생물의 이론적인 비율은 10⁴은 150개, 10은 18개, 10은 2개라고 조교님께서 알려주셨다. 우리 조의 실험은 10⁴을 제외하고는 비슷한 결과를 얻었다. 10⁴용액이 이론적인 비율보다 적게 나온 이유를 생각해 보면, spreading은 원칙적으로 clean batch에서 해야하지만, 이번 실험에서는 모든 사람이 이용 할 수 없었으므로, 불가피하게 많은 불순물들이 존재하는 바깥에서 진행되었다. 미생물은 작은 더러움이 있어도 오염될 수 있으므로 spreading이 진행되는 환경은 깨끗해야 함을 느낄 수 있었다.

자연과학| 2015.03.28| 3페이지| 1,000원| 조회(221)

미생물, 실험, 실험레포트, 배양, 미생물배양

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PCR

1. 실험제목 : PCR2. 실험목적 : 추출해낸 DNA를 PCR실험을 통해 원하는 DNA부분을 선택, 증폭을 시켜 band로 존재 유무를 확인한다.3. 실험기구 및 시약3.1 실험기구손에 장착해야 하는 것 : glovesPCR 기계전기영동 기계전자레인지UV viewer저울3.2 시약손을 소독할 때 사용하는 것 : 물에 희석한 에탄올Master mix 2x(Hot start)- DNA polymerase : 74℃에서 최적 반응을 하고 성분 DNA끼리의 합성을 도와줌- DNTP(deoxynucleotide triphosphate) : DNA 염기서열에 필요한 ATCG를 제공- Reaction buffer Loading dye : DNA 용액을 무겁게 하여 well로 가라앉히는 역할 / DNA 전기연동의 정도를 알 수있게 해주는 역할Forward & Reverse primer : 특정 DNA 증폭의 시발점을 미리 만들어 준다.DNA template : 추출된 sampleNuclease(free water)브롬화에티듐 : 발광 표지(핵산 염색)로 널리 쓰이는 끼어들기 약물이다TBE buffer4. 실험 방법1. Vortex로 시료 3개와 시약(DNA, Hotstart, F-primer, R-primer) 3초 섞는다.2. Hotstart 25㎕, F-primer 2㎕, R-primer 2㎕ 순서로 각각의 튜브에 넣는다.3. 시료 1 (잔디)의 경우 nuclease free water 16.9㎕ 넣고 DNA 4.1㎕를 넣는다.시료 2 (헬스장)의 경우 농도가 너무 적으므로 water는 넣지 않고, DNA만 27.8㎕를 넣는다.시료 3 (뒷산)의 경우 농도가 너무 적으므로 water는 넣지 않고, DNA만 27.8㎕를 넣는다.4. Vortex로 준비된 시료를 3초 섞는다.5. PCR① 전처리 : 94℃ 에서 [4min] 가열② 35cycle- denaturing : DNA를 가닥가닥 나눈다. [1min] at 94CENTIGRADE .- annealing : primer가 타겟에 붙게한다. [1min] at 55CENTIGRADE .- elongation : 뽑을 것을 증폭 시킨다 [1min] at 73CENTIGRADE③ Final extention : 73CENTIGRADE 에서 [4min] 가열.6. 전기영동 시작1. 0.5g의 agarose powder를 50mL 증류수에 넣고 녹인다2. 녹인 agarose gel(물에넣은 agarose powder)를 전자레인지에 아주 작은 입자가 없어지게 완전히 녹인다.3. 0.25μL 브롬화에티듐(발암물질이므로 주의)을 넣는다4. 카세인으로 만든 상자에 agarose gel을 담는다. 이 때 거품이 생기지 않도록 조심해서 담는다.5. Comb를 조심히 넣는다6. 굳을 때 까지 30분~1시간 정도 기다린다. 이 때 너무 굳거나 너무 덜 굳으면 안된다.7. 조심스럽게 agarose gel에서 Comb를 제거한다.8. 카세인 상자를 제거하고 agarose gel을 전기 영동장치에 넣는다9. 전기영동장치를 작동시킨 뒤, TBE buffer를 표시된 위치까지 붓는다.10. pipet을 이용하여 well(Comb 넣은 후 생긴 구멍)에 넣는다. 양 쪽 끝에는 DNA ladder 5μL를 남은 well에는 12.5μL를 넣는다.11. 전기영동장치의 뚜껑을 덥는다12. 전기영동장치의 시작 버튼을 누른다13. 장치가 끝날 때 까지 30분정도 기다린다14. 전기영동장치가 끝난 후 카세인 상자에 있는 agarose gel을 조심스럽게 꺼낸후 UV viewer에 넣는다.15. WiseView라는 소프트웨어를 이용하여 agarose gel을 관찰한다.5. 실험결과 및 고찰5.1 실험결과5.2 고찰이번 실험의 목적은 우리가 직접 채취한 토양 sample을 가지고 DNA추출을 하고 DNA가 얼마나 있나 알아보는 실험이었다. 하지만 우리가 채취한 토양 sample에는 DNA추출 2번 PCR 1번의 실험 결과 모두 DNA가 없다고 나왔다. 고로, 우리가 채취한 sample은 너무 심하게 오염되었거나 아예 DNA가 없는 토양을 채취한 것이다.

자연과학| 2015.03.28| 3페이지| 1,000원| 조회(154)

미생물, PCR, 실험, 실험레포트

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DNA 추출

1. 실험제목 : DNA 추출2. 실험목적 : sample에 있는 DNA를 추출하여 얼마나 추출이 잘되었 는가를 알아본다.3. 실험기구 및 시약3.1 실험기구무게를 잴 때 사용하는 것 : 저울, 저울용 수저손에 장착해야 하는 것 : gloves용액을 옮길 때 사용하는 것 : 피펫, 팁원심분리기 : Centrifuge섞을 때 사용하는 기계 : volte x mixing추출이 된 sample의 정확한 농도를 측정할 수 있는 기계 : Nano-droppowerbead Tube3.2 시약C1,C2,C3,C4,C5,C6 SolutionC1 Solution-세포막파괴C2 Solution-침전C3 Solution-침전2C4 Solution-실리카, DNA연결고리C5 Solution-ethanol(washing)C6 Solution-DNA추출4. 실험 방법PowerBead Tubes에 0.25g의 샘플을 넣는다부드럽게 Vortex로 섞어준다.C1 Solution의 상태를 확인한다. 만약 침전물이 있다면 60℃에서 가열하여 녹여준다.C1 Solution 60㎕를 PowerBead Tubes에 넣어주고 손으로 여러번 뒤집으면서 간단하게 썪어준다.PowerBead Tubes를 수펴으로 늘어놓은 뒤 테이프로 묶고 10분동안 Vortex를 이용하여 최대속도로 섞어준다.PowerBead Tubes를 Centrifuge(원심분리기)에 넣은 두 상온에서 (10000*g)로 30초 동안 돌려준다.Centrifuge후 남은 상등액에서 500㎕를 2ml collection tube에 넣어준다,C2 Solution 250㎕을 collection Tube에 넣어준 뒤 5초 정도 Vortex로 섞어 4℃에서 5분 정도 보관한다.보관한 collection Tube를 (10000*g)로 1분동안 상온에서 돌려준다.Pellet(침전물)을 제외한 상등액을 다른 2ml collection tube에 넣어준다.C3 solution 200㎕을 collection tube에 넣어준 뒤 간단하게 Vortex로 섞고 4℃에서 5분 정도 보관한다.보관한 collection tube를 (10000*g)로 1분동안 상온에서 돌려준다.Pellet(침전물)을 제외한 상등액을 다른 2ml collection tube에 넣어준다. 이 때 750㎕이상 넣으면 안된다.C4 Solution을 사용하기 전에 섞어주고 1200㎕를 상등액에 넣어준 뒤 5초 정도 Vortex로 섞는다.collection tube에서 거의 675㎕의 상등액을 버린다.C5 Solution 500㎕를 넣은 뒤 (10000*g)로 30초 동안 상온에서 돌려준다.Spin Filter를 통과한 통과액을 버린다.Spin Filter를 (10000*g)로 1분동안 상온에서 돌려준다.Spin Filter를 주의해서 다른 Collection Tube에 넣어준다.C6 solution 100㎕를 Spin Filter에 넣는다.Collection Tube를 (10000*g)로 30초 동안 상온에서 돌려준다.Spin Filter를 버리고 Collection Tube의 남은 DNA를 Nano-drop을 이용하여 분석한다.5. 실험결과 및 고찰5.1 실험결과1차A-260 10mm pathA-280 10mm path260/280Sample1(뒷산)-0.043-0.0960.448Sample2(잔디밭)-0.063-0.0820.768Sample3(헬스장)-0.199-0.1421.4012차A-260 10mm pathA-280 10mm path260/280Sample1(뒷산)0.2410.1241.95Sample2(잔디밭)0.036-0.022-1.64Sample3(헬스장)0.037-0.001-31.825.2 고찰이번 실험의 목적은 우리가 직접 sample을 가져와서 DNA추출해 얼마나 얻어졌는지 알아보는 실험이었다. 분광광도계로 DNA를 측정한 이상적인 값은 260/280이 1.8~2.0이다. 이 값이 나오면 순도가 높은 것으로 볼 수 있는데, 그 이하의 값은 단백질의 비율이 높다는 것이고 그 이상의 값은 순도가 높거나 DNA가 분해되었다는 것을 의미한다. 우리 조가 1차 2차 실험결과가 있는 이유는 1차에 값이 나와서 다시 한번 실험을 했다. 2차 실험의 sample 1(뒷산)을 제외하고는 만족스러운 결과를 얻지 못했다. 실험 결과 우리의 실험은 단백질의 비율이 월등히 높은 것을 알 수 있었다. 정확도가 떨어지는 이유로는 경험이 적은 실험자가 실험 도중 실수를 했을 경우가 가장 유력하며, DNA의 값이 낮게 측정되는 것으로 보아 마지막에 DNA를 다시 결합시키는 C6의 작용이 효과적이지 않았을 것으로 추측할 수 있다.

자연과학| 2015.03.28| 3페이지| 1,000원| 조회(692)

미생물, DNA, 실험, 실험레포트, DNA추출

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