실험 목적플라스미드라는 염색체이외의 자가복제 DNA의 분리를 통하여 DNA의 추출 및 정제방법의 원리를 배우고, DNA의 이화학적 특성을 이해한다.실험 이론DNA- 자연에 존재하는 두 종류의 핵산 중에서 디옥시리보를 가지고 있는 핵산- 유전자의 본체를 이루며 디옥시리보핵산이라고도함- 나선구조를 이루는 뼈대와 염기로 구성- 뼈대는 단당류인 디옥시리보에 인산기가 결합되어 있는 신 사슬형태- 염기에는 탄소와 질소로 된 고리가 하나인 피리미딘과 2개의 고리로 된 퓨린이 존재- 피리미딘 염기 = 우라실(U), 티민(T), 시토신(C) 퓨린 염기 = 아데닌(A), 구아닌(G)- DNA가 이중나선을 이루고 있을 때, 각각의 퓨린은 하나의 피리미딘과 수소 결합을 통해 결합 (A=T, G?C)- 핵 속에 위치해 있으며 단백질을 암호화하는 정보 운반- 1회전 = 10쌍 염기플라스미드- 세균의 세포내네 염색체와는 별개로 존재하면서 독자적으로 증식할 수 있는 DNA의 고리모양인 유전물질- 폴리뉴클레오티드 사슬의5‘말단과 3‘말단의 사이가 인산디에스테르결합으로 결합한 환형화된 1중나선 또는 2중나선 DNA- 플라스미드에는 약제에 대한 저항성을 가진 내성인자(R인자), 세균의 자웅을 결정하는 성결정인자(F인자) 등이 발견됨- 플라스미드는 다른 종의 세포 내에도 전달될 수 있음Agarose gel 전기영동- 분자가 이도할 수 있으며 전기가 통할 수 있는 반고형상태의 물질을 겔(gel)이라함- Agarose gel은 주로 DNA및 RNA등 핵산의 전기영동에 사용됨- DNA나 단백질을 전기적 전하나 크기에 따라 물리적으로 분리하는 방법- DNA와 단백질은 전하를 띠고 있기 때문에 전기를 걸어주면 각 분자의 전기적 특성에 따라 전장을 이동하게 됨- DNA의 경우에는 음전하를 띠기 때문에 전장에서 양 극쪽으로 이동함- DNA나 단백질이 전장을 이동하는 속도에 가장 큰 영향을 주는 것은 분자량, 무게가 가벼울수록 같은 시간 내에 멀리 이동- DNA나 단백질이 출발 지점으로부터 얼마나 이동했는지 거리에 따라 이들의 크기를 계산 해 낼 수 있음DNA 관찰- DNA는 무색이지만 염색하면 관찰 할 수 있다.- 단순한 방법으로는 에티디움브로마이드(Ethidium Bromide)를 이용한 방법- EtBr은 DNA이중가작의 염기층 사이에 끼어들고, 이 때 자외선을 쬐면 형광을 냄- 자유분자로 겔에 존재하는 EtBr은 거의 형광을 내지 않음- 발암물질임으로 실험 시 장갑을 꼭 착용해야함실험 준비물Column, TEN buffer (TEN: Tris-Cl, EDTA, NaCl), phenol/chloroform(PCI), NaOAc, EtOH, ice, ADW, 미세원심분리기, 미세피펫, auto-lancet실험 방법1. 균주를 3ml의 배지에 overnight 진탕배양 한다.2. 13000rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거한다.3. 100μl TEN buffer에 pellet re-suspension (TEN: Tris-Cl,EDTA,NaCl. 세포벽 와해)4. 100μl phenol/chloroform(PCI)을 넣고 vortexing 한다. (phenol에 의해 단백질 변성, 분리)5. 13000rpm으로 10분간 원심분리한다.6. 새로운 1.5ml tube에 NaOAc 10μl , 100% EtOH 300μl 넣어 두었다가 5번의 상층액 50μl를 넣은 뒤 invert mix 한다.(NaOAc는 알콜에 녹아있는 DNA의 음이온을 Na+로 가려서 DNA분자의 용해도를 떨어뜨리기 위함)7. ice 위에 10분간 둔다.8. 13000rpm으로 10분간 원심분리 후 상층액을 버린다.9. 70% EtOH 1ml을 넣고 13000rpm으로 2분간 원심분리 후 상층액을 제거한다. (1.5ml tube의 벽에 붙어 있는 pellet이 떨어져서 제거되지 않도록 주의!!)10. spin-down해준 후 pipette으로 남은 상층액을 제거한다.11. 건조(상온에서 20분 or dry oven에서 10분)12. 20μl ADW를 넣어 DNA를 녹여낸다.실험 결과3. 정제한 플라스미드 DNA를 전기영동한 결과, 한 개 이상의 DNA band가 보인다면 각각의 band가 무엇을 나타내는지 설명하시오DNA는 무색을 띠나 전기영동 실험에서 붉은색 색소인 ethidium bromide가 DNA에 염색이되어 자외선을 비추면 DNA Band가 보기에 된다. 추출한 플라스미드의 DNA가 한 개 이상인 이유는 DNA정제 과정중 플라스미드에 삽입이 되는 EtBr분자수가 증가함에 까라 압력이 증가하여 양성의 초나선형 회전이 생겨 꼬이게 된다. 꼬임에 의해 더 이상 DNA밀도 감소가 일어나지 않아 상대적으로 EtBr이 많이 들어간 선형 DNA는 밀도가 낮아 전기영동시 분자량 차이에 의해 여러 가지 band가 보이게 되는 것이다.실험 고찰이번실험은 원핵생물에 존재하는 플라스미드라는 환형 DNA분자의 DNA를 알칼리- SDS 법으로 추출해보는 실험이었다. 알칼리 SDS법의 원리는 강 알칼리성인 SDS용액으로 플라스미드 단백질 변성을 통해 EtBr이라는 염색물질을 첨가 하고 밀도차를 발생시켜 플라스미드 DNA를 얻는방식이다. 원심분리 과정과 용액의 화학반응으로 생긴 DNA만을 골라내러 실험하는 과정이 만하 시간이 오래걸리고 세밀한 작업이 많았다. 추출을 한 DNA를 눈으로 볼 수 있게 아가로스 전기영동 장치를 이용한다. 아가로스 전기영동은 전압을 걸어 주었을 때 미세한 구멍이 많은 구조로 변하는 겔이라는 물질을 이용한다. 이 구멍사이사이를 분자량이 서로 다르고 음전하를 띤 플라스미드 DNA분자들이 + 극으로 이동하면서 무게의 차이에 의해 DNA 종류마다 띠가 생기게 된다. 멀리 이동할 수록 가벼운 DNA, 가깝게 이동할 수록 무거운 DNA라 할 수 있겠다.
실험 결과 보고서1. 실험결과1) 아밀라아제의 활성에 미치는 온도의 효과50℃37℃15℃무처리 전분BlankOD at520㎚0.8870.7990.8010.0550.0002) 아밀라아제 활성에 미치는 pH의 효과pH 3.5pH 5.5pH 9.0무처리 전분BlankOD at520㎚0.58501.18100.06000.0550.0002. 상기의 실험 결과를 히스토그램으로 표시하시오.1) 온도의 효과2) pH의 효과이번 실험은 pH와 온도가 효소 작용에 어떤 영향을 미치는지에 대해 알아보는 실험이었다.이론적으로는 잘 알고 있는 실험 내용이었기에 별 부담 없이 실험을 할 수가 있었다.우선 tube에 amylase와 전분, 반응버퍼용액의 적량을 넣을 때 주의할 점은 이 용액들이 시간이 지남에 따라 침전물이 생기는 경우가 있을 수 있는데, 그런 경우 vortex를 상용해 침전물을 잘 섞어 주어야 한다.그리고 사용용액에 대해 한 가지 궁금한 점이 있었다. 적정용액 D를 만드는 것에 대한 것이었다. 적정용액 D란 무수Na_2 CO_35g, potassium sodium tafarate [COOKCN(OH)CH(OH)COONa+H_2 O] 5g,Na_2 SO_440g을 170ml의 탈이온수에 넣고 잘 녹인 후 200ml 취한 적정용액A와 60ml의 탈이온수에CuSO_4 ? 5H_2 O6g을 넣고 잘 녹인 적정용액 B를 각각 12.5ml, 0.5ml 섞어서 만든 용액이다. 여기서 주의해야 할 것은 적정용액 D를 실험 바로 전에 만들어야 한다는 점인데 그 이유가 궁금했었다. 이유는 아마Cu이온은Cu^2+도 있고Cu^+도 있을 수 있는데 우리가 필요한 구리 이온은Cu^+이다. 그런데 적정용액 D를 미리 만들어 놓으면Cu의 산화가 계속 이어나서 우리가 원하는Cu이온을 얻지 못하기 때문일 것이다.또 한 가지의 주의 점은 이번 실험에는 굉장히 많은 용액을 첨가하는데 vortex를 이용하여 그 많은 용액들을 잘 섞어 주어야 정확한 결과가 나올 수 있다는 것이다.이런 점들에 주의해서 실험을 한 결과 온도에 차이를 둔 실험에서는 50℃의 흡광도는 0.618, 37℃ 0.053, 15℃ 0.08 이란 수치가 나왔다. 수치가 클수록 분해가 잘되었다는 증거인데 우리가 예상한 온도 37℃가 아닌 50℃에서 가장 큰 수치가 나왔다.이는 아마도 아밀라아제에도 여러 종류가 있는데 그중 50℃에서 활성이 가장 잘되는 아밀라아제로 실험을 하여서 그렇게 나온 것이 아닌가 싶다.그리고 37℃보다 15℃에서 흡광도가 높게 나온 것은 실험에 사용된 기기의 고장으로 인한 오차라고 생각된다.2번째 pH에 차이점을 둔 실험은 pH 3.5는 0.5850 pH 5.5는 1.1810 pH 9.0는 0.0600 이라는 수치가 나왔는데, 아고 있기로는 amylase는 pH 7-8정도에서 가장 활성화 되는 것으로 알고 있는데 pH 7-8 범위인 실험 tube가 없어서 잘은 모르겠으나 염기성보단 산성에서 amylase는 더 활성화가 잘 되는 것 같다. pH 9.0보단 pH 3.5에서 더 큰 수치를 보이는 이유로 알 수 있다.
![[결과]온도 pH가 효소반응에 미치는 영향](https://image4.happycampus.com/Production/thumbnail/2013/09/22/data11848656-0001.jpg)
