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메틸 살리실레이트

메틸 살리실레이트 (Methyl salicylate ) 의 비누화 반응1. 실험목적 메틸 살리실레이트 (methyl salicylate ) 를 염기 조건하에서 반응시켜 살리실산 (salicylic acid) 을 합성한다 .1. 실험이론 비누 비누는 세수하거나 빨래할 때 쓰는 계면활성제로 지방과 수산화 나트륨의 중합 반응에 의해 생성된 다 .지방산 - 지방산은 탄소원자가 사슬처럼 길게 연결된 끝부분에 카르복실산이 붙어있는 분자 . 1. 포화지방산 포화란 말은 탄소사슬에 수소가 최대한 붙어있는 상태 . 즉 , 수소로 포화되었다는 뜻임 . 따라서 포화지방산은 안정한 분자이며 차곡차곡 잘 쌓이기 때문에 실온에서 고체 .2. 불포화 지방산 불포화 지방산은 중간의 탄소사슬이 이중결합을 하고 있어 수소가 적게 붙어있는 상태 . 이중결합 부분에서 꺾이기 때문에 모양이 중간이 꺾인 모양 . 분자들이 규칙적으로 배치되지 않아 실온에서 액체상태로 존재 . 수소가 부족한 부분의 개수가 하나일 때는 단일 불포화지방산 , 둘 이상 일때는 다중 불포화지방산이라 함 .비누화반응 에스테르화의 역반응으로 에스테르가 가수분해 반 응을 일으켜 카복시산과 알코올을 생성하는 반응 촉진제로 산 또는 알칼리를 첨가하며 알칼리를 첨 가하는편이 효과가 크다 . R-COO-R' + XOH → R-COO-X + R'OH가수분해 가수분해는 화학 반응시 , 결합 부분에 물이 끼어들어가면서 원래 하나였던 큰 분자가 두 개로 분해되는 반응 유기화합물의 가수분해의 예로 카르복시산 에스테르와 물의 반응을 들 수 있다 . 에스테르의 일반식은 RCO-OR′ 이고 , R 와 R′ 은 원자단이다 . 예를 들어 R 와 R′ 이 모두 메틸기 (CH 3 ) 이면 에스테르는 아세트산메틸이다계면활성제 1. 수용액 속에서 그 표면에 흡착하여 그 표면장력을 현저하게 저하시키는 물질 . 2. 일반적으로 서로 반대 성질인 물과 기름에 대하여 친화성이 있다 ( 양친용매성 ). 3. 친수성 부분과 소수성 부분으로 이루어짐 .계면활성제는 일정 농도 이상에서 계면활성제 분자들끼리 모여 구조를 형성한다 . 미셀의 소수성 부분은 중심부에 모여 핵을 형성하 고 친수성 부분은 물과 접촉하는 외곽 부분을 형성 한다 . 기름과 같이 소수성 물질은 미셀의 안쪽 부분 에 위치하게 되어 안정화 되고 물에 녹게 되는데 이 를 용해화 ( solubilization ) 라 하며 이는 세제 작용의 기본 원리이다 . 미셀 (micelle)계면활성제는 보통 1 ％ 농도에서 물의 표면장력 72mN/m 를 30mN/m 이하로 감소시킴 . 수용액에서 계면활성제의 농도가 어느 정도 높아지면 , 단순분산상태였던 계면활성제가 집합체 ( 미셀 ) 를 형성 .계면활성제의 종류 1. 음이온계 계면활성제 ( 음이온 계면 활성제 ) 물속에서 해리될 때 음이온이 된다 . 친수기로 카르복시산염 , 술폰산염 , 인산염 구조 카르복시산염계로 비누의 주성분인 지방산 나트륨 이나 술폰산염계로 합성세제에 많이 사용되는 알킬 벤젠술폰산 나트륨과 Polyacrylamide 전기 영동에 이용되는 라우릴 황산 나트륨 등이있다 .2. 양이온계 계면활성제 ( 양이온 계면 활성제 ) 물속에서 해리될 때 양이온이된다 . 친수기로 4 급암모늄염을 포함 . 대전방지제 , 린스 , 유연제 등에 이용된다 . 3. 양성 계면활성제 분자 내에 음이온 가능 부위와 양이온 가능 부위를 모두 가짐 . 용액의 pH 에 따라 양이온 혹은 음이온이된다 . 화장품에 사용된다 .4. 비이온성 계면활성제 친수부가 비전해질 . 즉 , 이온화하지 않는 친수성 부분이 있는 것 알킬글리콜 같은 저분자 계열 또는 폴리에틸렌 글 리콜과 폴리비닐 알코올과 같은 고분자 계가 존재 한다 .계면활성제의 이용 화학반응에서 두 개의 물질들이 두 개의 층으로 나 뉘어져 섞이지 않을 때 계면활성제를 이용한다 . Ex) 1- 클로로옥테인 과 나이트릴의 반응알데하이드와 케톤의 친핵성 첨가 반응 알데하이드와 케톤의 가장 일반적인 반응은 카보닐기의 친전자성 탄소에 친핵체가 첨가되는 친핵성 첨가반응 ( nucleophilic addition reaction) 이다 . 친핵체는 탄소와 새로운 결합을 형성하기 위하여 자신의 전자쌍을 사용하기 때문에 , 탄소 - 산소 이중 결합으로부터 두 개의 전자는 전기음성도가 큰 산소 원자로 이동 . 카보닐 탄소는 반응이 일어나는 동안 sp 2 에서 sp 3 로 재혼성 , 정사면체 구조를 가지게 된다친핵성 아실 치환 반응 초기에 형성된 정사면체형 중간체에서 원래 카보닐기 탄소에 결합된 두 치환기 중의 한 개가 제거되고 , 알짜 친핵성 아실 치환 반응에 이르게 된다 . 모든 산 유도체들의 화학은 서로 비슷하고 친핵성 아실 치환반응과 같은 한 종류 반응이 지배적 .에스터의 반응 에스터는 산이나 염기의 존재하에서 물에 의해 가수분해되어 카르복실산이나 카르복실산 염을 생성한다 .염기성수용액에서의 에스터 가수분해 메커니즘 ( 비누화반응 )산성 수용액에서의 에스터 가수분해메틸 살리실레이트의 비누화 반응 ( 카르복실기보다 Ka 값이 크므로 먼저 해리 ) - 비누화 반응에서 CO-R' 결합보다는 C-OR' 결합 절단이 일어남3. 시약 및 기구 1.Methyl salicylate ( 2-Hydroxybenzoic acid methyl ester) Molecular formula : C 8 H 8 O 3 Molar mass : 152.1494 g/mol Density : 1.174 g/cm ³ Melting point : -9 °C Boiling point : 220 - 224 °C 물에 잘녹지 않으며 에탄올 에테르등과 같은 유기용매에 잘 녹는다 .2. Sodium hydroxide Molecular formula : NaOH Molar mass : 39.99711 g/mol Appearance white solid, hygroscopic Density : 2.13 g/cm3 Melting point : 318 °C Boiling point : 1388 °C3. Salicylic acid Molecular formula : C 7 H 6 O 3 Molar mass : 138.12 g mol−1 Density : 1.443 g/cm3 Melting point : 159.0 °C Boiling point : 211 °C (20 mmHg) Solubility in water 0.2 g/100 ( mL ) H2O환류냉각기 100ml 분별깔대기 100ml 이구 둥근바닥 플라스크 , 250ml 삼각플라스크 감압플라스크 뷰흐너깔때기 TLC 전개통 자석 젓개 및 가열판 높낮이 받침대 가열 망태기 자석 스핀바 녹는점 측정기 변압기4. 실험방법 반응 1. 100ml 이구 둥근바닥 플라스크에 메틸살리실레 이트 2.2ml(2.5g, 16.7mmol, 1.0eq) 를 넣는다 . 환류 장치를 준비하고 반응을 모니터하기 위해 TLC 3~4 개 정도 찍어 둔다 . 2. 10ml 삼각플라스크에 얼음중탕을 설치하고 25ml 의 물을 담고 , 여기에 소듐하이드록사이드 5.0g(125mmol, 7.5eq) 을 넣는다 .3. 2 번에서 준비한 소듐 하이드록사이드 수용액을 1 번에 천천히 가하고 , 자선 스핀바를 넣고 교반한다 . 4. 환류하면서 30 분이 지나면 TLC 를 찍어 반응여부 를 판단한다 . ( 전개용매는 에틸에세테이드 : 헥세인 =1:9) ( 메틸 살리실레이트의 Rf 값 =0.54) 5. 반응이 완결되면 열원을 제거하고 실온에서 식힌 다 .반응 마무리 1. 용액이 충분히 식었으면 반응물을 250ml 삼각 플 라스크에 옮기고 3.0M 황산을 pH=2 가 될 때까지 천천히 가한다 . 2. 충분한 결정이 발생하면 감압 필터하고 , 건조 시 킨후 반응 생성물의 무게를 잰다 . 필터하는 동안 가열판에 100.0ml 의 물을 올려놓고 끓을 때까지 가열한다 .3. 2 번에서 얻은 반응 생성물을 삼각 플라스크에 넣 고 , 끓는 물로 재결정한다 . 4. 결정이 충분히 녹은 후 실온에서 천천히 식힌다 . 결정이 생성되면 감압 필터하여 자연 건조한 후 녹 는점을 측정하고 , 수율을 계산한다 .5. 결과 값 처리 1:1:1 반응 C 6 H 4 (OH)COOCH 3 3.00mL(2.55g,16.7mmol) NaOH 5.10g (126.0mmol) 한계반응물이 C 6 H 4 (OH)COOCH 3 이므로 16.7mmol 로 계산 C 6 H 4 (OH)COOCH 3 + NaOH ⇆ C 7 H 4 O 3C 7 H 4 O 3 와 C 6 H 4 (OH)COOH 가 1:1 C 6 H 4 (OH)COOH 의 분자량과 몰수를 이용하여 계산 138.12g/mol × 0.0167mol = 2.307g 이론적으로 얻어지는 살리실산의 g 수 = 2.307g C 7 H 4 O 3 + H 2 SO 4 → C 6 H 4 (OH)COOH{nameOfApplication=Show}

자연과학| 2012.11.21| 32페이지| 1,500원| 조회(516)

계면활성제, 비누화반응, 살리실레이트, 결과값처리

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단백질_정량_

단백질 정량 (Bradford 법 )실험 목적 어떤 영양소의 함량을 알아볼 수 있는 정량 분석을 통하여 단백질의 정량을 알아보고 단백질의 미지 시료를 확인해 보도록 한다 .단백질 정량분석법 시료 내에 포함된 단백질의 양 또는 농도를 구하는 과정 . 단백질의 양을 정량하기 위해서는 단백질의 본질 , 단백질 시료에 있는 다른 성분들의 본질 , 정량분석의 신속도 및 정밀도 등에 따라서 적당한 방법을 선택해야 한다 . 단백질을 정량하는 방법 - Colorimetric 방법 : Lowry, Bradford, Biuret , kjeldahl , Bicinchonic Acid, UV 법 등 - Electrophoresis 방법 : SDS 겔 전기영동 ,단백질 정성분석법 단백질은 여러 종류의 시약과 반응하여 고유의 색을 나타내는데 이것은 단백질을 구성하고 있는 특수한 아미노산의 잔기나 카르복실기 또는 아민기와의 반응으로 나타나는 정색반응이다 . 이 반응을 통하여 단백질의 유무를 확인할 수 있다 . 단백질을 정성하는 방법 Biuret , Ninhydrin , Xanthoprotein , Millon , pauly , Hopkins-Cole , Sakaguchi , Nitroprusside 반응 등Lowry 법 이 방법은 단백질 사슬의 아미노산에서 구리이온 (+2) 의 아마이드 결합으로 환원 (+1) 되는 정도를 측정하는 방법이다 . Cu + -peptide bond complex + Folin 시약 ( 노란색 ) → 환원된 Folin ( 청록색 ) 준비과정과 준비 시약이 복잡하지만 , 5㎍/㎖ 의 낮은 농도까지 측정할 수 있어서 널리 쓰인다 . 정량을 위해서는 농도를 알고 있는 단백질 표준 용액 ( 보통 bovine serum albumin,BSA ) 을 농도별로 만들어 시료와 동일한 조건에서 발색시키고 발색의 강도는 단백질의 농도에 비례하므로 시료의 발색 정도와 단백질 표준 용액의 발색 정도를 비교하여 시료에 들어있는 단백질의 양을 결정한다 .Lowry 법의 장단점 장점 -때문에 단백질 용액에 포함된 시약의 조성을 고려할 필요가 있다 .Biuret 법 두 개 이상의 펩티드 결합을 가지고 있는 화합물들은 알칼리성 용액에서 묽은 황산구리로 처리하면 자주색을 띠는 물질을 생성한다 . 색깔은 구리 원자와 두 개의 펩티드 사슬에서 오는 네 개의 질소원자들 사이에서 배위화합물이 형성됨으로써 생긴다 .Biuret 법 시료에 CuSO 4 또는 rochelle 염과 CuSO 4 를 가하여 540~560nm 로 흡광도 측정 CuSO 4 와 NaOH 의 혼액을 시료에 혼합하여 263nm, 310nm 의 흡광도를 측정 비교적 많은 양 (1~20mg) 의 단백질을 정량하는 데 쓰이는 방법이다 . 발색의 차이가 적고 계면 활성제의 영향을 받지 않는다 .Biuret 법의 장단점 장점 - 단백질의 종류에 따라 발색율의 변동이 작다 . - 시약의 조제 , 조작이 간단하다 . - 모든 단백질에 대해서 재현성이 좋다 . 단점 - 감도가 나쁘다 . - 다량의 당류가 공존되거나 proline 을 함유한 펩티드에서는 정색이 나빠 낮은 값을 나타낸다 . - 유사한 파장의 공존물질에도 방해된다 . - 비교적 많은 양 (1 내지 20mg) 의 단백질을 정량 하는데 사용가능하고 소량일 때 불가능하다 .Biuret 법 실험 방법 10 개의 시험관을 시험관 꽂이에 꽂고 각 시험관에 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 및 1.0 의 번호를 부여한 후 각 시험관에 단백질 표준용액을 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 및 1.0㎖ 를 가한다 . 각 시험관에 증류수를 가하여 시험관의 부피를 1㎖ 가 되게 한다 . Biuret 시약을 각 시험관에 가하여 최종부피를 5㎖ 가 되게 한다 . 37℃ 의 항온기에 20 분간 방치한다 . 540㎚ 에서 각 시험관의 흡광도를 측정하고 검량선을 작성한다 .Biuret 법 실험 방법 Biuret 법에 의하여 작성된 검량선Kjeldahl 법 단백질 또는 질소를 포함하는 유기0% NaOH 을 가하여 강 알카리성으로 한다 . * 30% 수산화나트륨을 가하고부터 수분간 암모니아의 대부분이 발생하므로 특히 주의하지 않으면 안 된다 . 15∼20 분간 증류하여 적색 리트머스지로서 암모니아가 완전히 증류했는지 확인한 후에 삼각플라스크를 냉각관의 끝 부분에서 약간 떼어 다시 2∼3 분간 증류를 계속한다 . 다음에 냉각관의 끝 부분을 증류수로 잘 세척하여 삼각플라스크를 냉각관 에서 떼어낸다 . 그 후 불을 약하게 하고 콕크 a 를 열고 b 를 닫아 증류 flask 의 액을 역류병 (D) 으로 역류하게 한 다음 증류를 준비한다 .Kjeldahl 법 실험 방법 3. 적정 암모니아를 포함한 삼각플라스크 중에 남아있는 N/10 황산용액을 methyl red 및 methlene blue 혼합지시약을 사용하여 N/10 수산화나트륨 용액으로 적정 한다 . 이상의 증류 , 중화 적정조작을 3 회 반복하여 평균치를 취한다 . 4. 계산 조단백질 (%) = (b-a)/S ×F×0.0014×V×6.25×100 a : 본실험에 대한 N/10 NaOH 용액의 적정치 (㎖) b : 공실험에 대한 N/10 NaOH 용액의 적정치 (㎖) S : 사료 평취량 (g) F : N/10 NaOH 용액의 역가 (g) V : 희석배수 0.0014 : N/10 NaOH 용액 1㎖ 에 상응하는 질소량 (g)Kjeldahl 법의 4 가지 단계 1. 분해반응 시료 중의 질소 ( N) + H 2 SO 4 → (NH 4 ) 2 SO + CO 2 + CO +H 2 O 2. 증류반응 ( NH 4 ) 2 SO 4 + 2NaOH → 2NH 3 + Na 2 SO 4 + 2H 2 O 3. 중화반응 2 NH3 + H 2 SO 4 → (NH 4 ) 2 SO 4 + H 2 SO 4 ( 잔여 ) 4. 적정반응 H 2 SO 4 ( 잔여 ) + 2NaOH → 2NaSO 4 + 2H 2 O분광법 (Spectroscopy) 분자의 구조와 성질을 규명하기 위해 분자 내의 에너지와 빛 에너지 사이의 상호작용을 이용하는 ionic strength 에 의해서 영향을 많이 받는다 .UV 법 주의사항 A280/A260 비는 단백질이나 핵산의 순도를 판단하는 기준으로 사용된다 . Glass cuvette 은 UV 를 흡수하므로 반드시 quartz 를 사용한다 . 단백질 정량식 [protein(mg/ml]=(1.55*A280)-(0.76*A260) 정확한 정량을 위해서는 알고 있는 농도의 단백질로 standard curve 를 잡는 것이 좋다 . Blank buffer 는 단백질을 녹인 용액과 동일하게 한다 . 만약 샘플의 A280 이 2 이하이면 샘플을 더 희석하지 않아도 되지만 , 2 이상이면 더 희석해야 한다 .BCA 법 Bicinchoninic Acid Assay. Pierce 방식이라고도 한다 . 샘플내에 있는 단백질 양을 측정하고자 할 때 쓰이는 것으로서 , 단백질이 구리 이온 Cu 2+ , Cu 1+ ) 을 환원 시킬 수 있는 성질을 이용한다 . 단백질에 의해 환원 된 구리 이온은 BCA 용액과 반응을 해서 , 보라빛의 화합물을 생성하게 된다 . 이 화합물은 빛의 특정 영역 (562nm) 에서 구리 이온이 담긴 용액과 BCA 용액 각각보다 빛의 흡수율이 높기에 , 분광광도계를 사용해서 측정하면 흡수율 차이를 측정할 수 있다 .BCA 법 BCA 법은 Lowry 법을 계량한 것으로 Folin 시약의 반응대신 BCA 가 구리이온과 복합체를 형성해 자색으로 발색되는 반응을 이용한 것이다 . 이 반응은 2step 으로 일어난다 . Step 1. protein + Cu 2+ + OH - → Cu + Step 2. Cu + + 2BCA → Cu + /BCA chromophore (562nm)BCA 법의 측정범위 standard assay 의 경우 10~1200 g/ml, microassay 는 0.5~10 g/ml 의 범위에서 가능 . BCA Assay Standard CurveBCA 법의 장단점 장점 - 일반적인 버퍼물질에 간섭을 덜 받는다 . - 높은 온도에서 한다면 아주 민감하고도를 파악하기 위해 표준 단백질의 검량선을 구하여 비교 산출 4000 이상의 펩타이드나 단백질은 모두 측정가능 → 측정범위 :25~200㎍/㎕ protein solution 이고 최소 2.5㎍/㎕ 단백질의 0.1㎕ 까지 측정가능Bradford 법 coomassie briliant blue 염료 → 단백질과 결합 전 : 465nm 에서 최대 흡광도를 가지는 적갈색을 형성 → 단백질과 결합 후 : 595nm 에서 최대 흡광도를 가지는 청색으로 변화 595nm 에서 흡광도는 단백질의 농도와 비례Bradford 법의 장단점 장점 - 발색 반응이 2 분 이내에 완결 ( 속도빠름 ) - lowry 방법보다 감도가 좋음 (25㎍/㎕~200㎍/㎕) 단점 - 단백질이 아닌 것들 , 지방에 대한 간섭 많이 받음 - 계면활성제의 영향을 받기 쉬움 - 지질을 함유하는 샘플 : 침전 생성 , 단백질 변성Bradford 와 Lowry 법의 차이점 Bradford - Coomassie Blue G 염색약이 단백질과 결합함으로서 생기는 파장의 변화 측정 . - 단백질이 아닌 다른 것 간섭을 많이 받음 . - Coomassie Blue G 염색약과 결합하는 정도가 조금씩 다름 . Lowry - 단백질의 아마이드 결합에 의한 구리이온의 환원을 토대로 측정 (Cu2+ -- Cu1+) - Bradford 방법보다는 단백질간의 차이가 거의 없는 정확도를 보여준다Bradford 법 실험 방법 1. 표준측정 방법 ① 10~100㎍ 의 단백질 용액 100uℓ 을 시험관에 취한다 . ( 단백질의 농도를 모를 경우 원액 , 10, 100 또는 100 배 희석액을 취한다 .) ② 검량곡선을 얻기 위하여 10, 20, 40, 60, 80 및 100uℓ 의 단백질 용액 (1㎎/㎖ BSA 또는 γ-globulin) 을 시험관에 각각 취하고 증류수를 가하여 100uℓ 이 되게 한다 . 공시험으로 시료 대신에 증류수를 100㎕ 을 취한다 . ③ 증류수 4㎖ 를 시험관에 가하고 염색시약 1㎖ 을 시험관에 가하고 , 거}

자연과학| 2012.11.21| 38페이지| 1,500원| 조회(151)

단백질, 단백질 정량, Bradford 법

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SDS-PAGE

SDS-PAGE목 차1.실험목적 2.실험원리 - 전기영동 - SDS-PAGE 원리 - Disc(불연속시스템) - 염색기법 - BUFFER 3. 시약및 기구 4. 실험 방법1.실험 목적SDS-PAGE를 이용한 단백질 전기영동으로 단백질을 분리하고, 미지 분자량을 측정해본다.2. 실험 이론전기영동 (electrophoresis) - 단백질(protein)이나 핵산(amino acid) 등의 고분자물질은 하전(charge)을 띰. - 이를 기초로 하여 이들 분자를 전기장을 띤 매질(gel)에서 이동 분리시켜 이들의 순도나 성질의 분석 및 분리 등에 사용하는 방법.전기영동의목적 ① 원하는 단백질의 유무 확인 ② 단백질의 분리 정도 확인(순수도) ③ 분자량을 이미 알고 있는 단백질을 비교하여 분자량 산출전기영동 BUFFER선택 1.TAE(Tris-acetate EDTA) - DNA agarose 전기 영동 시 주로 사용, 분자량 큰 경우 사용 2. TBE(Tris-borate EDTA) - DNA 분자량이 작은 경우, 염기서열 분석 시 사용 - RNA 전기영동 시 사용 3. SDS-PAGE Running Buffer - 단백질을 크기별로 분리 시, SDS-PAGE를 할 때 사용 - Glycine에 의해 크기별 분리 가능 - SDS에 의해 단백질의 변성된 형태로 이동 유지전기영동시 Gel의 선택 1. Gel 의 종류에 따라 -Agarose gel : 분자량 100bp~20kbp -Polyacrylamide gel(PAGE) : 분자량이 작을때 (10bp~1000bp) 2. 분리하고자 하는 물질에 따라 -DNA : Agarose gel, PAGE -RNA : Formaldehyde Agarose gel -Protein : SDS-PAGE※DNA 전기영동과 단백질 전기영동의 차이 - DNA 전기영동은 DNA 자체가 포스페이트 그룹에 negative charge를 띠고 있어서 따로 처리를 하지 않고 곧바로 로딩을 해도 정상적으로 전기영동이 된다. - 반면에 단백질은 charge gel electrophoresis) -단백질을 음전하로 코팅하여 polyacrylamide gel 에서 단백질 분자량에 따라 전기영동하는 방법. -polyacrylamide gel 은 polyacrylamide 와 bis-acrylamide 등으로 구성되며 두 물질은 서로 연결되어 구멍을 형성한다. -분리되는 원리는 단백질과 겔의 충돌에 의한 저항의 차이를 이용한다.SDS(Sodium Dodecyl Sulfate) -계면활성제의 일종, 단백질이나 핵산의 구조를 깨뜨려 선형으로 만들어주는 역할. -아미노산 두 개에 SDS 한 개가 binding하는 정도의 비율로 결합. -SDS분자의 긴 소수성 꼬리가 단백질의 골격을 감싸면서 음전하를 띈 꼬리의 끝부분이 밖으로 향하게 되어 단백질은 본래 가지고 있던 전하와 관계없이 -전하를 띄게 됨.PAGE(poly acrylamide gel electrophoresis) -acrylamide의 중합반응으로 만들어진 gel을 이용한 전기영동법. -acrylamide를 가교제로 중합한 polyacrylamide gel은 가교제의 농도 및 비율에 의해 gel내 미세통로의 크기를 조절할 수 있어 다양한 크기의 생체 분자들을 분리할 수 있음. -polyacrylamide gel은 acrylamide 측쇄 가능기가 2개의 기능기를 가지는 화합물에 의해 비가역적으로 중합되어 형성된 polymer이다.PAGE(poly acrylamide gel electrophoresis)Disc(discontinuous) gel electrophoresis -gel을 불연속적인 두 개의 층으로 만들어 전기영동을 실시하는 방법. -두 개의 불연속적인 gel은 각각 stacking gel, running gel(separating gel) 두 gel의 조성은 거의 동일하나 pH가 다르다는 차이점을 가짐. -stacking gel의 pH는 6.8, running gel의 pH는 8.8Stacking gel - acrylamide농도가 3~5%인 것을 사용고자 하는 단백질의 크기에 따라 6~15%를 사용하며 pH는 8.8 -이동속도 : 단백질이온 glycine Cl- -이동중인 이온들이 running gel에 이르게 되면 running gel의 높은 pH는 glycine이온을 음전하로 강하게 대전시켜 glycine의 이동속도가 단백질보다 빠르게 되며 단백질은 gel내에서 molecular sieving현상에 의해 분리된다.Stacking gel과 running gel의 이동 stacking gel running gelPI (isoelectric point, 등전점) -아미노산은 pH에 따라 산과 염기로 이온화가 가능하며, 따라서 아미노산의 결합체인 단백질도 pH에 따라 고유의 전하를 띄게 된다. -이와 같이 단백질 같은 zwitterion의 net charge가 0이 되는 pH를 그 물질의 PI로 부른다. -예를 들어 glycine의 PI는 pH6.2 이다.단백질 spot의 검출 - 2차원 전기영동에서 분리된 각 단백질의 검출을 위하여 일반적으로 염색법을 활용. - CBB(Commassie Brilliant Blue) 염색법 : 염색에 의해 단백질이 수식되지 않는다는 이점, 또 이후의 단백질 해석(질량분석)에도 지장을 주지 않음.BUFFER - 완충용액 : 용액의 pH 일정하게 유지하여, 단백질을 외부로부터 안정하게 유지 시켜준다. - 1.5M Tris-HCl(pH8.8), - 0.5M Tris-HCl(pH6.8) - Loading buffer : SDS, glycerol등이 들어가고, 단백질이 물에 뜨지 않고 가라앉게 하는 역할을 해준다. - Running buffer : 전기영동용 완충용액이다. Glycine과 HCl이 포함되어 있어 용액에 전기가 잘 흐르게 해주며, 단백질들이 어디까지 내려가고 있는지 확인할 수 있다.3. 시약 및 기구기구 tube, micropipet, tip, heater, 전기영동장치시약 ① 40% acrylamide - 화학식 : CH2=CHCONH2 - 무색결정 - polymeri 역할 -산화가 잘됨.⑤ TEMED(N,N,N',N'- tetramethylethylenediamine) - 분자식 : C6H16N2 - APS를 사용하는 경우에는 촉매제로 사용 - persulfate로부터 자유라디칼의 생성을 촉매⑥ glycine - 분자식 : C2H5NO2 - 아미노산의 일종 SDS-PAGE에서 pH에 따른 전하의차이를 이용하여 단백질분자들을 농축시키는 역할⑦ 2-mercaptoethano - SDS와 함께 단백질을 일차구조로 만듬. - 아미노산등과 같은 단백질과 관련된 물질과 잘 반응하는 강력한 환원제. - 단백질의 s-s결합을 끊어주며, 구조를 풀어 denaturation시킴.4. 실험 방법1) 유리판을 깨끗이 닦는다 (water → D.W. → 70% EtOH) 2) Gel 장치를 조립한다.3) Running gel 준비 running gel에는 SDS가 포함되어 있으므로, inverting시 기포가 쉽게 발생하며, 발생한 기포는 쉽게 사라지지 않으므로 기포가 발생하지 않도록 조심스럽게 inverting해준다.Running gel 조성D.W.4.2ml40% acrylamide3ml1.5M Tris (pH8.8)2.5ml10% SDS100ul10% APS100ulTEMED4ul4) 유리판에 running gel을 붓는다. gel을 붓는 과정중에 기포가 생기는 것을 방지하기 위하여 micropipet을 이용해서 gel이 plate벽면을 따라 흘러내리게 하여 붓는 것이 좋다. 5) D.W를 그 위에 붓는다. 6) 실온에서 1시간 정도 굳힌다. 7) Gel 장치를 한쪽으로 기울여 D.W.를 휴지로 받아내어 제거한다.8) Stacking gel 준비Stacking gel 조성D.W.2.3ml40% acrylamide0.3ml10M Tris(pH6.8)0.38ml10% SDS30ul10% APS30ulTEMED3ul9) stacking gel을 붓고 comb를 꽂는다. - 기포가 생기지 않도록 주의해서 inverting하며,micropipet을 uffer 조성D.W.1LTris3g- 25mMglycine14.4g- 192mMSDS1g- 0.1%12) comb를 수평을 유지해가면서 서서히 뺀다. - well의 모양이 망가지지 않도록 조심스럽게 빼야한다. 완성된 gel의 형태 13) tank buffer를 하단면까지 붓는다. 14) well과 유리판 하단면의 bubble을 syringe나 spoid로 제거한다.15) loading 하기 직전에 sample과 size marker를 -20℃에서 꺼내와 heating(90~95℃, 10min)을 한다. - sample을 loading하기 전에 가열하는 이유 : 꼬여있는 구조인 단백질을 완전히 선형으로 풀어내기 위함. 또한 단백질이 꼬여 있는 형태로는 SDS가 안쪽까지 침투하기 어려우므로 단백질에 열을 가해 변성시켜서 SDS가 안쪽까지 침투하여 단백질과 결합하도록 하려는 목적이 있다.sample buffer 조성SDS2-mercaptoethanolglycerolSDS16) sample loading ① loading 하기 전에 각 well에 loading 할 sample을 유리판에 표시 ② size marker : sample 20ul in 2x SDS-sample buffer ③ 남은 well에 각각 sample loading 양 만큼 sample buffer를 loading 해준다. (band broading을 막음) 17) gel running → blue dye 가 gel 바닥에 올때가지. 18) running이 끝나면 kit를 해체한 후 유리판 하나를 떼어낸다.19) stacking gel을 제거한 후 왼쪽 상단 귀퉁이를 절단하여 둔다. (위치확인 위해) 20) coomassie blue로 30분 이상 staining을 한다. (40℃정도에서 20분간 염색하면 잘됨)staning solution 조성comassie blue0.66gMethanol150mlacetic acid30mlH2O150ml21) staining 후 destaining solutihow}

자연과학| 2012.11.21| 37페이지| 1,500원| 조회(2,014)

SDS-PAGE, SDS-PAGE 원리, SDS-PAGE 실험

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pH meter 사용법 완충용액 제조(M농도 계산 및 pH측정)

pH meter 사용법 완충용액 제조(M농도 계산 및 pH측정)산과 염기아레니우스(Arrehnius)의 정의에 의하면, 산(acid)은 일반식 HA로 표시되는 물질로 물에서 해리하여 H+를 생성 염기(base)는 일반식 MOH로 표시되면 OH-를 생성한다. 브뢴스테드(Broensted) 로우리(Lowry)의 정의 산을 양성자 주게(proton donor) 염기를 양성자 받게(proton acceptor) 산-염기 반응을 양성자 이동반응으로 정의 브뢴스테드 로우리 산의 예는 HCl, NH4-,HSO4-이며, 염기의 예는 OH-, F-, NH3등이다.강산(strong acid)강염기(strong base)수용액 내에서 완전히 이온화가 일어나는 물질 HCl + H2O Cl- + H3O- 산 염기 짝염기 짝산 (강산) (강염기) (약염기) (약산) 강산의 종류: HBr, HI, HNO3, HClO4, H2SO4 강염기의 종류: LiOH, NaOH, KOH, Ca(OH)2 -약산(strong acid)과 약염기(strong base) : 수용액 내에서 불완전 이온화가 일어나는 물질pH 정의pH는 용액의 산성 또는 알칼리성의 정도 0~14의 수치로 표시 몰/ℓ로 나타낸 수소 이온 농도의 역수의 대수값 pH는 수용액중에서 수소이온 농도[H+]의 크기를 나타내는 편의적인 수치로서 수소 이온의 지수를 말한다. 순수한 물이나 수용액에서 물분자 H2O는 H+와 OH-로 극히 소량의 이온이 된다. 순수한 물은 20℃에서 1L의 물중에 10-7g(10-7mol)의 H+ 이온이 포함되어 있다. pH란 [H+] 이온 농도의 지수의 숫자만을 나타낸 것으로 순수일 경우([H+]=10-7mol/L)는 지수의 숫자가 7임으로 pH=7이 된다.pH미터 사용방법유리전극은 미리 물에 수 시간 이상 담그어 둔다. pH미터는 전원을 넣어 5분이상 경과 후에 쓴다. 검출부는 물로 잘 씻고 부착한 물은 휴지 등으로 가볍게 닦아낸다. 온도보상용 꼭지가 있는것은 pH표준액의 온도와 같게 맞추고 검출부를 시료의 pH값에 가까운 표준액에 담궈 2분 이상 된 후 pH미터의 지시가 온도에 있어서의 pH값이 되도록 영점조절용 꼭지를 조절한다. 두 점에서 조절을 한 경우에는 보통 인산염 pH표준액과 검출액의 pH값에 가까운 pH표준액을 써서 조작한다. 검출부를 물로 잘 씻고 부착한 물을 여지 등으로 가볍게 닦아 낸 다음 검출엑에 담그어 측정값을 읽는다.pH미터 사용시 주의사항전극을 휴지로 가볍게 털어내듯이 닦는다. 이때 휴지나 종이로 전극을 문지르지 않는다. pH미터의 구조 및 조작법의 상세한 것은 pH미터에 따라 다르므로 각각의 pH미터에 따른 조작법에 따라 사용하도록 한다. pH11이상의 시료는 오차가 크므로 알칼리에서 오차가 적은 특수 전극을 쓰고 필요한 보정을 한다. 시료의 온도는 pH표준액의 온도와 동일한 것이 좋다.몰농도 molarity용액 1ℓ 속에 포함된 용질의 몰수로 나타낸 농도몰랄농도 molality용액의 농도를 나타내는 단위로 용매 1kg에 녹아 있는 용질의 몰수로 나타낸 농도퍼센트 농도(percent concentration)단위 질량의 용액 속에 녹아 있는 용질의 질량을 백분율로 나타낸 농도- 몰농도는 온도에 따라 용액의 부피가 변하기 때문에 같은 몰수의 용질을 넣어도 온도에 따라 몰농도가 바뀌는 단점이 있다. 반면, 몰랄 농도나 퍼센트 농도는 부피 대신 질량을 이용하기 때문에 이러한 문제점을 보완할 수 있다. 그렇지만 용질의 종류마다 분자량이 다름에도 불구하고 단순히 질량만을 고려하기 때문에 입자 수에 대한 비교가 어렵다.물의 이온화순수한 물에는 매우 적은 양의 수소이온과 수산이온이 존재하는데 이것은 물의 이온화에 의하여 생성된 것 H2O → H+ + OH- K eq = [H+][OH- ] / [H2O] 위의 식에서 [H2O](물의 농도 : 1000 (물 1ℓ의 무게)를 /18(물의 g분자량) = 55.5 M)는 25℃의 순수한 물 속의 [H+](수소이온농도)나 [OH- ](수산이온농도)의 매우 낮은 농도(1×10-7M)에 비하면 상대적으로 매우 높고, 일정하다고 볼 수 있음 Keq = [H+][OH- ] /55.5 55.5×Keq = [H+][OH-]여기서Keq값은 물의 전기전도도 측정에 의해서 25℃에서 1.8×10-16 이라는 것을 알 수 있는데 이 값을 위 식에 대입하면 55.5×(1.8×10-16 )=[H+][OH- ] 위의 식을 풀면 1.0×10-14 = [H+][OH- ] 55.5×Keq를 기호kw로 나타내면 Kw=1.0×10-14 = [H+][OH-] 이 Kw를 물의 이온곱이라고 부르며 그 값은 25℃에서 1.0×10-14이다. 이것은 25℃의 모든 용액에 있어서 [H+]와 [OH- ]의 곱이 항상 일정한 수, 즉 1.0×10-14이라는 의미이다. 순수한 물처럼 [H+]와 [OH- ]의 두 농도가 정확히 같을 때 이 용액을 중성용액이라고 함.산 해리상수약한 산은 강한 산의 묽은 용액과 동일하게 다룰 수 없다. 강한 산은 수용액에서 100% 해리하는 반면, 약한 산은 부분적으로만 해리한다. 이와 같은 경우, 산 해리 평형의 위치는 평형식에 의하여 특정지워지며, 이 때의 평형상수를 특히 산 해리 상수라고 하며 Ka로 표시함. 일반적인 산 HA에 대해서, Ka = [H3O+][A-] / [HA]염기 해리상수암모니아와 같은 약한 염기들은 물로부터 양성자를 받아 염기의 짝 산과 OH-이온들을 생성한다. 모든 염기-해리 평형의 위치는 염기-해리 상수라고 불리우는 평형상수 Kb로 나타낸다. 약한 염기 용액에서의 평형은 약한 산 용액의 평형과 동일하게 취급됨. 일반적인 염기 B에 대해서, Kb = [BH+][OH-] / [B]Ka와 Kb사이의 관계짝 산-염기 쌍에 대하여, Ka와 Kb는 간단한 관계식으로 표시될 수 있으며, 이를 이용하여 한 값으로부터 다른 값을 쉽게 구할 수 있음. Ka x Kb = Kw 산의 산 해리 상수와 염기의 염기 해리 상수의 곱은 항상 물의 이온 곱과 동일. 이 관계식은 모든 짝 산-염기 쌍에 대하여 성립한다. 따라서, 상온에서 Ka x Kb가 1.0 X 10-14로 항시 일정하므로, 산의 세기가 증가함에 따라 짝 염기의 세기가 감소함. 평형상수를 표시할 때는 Ka나 Kb로 이중 한가지만을 나타낸다. 다른 한 가지 평형상수는 위의 관계식으로부터 쉽게 계산할 수 있음. Ka = Kw/Kb Kb = Kw/KaHenderson-Hasselbalch 식완충용액(buffer solution)어떤 용액이 외부로부터 소량의 산이나 염기가 첨가되거나 그 용액이 희석되었을 때,pH의 변화에 저항하는 용액 약산과 그 짝염기의 혼합물로 구성 약염기와 그 짝산의 혼합물로 구성 H+ 를 첨가(약산과 그 염으로 구성된 용액) A- + H+ → HA OH- 를 첨가(약산과 그 염으로 구성된 용액) HA + OH- → A- + H2O 완충용액에는 HA와 A-가 동시에 필요특정한 pH의 완충용액 제조만약에 산과 그 짝염기 염의 몰농도가 거의 같다면, 곧 [산]= [짝염기] 라면, log[짝염기]/[산]≈0 즉, pH≈pKa 이다. 따라서 완충 용액을 만들기 위하여, pKa가 원하는 pH와 비슷한 약산을 선택 [짝염기]/[산]의 비를 구하기 위해, 식 Ka=[H⁺][A¯]/[HA] 에 pH와 pKa를 대입 이 비는 완충용액을 만들 때에 몰량으로 바꿀수 있다.완충용액아세트산(CH3COOH)과 아세트산나트륨(CH3COONa)은 수용액에서 이온화하여 모두 아세트산 이온(CH3COO-)을 형성한다.완충용액혼합 용액에 산(H+)을 첨가하게 되면 용액 속의 아세트산 이온(CH3COO-) 이 반응하여 아세트산(CH3COOH)이 생성되는 역반응이 일어난다. 그 결과 증가한 H+의 양이 감소되므로 수소 이온 농도(pH)는 거의 일정하게 유지된다.완충용액반대로 염기(OH-)를 첨가하게 되면 용액 속의 H+가 OH-와 반응하여 물(H2O)이 생성된다(중화 반응). 결과적으로 용액 속의 H+는 감소하게 되므로 르 샤틀리에의 원리에 의해 아세트산(CH3COOH)이 이온화하여 H+를 생성하게 되어 평형에 도달한다(정반응). 그러므로 용액 내에서 증가한 OH-의 양이 감소되므로 용액의 수소 이온 농도(pH)는 거의 일정하게 유지된다.Buffering capacitypH range와 몰농도에 관계 높은 농도의 완충용액은 pH 변화에 대하여 보다 효과적 완충용액의 최대 완충작용은 pK 값 부근산 염기 적정*산 염기 적정 - 산과 알칼리의 중화반응을 이용해서 정량하는 방법 시료가 산(또는 염기)일 때 표준용액은 염기(또는 산)가 되며, 표준용액을 적정액이라고 부른다. H⁺ + OH⁻ - H₂O - N노르말농도의 산용액 Vmol이 N'노르말농도의 염기용액 V'mol이 중화할 때 다음식 성립 NV=N'V'{nameOfApplication=Show}

자연과학| 2012.11.21| 25페이지| 1,500원| 조회(898)

pH 미터, pH meter 사용법 완충용액, pH meter 사용법

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PCR(Polymerase Chain Reaction)

PCR(Polymerase Chain Reaction) 1Polymerase Chain Reaction(PCR) 중합효소 연쇄반응 (PCR ) 은 유전자를 증폭하는 방법 으로 이미 알고 있는 일부의 염기서열 중 특정 DNA 부위를 반복 합성하여 원하는 DNA 분자를 증폭시키는 방법이다 . 이 방법은 아주 적은 양의 DNA 를 이용하여 많은 양의 DNA 합성이 가능하므로 아주 획기적인 것이라 할 수 있다 전반적인 방법은 1. Primer 제작 후 , PCR 을 통해 원하는 부분의 DNA 를 선택적으로 증폭 2. electrophoresis( 전기영동 ) 을 통해 결과를 Band 의 형태로 관찰 . ( 전기영동은 agarose gel 이나 polyacrylamide gel 에 PCR 증폭산물을 Loading 하고 , 전류를 흘려주어 , 증폭산물이 전류를 따라 흘러 , 증폭한 사 이즈에 맞는 band 의 형태를 확인하는 것을 말한다 . ) 이때 PCR 은 보통 25~ 35 cycle 로 실시하는데 , 30 cycle 의 경우 2 30 만큼의 DNA 가 증폭하게 된다 . 즉 PCR 을 통해 특정 부위의 DNA 를 수 시간내에 어마어 마하게 증폭시킬 수 있으며 , 이렇게 증폭된 DNA 를 여러가지 실험에 이용할 수 있고 , 실험 결과를 토대로 여러 의학적인 연구에 응용할 수가 있다 . 2PCR 구성요소 Template DNA 증폭 대상이 되는 DNA. 일반적인 PCR 의 경우 DNA 를 사용하고 , PCR 이전단계에서 Reverse Transcription 을 행했을 경우 Reverse Transcription 이 끝난 cDNA 를 사용한다 Primer set Primer set 은 forward/reverse primer 라고도 부르는데 이는 DNA 의 방향성과 관련이 있는 용어이다 . primer set 은 원하는 target region 의 상보적 strand 의 각 5’ 부위의 끝에 있는 수십 base pairs 정도의 sequences 대로 인위적으로 합성한 . Taq polymerase 일반적으로 thermostable 혹은 heat-stable polymerase 를 의미하나 원래는 그 기원이 Thermus aquaticus 라는 미생물에서 유래한 polymerase 를 지칭하는 용어이다 . 이 enzyme 은 5’- 3’ polymerization- dependent exonuclease activity 를 가지고 있고 60bps/sec 이 속도로 DNA 를 합 성해 나간다 4다음 과정이 계속 반복하여 진행되면서 ( 보통 25∼35 회 ) 원하는 DNA 부분을 증폭시키는 것이 PCR 의 원리이다 . 쉽게 설명하면 튜브에 재료를 집어넣고 뜨겁게 덥혔다 식혔다 하면 ( 기계가 온도변화를 제공함 ) Taq polymerase 가 알아서 유전자를 합성해주는 것이다 . PCR 의 원리 561. DNA 의 변성 ( denaturation ) 90°C - 96°C 로 가열하여 double strand DNA( ds DNA) 를 single strand DNA( ssDNA ) 로 분리시킨다 . 높은 온도일수록 ssDNA 로 잘 이행되지만 Taq DNA polymerase 도 온도가 아주 높은 상태에서는 활 성이 낮아질 수 있으므로 보통 94°C 로 한다 . 첫 cycle 에서는 확실한 변 성을 위하여 약 5 분정도 지속시킨다 . 72. Primer 의 결합 (annealing) 열처리로 한 가닥으로 변성한 DNA 와 primer 를 공존시킨 후 온도를 낮 추면 2 종류의 primer 는 각각 상보적인 한 가닥 주형 DNA 에 annealing 한다 . Annealing 에 가장 적합한 온도와 시간은 primer 의 염기배열과 그 길이에 따 라 결정되지만 일반적으로 50°C - 65°C 에서 30sec-1min 정도로 진행된 다 . 염기간의 결합은 G 와 C 는 세 군데에서 수소결합이 일어나고 , A 와 T 는 두 군데에서 결합이 일어나므로 G+C 비율에 따라 결합온도에 변화를 주는 것이 좋다 . 83. DNA 의 합성 (ps 를 합성할 수 있으므로 원하는 PCR 산물의 크기 1 kb 마다 1 분 정도의 시간을 배당하면 충분히 반응이 일어난다 . 마지막 cycle 에는 약 10 분 정도 시간을 충분히 주는 것이 좋다 . 94. Cycle 수 PCR 의 경우 n 회의 cycle 로 합성되는 DNA 사슬을 주형의 2 n 배가 되지만 실제로는 이보다 낮다 . 일반적으로 25-35cycles 의 반응이 이루어지지만 증폭산물이 증가되 면 그 자신이 primer 가 되어 2 차적인 반응이 일어나기 쉽고 비 특이적인 DNA 의 증폭을 일으키게 된다 . 따라서 반응 cycle 수를 불필요하게 증가시키는 것은 바람직하지 않다 . 그러나 주형 DNA 량이 미량일 경우와 발현되는 mRNA 의 양이 적어 해당 유전자의 cDNA 의 양이 적은 경우 일반적인 경우보다 더 cycle 수를 늘려 DNA 증폭양을 최대로 할 수 있다 . 10효율에 미치는 영향 ① 각 단계의 반응온도와 시간 ② cycle 수 ③ 반응액 조성 ( 주형 DNA, dNTP 농도 , Mg2 + 농도 등 ) ④ primer 설계 ⑤ 사용 DNA polymerase 효율이 저하되는 이유 ① DNA polymerase 의 활성의 감소 및 증폭단편 ( 주형 DNA) 의 증가로 인한 효소분자 / 주형비의 부족 ② 증폭단편간 annealing 이 primer 의 annealing 과 competition 등이 있다 . ③ Pyrophosphate 축적으로 인한 효소반응 저해 등이 일어날 수 있다 . 11Primer 설계상 주의 할 점 (1) Primer 의 길이 15~30 염기 적당하고 20~25 염기가 바람 직 주형 DNA 와 특이적으로 annealing 하는데 충분하다 (2) Primer 간의 상보성 2 개간의 primer 끼리 annealing 하지 않도록 해야 함 특히 3’ 말단이 상보적인 primer 가 되지 않도록 하면 primer 의 dimer 형성에 의한 증폭 효율 저하의 위험성을 줄일 수 있다 (3) GC 함량 GC 함량이 50%염기쌍이 정확히 형성되지 않는 비 특이적인 결합을 할 것이다 . 이상적인 온도는 primer 와 주형간의 결합이 가능할 정도로 충분히 낮아 야 하지만 잘못된 염기쌍의 형성을 방지하기 위해 높아져야 한다 . Tm 값에 영향을 주는 요인 ① Salt ② G-C 함량 ③ DNA 길이 1314 Tm=4(G+C)+2(A+T)℃ G+C 가 A+T 의 수소결합보다 센 수소결합이기 때문에 계수가 크다 (A,T 는 이중 수소결합 / G,C 는 3 중 수소결합 ) Tm 보다 1~2℃ 낮은 온도는 primer 와 주형이 결합하기에는 충분히 낮으며 하나의 잘못된 염기쌍을 포함하기에는 너무 높기 때문에 primer 와 주형의 DNA 를 결합시키기에 적합한 조건이 될 수 있다 . (5) 농도 최종농도 0.2~1 μM 의 범위 ( 6) Primer 내의 2 차구조 Primer 자신의 2 차구조의 형성을 피하기 위하여 자기 상보서열을 갖지 않도록 함PCR 실험 방법 1. PCR 실험을 위해 필요한 시약 및 용액 , Sample 을 준비한다 . (Buffer, Primers, Marker, DNA, Enzyme, NTP(Nucleotides), BSA, MgCl2) ⇒ 보통 -20℃ 에서 보관하므로 실험시작 10 분전쯤에 꺼내어 놓고 녹인다 . 2. Ice 를 준비하고 , 녹은 시약 및 sample 을 vortex 시켜준다 . 153. Ice 위에서 조성표에 따라 buffer 용액을 만들고 , PCR tube 에 각각의 sample 을 오염되지 않도록 잘 넣어준다 . 조성표 100ul 당 10X buffer 10㎕ 50 mM MgCl2 3㎕ dNTP (nucleotides) 10㎕ BSA 1㎕ 10uM Primer (A) 2㎕ (B) 2㎕ DNA 2~4㎕ Taq polymerase 0.5㎕ (2.5unit) H2O (S.D.W) ( ) to 100㎕ ※ DNA sample 의 경우에는 PCR tube 에 각각 오염되지 않도록 조심스럽게 넣고 , Taqpolymerase 는 Enzyme 이므Elongase Temperature] DNA polymerase 에 의해 상보적으로 DNA 가 합성된다 . 증폭 산물로써의 두 가닥 DNA 를 재 열 변성하여 한 가닥 DNA 를 형성한다 . Step 3 후 , Step 1 으로 되돌아감 ※ Step 1~3 을 1 cycle 로 하여 25~30cycle 을 반복한다 . 보통의 경우 25~30cycle 을 하나 DNA 의 조건에 따라 설정조건이 달라질 수 있다 . (DNA 의 크기 , Concentration) 72℃(7 분 ) ⇒ Cycle 이 끝나고 , 혹시 모를 결합이 미숙한 DNA 를 완전하게 합성시켜준다 . 4℃(∞) 17PCR 각 성분에 대해 고려할 점 1. Template DNA 2. Primer 3. dNTP ( deoxynucleotide triphosphate ) PCR 의 효율 , 특이성 면에서 보면 20~200 μM 에서 양호한 결과를 얻을 수 있다 . DNA polymerase 가 잘못된 dNTP 를 사용하는 mismatch 현상은 dNTP 농도에 강하게 의존한다 . dNTP 농도를 낮추는 쪽이 PCR 특이성과 정확도가 높아지므로 dNTP 농도를 낮추면 misprimming 이 감소하여 PCR 의 정확도가 높아진다 . 단 사용하는 Mg2+ 농도에 따라 dNTP 의 최적농도 가 달라지므로 주의가 필요하다 . 4. Taq DNA polymerase Taq DNA polymerase 가 잘못 들어간 nucleotide 를 삭제하고 다시 합성하 는 proofreading 기능 (3'→5‘ exonuclease activity) 이 없기 때문이다 . 따라 서 PCR 산물에서 유전자의 변이가 발견되더라도 반드시 확인과정을 거 쳐야 한다 . 185. 10x PCR 완충용액 (1)Mg2 + : 보통 1.5-2.5mM 의 농도 ①Primer 가 template DNA 에 결합하는 능력 ② Template 및 PCR 산물의 변성온도 ③ Product specificity ④ dNTP 와의 결합 ⑤ Taq

자연과학| 2012.11.21| 19페이지| 1,500원| 조회(249)

PCR, polymerase chain reaction, PCR 구성요소

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