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α complementation과 Lac selection(=color selection)의 이해

1. α-complementation위의 그림을 보면 plasmid에 들어가 있는 lacZ는 Lac operon의 일부인데, Lac operon은 사이즈가 너무 크기 때문에 plasmid에 직접 삽입하지 못한다. (3075bp) 따라서 plasmid에는β-galactosidase 중에서 일부분(alpha fragment)을 넣고, E. Coli의 chromosomal DNA에서 나머지 부분(omega fragment)을 만들게 한다. 그렇게 되면 plasmid의 alpha fragment와 E. Coli의 omega fragment는 서로 complex를 이루면서 완전한 β-galactosidase로써 기능을 할 수 있게 된다. 이것을 α-complementation이라고 한다.E. coli는 원래 β-galactosidase를 만들 수 있는 유전자를 가지고 있는 미생물이므로 정상적인 균이라면 plasmid가 들어가지 않아도 푸른색 colony를 형성해야 한다. 그래서 실험실에서는 Lac operon이 망가져서 위와 같이 omega fragment만을 만들 수 있는 mutant를 사용한다.2. Lac selection (또는 color selection)β-galactosidase는 lactose를 glucose와 galactose로 분해시키는데 관련된 일련의 효소들 중 하나로 lacZ gene에 암호화 되어있다. lacZ’는 β-galactosidase의 α-fragment 부위에 해당되는 유전자이며, 이 염기서열에는 insert DNA를 삽입할 수 있는 MCS (Multiple Cloning Site)가 존재 한다.insert DNA가 lacZ’의 MCS에 삽입되어진 재조합 박테리아는 삽입된 유전자로 인하여 α-frag-ment가 파괴되어 lacZ’를 통한 β-galactosidase 생성이 되지 않기 때문에 X-Gal을 분해 할 수 없으므로 colony는 흰색을 띠게 된다. 반대로 유전자가 삽입되지 않고 self-ligation되어 형질전환 된 박테리아는 정상적으로 β-galactosidase가 생성되므로 X-Gal은 분해되어 colony는 푸른색을 나타내게 된다.※ β-galactosidase- lactose를 glucose와 galactose로 분해하는데 관여하는 효소 중 하나이다.- 일반적으로 대장균 염색체에 있는 유전자 lacZ gene에 암호화 되어있다.- lacZ는 Lactose를 분해하는 효소인 β-galactosidase의 N-terminal 부분을 만들고 이것을 α-fragment라고 부른다.

자연과학| 2013.05.23| 3페이지| 1,000원| 조회(303)

유전공학, 생명공학, 생화학, x-gal, plasmid, β-Galactosid..

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Strategies for the selection of recombinant phage

Strategies for the selection of recombinant phage(a) Insertional inactivation of a lacZ' gene모든 M13 cloning vector와 일부 λ vector는 lacZ' gene을 가지고 있다. 이러한 유전자 속으로 새로운 DAN의 삽입은 β-galactosidase를 비활성화 시킨다. 재조합 분자는 X-gal agar 위에 plating 하여 구별할 수 있다.phage vector의 lacZ' gene내에 foreign DNA를 삽입- clear plaque: recombinant- blue plaque: non-recombinant(b) Insertional inactivation of the λ cI gene여러 가지 형태의 λ cloning vector는 cI gene에 독특한 restriction site를 가지고 있다.이 유전자의 삽입 비활성화는 Plaque 형태의 변화를 야기 시킨다.- clear plaque: recombinant- tubid plaque: non-recombinant(c) Selection using the Spi phenotypeλ phage는 P2 prophage가 이미 존재하는 E. coli를 정상적으로 감염시킬 수 없다. 그래서 λ를 Spi+(Sensitive to P2 prophage Inhibiton)라고 말한다. 어떤 λ cloning vector는 Spi+에서 Spi-로 변화를 일으키는 위치에 새로운 DNA를 삽입하도록 만들어졌다.이 recombinant는 P2 prophage를 가진 세포를 감염시킬 수 있으며 recombinant만이 Spi-이므로 recombinant만이 plaque를 형성한다.(d) Selection on the basis of λ genome sizeλ packaging system은 37~52 kb의 DNA분자만을 head로 삽입시킬 수 있다. 37 kb보다 작은 어떤 것도 packaging될 수 없다. λ DNA의 거대한 부위를 결손시킴으로써 37 kb보다 작은 λ vector를 제조한다. 이들은 extra DNA가 삽입되어 전체 genome size가 37 kb이상이 되는 경우에만 packaging 될 것이기 때문에 recombinant phage만 복제될 수 있다.

자연과학| 2013.05.23| 2페이지| 1,000원| 조회(80)

selection, β-Galactosidase, LacZ, recombina..

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EtBr CsCl density gradient centrifugation의 원리 & Plasmid DNA의 분리 및 정제 방법 평가A+최고예요

CsCl 용액을 원심분리 하면 밀도기울기가 생성되는데 이때 CsCl 용액에 존재하는 거대분자는 밀도 기울기의 특정한 지점에서 띠를 형성하게 된다. 원심분리 결과 DNA는 1.7g/㎤ 기울기 지점으로 이동하고, 단백질은 상단부, 그리고 RNA는 바닥에 뭉쳐지게 되므로 DNA를 분리할 수 있다.이 방법에서 EtBr을 도입하면 density gradient centrifugation을 통해 non-supercoiled DNA와 supercoiled DNA를 분리시킬 수 있다. EtBr은 DNA 분자에서 인접해 있는 염기쌍 사이에 끼어들어가서 DNA 분자와 결합하게 되는데 이때 DNA 이중나선 구조가 부분적으로 풀리게 되고 그 결과 부력밀도는 낮아진다.linear DNA 경우 EtBr이 DNA의 염기쌍 사이에 삽입하여 결합하게 되면 0.125g/㎤ 만큼 밀도가 낮아진다. 그러나 supercoiled DNA는 자유말단이 없기 때문에 DNA 구조는 거의 풀어지지 않으며 한정된 양의 EtBr과 결합하므로 밀도는 조금 낮아져서 0.085g/㎤ 만큼만 감소한다. 결과적으로 EtBr에 의해 부력밀도의 차이가 생긴 linear DNA와 open-circular DNA는 상단에, supercoiled DNA는 하단에 띠를 형성하게 되는 것이다.- EtBr: DNA 염기 사이에 끼어들어감으로써 부력밀도를 변화시킴- linear and ocDNA: 0.125g/㎤ 만큼 밀도 감소- supercoiled DNA: 0.085g/㎤ 만큼 밀도 감소그 결과 linear and open circular DNA와 supercoiled DNA가 분리됨(1) column chromatography액체상과 고체상 사이에서의 물질의 분배를 수반하며 고체-액체 흡착 크로마토그래피의 한 종류로 분류된다.고정상은 고체로서 고체표면의 선택적인 흡착에 의해서 고체상을 통과하는 액체용매에 녹아있는 각 성분들이 분리되는데, 이때 용질과 고정상의 흡착을 일으키는 분자 사이의 인력은 수소결합 등이 있다. 관은 충진제로 채워져 있고 적은 액체 혼합 시료가 맨 위에 들어간다. 시료가 관의 맨 위에서 흡착이 되기 시작하고 전개용매를 부어주면 시료와 용매가 관을 통해 흐르기 시작하고 움직이는 액체상은 혼합물의 성분들을 끌고 갈 것이다. 고체상의 선택적인 흡착력에 의해서 각 성분들은 다른 속도로 내려가게 되는데 약하게 흡착된 물질이 강하게 흡착된 물질보다 더 빠르게 전개된다.(2) EtBr-CsCl 밀도기울기 원심분리법세슘이온과 염소이온을 원심분리관 바닥 쪽으로 잡아당겨 밀도구배가 형성된다. 물질의 부유밀도에 따라 밴드가 형성된다. CsCl용액에 EtBr를 가해 원심분리 시키면 supercoiled DNA와 non supercoil DNA를 분리할 수 있다. 이중나선이 풀리면 0.125g/㎤정도가 낮아진다. 그러나 유리말단 부위가 없는 supercoiled DNA는 거의 풀리지 않으므로 부유밀도 감소는 0.085g/㎤정도에 불과하다. 이 차이 때문에 두 종류의 DNA는 분리되어지며 각각을 추출할 수 있다.(3) alkaline lysis method플라스미드는 환형의 두 가닥 DNA이다. 두 가닥이 제각기 완전히 연결되어 있는 것이 기본형으로 닫힌 고리형(ccc형)이라고 한다. E.coli의 ccc형은 negative supercoil의 형으로 되어있다. 이것은 직선상의 두 가닥 DNA 나선의 회전수를 물리적인 힘을 가하여 자연 상태보다도 적게 되게 양끝을 결합하여 환상으로 한 것에 해당된다. 비틀어진 힘에 의해 전체가 supercoil형을 이루고 있다. 플라스미드를 분리할 경우에 균체로부터 얻은 DNA추출물을 ph12정도의 알칼리로 처리하면 염기간의 수소결합이 끊어져서 DNA가 변성되어 한 가닥으로 된다. 한 가닥에 절단점이 있는 oc형 DNA가 변성하면 한 가닥의 환상 DNA와 한 가닥의 직선상 DNA가 생긴다. 그러나 직선상의 두 가닥으로 된 DNA가 변성하면 직선상의 한 가닥 DNA만 생긴다. 단일가닥 DNA는 물리적으로 서로 떨어져 나가려고 하며 ph를 중성으로 되돌리는 경우에도 본래의 염기사이의 결합을 형성해서 이중가닥으로 되돌아가는 것은 쉽지 않다. 한편, ccc형 DNA를 알칼리로서 변성한 경우에는 형성된 두 개의 단일가닥 환상 DNA는 서로 밀착되어 있어 분리되는 일은 없다. 따라서 PH를 중성으로 되돌리면 쉽게 본래의 염기결합을 형성하여 원래의 ccc형 DNA가 재생된다. 그러나 oc형 또는 직선상 DNA는 재생되기 어렵다. ccc형 DNA가 변성되더라도 중성의 조건으로 되돌아가면 쉽게 재생되는 성질을 이용하여 다른 형의 DNA로부터 구별하여 분리할 수 있다.

자연과학| 2013.05.23| 2페이지| 1,000원| 조회(1,493)

Chromatography, Plasmid DNA, DNA분리, centrif..

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in vitro packaging system

in vitro packaging※ in vitro packaging ?시험관 속(in vitro)에서 recombinant phage DNA를 packaging하는 방법.in vitro에서 파지 DNA를 단백질의 각 안에 싸서 파지입자로 만드는 방법으로, DNA Cloning에서 이 방법으로 재조합 DNA를 패키지하면 대장균에 DNA를 효과적으로 도입할 수 있다.λ DNA분자의 transfection은 mature λ phage의 infection과 비교해 볼 때 비효과적이다.따라서 recombinant λ 분자가 시험관내에서 λ의 capsid protein안으로 packaging될 수 있다면 효과적일 것이다. Packaging을 위해선 수많은 λ 단백질들이 필요하지만 이것들은 defective λ phage를 세균에 감염시킴으로써 고농도로 얻을 수 있다.(a) Single-strain packaging systemcos site에 돌연변이를 가지고 있기 때문에 λ concatamer를 정상적으로 절단하는 endo-nuclease에 의해 인식되지 못하는 defective λ phage를 이용한다.이 defective phage는 packaging에 필요한 모든 단백질을 합성함에도 불구하고 복제할 수 없다. 이 단백질들은 세균 안에 축적되어 있으므로 숙주세포를 파괴시키고 미리 준비한 정상적인 cos site를 포함하고 있는 재조합 DNA와 혼합시키면 재조합 DNA가 capsid내로 들어감으로써 완전한 λ phage가 된다.(※ λ DNA 중 cos가 망가지면 단백질을 만들기는 하지만 완전한 형태는 아님)1. cos site사이에 foreign DNA를 삽입2. λ-defective strain 사용: 이 strain은 cos site가 변형되어 concatamer가 절단되지 않는 λ로 structural protein은 정상적으로 만들어지지만 DNA가 들어가지 않음 (크기가 너무 크기 때문)3. 2가 감염된 host cell을 파괴시키고 미리 제조하여 준비한 1을 첨가하면 정상적인 cos site가 절단되어 foreign DNA를 포함한 recombinant λ DNA가 2의 head(capsid)에 들어감으로써 in vitro packaging시켜 완전한 phage λ를 제조(b) Two-strain packaging system서로 다른 phage protein의 유전자(gene D, E)에 각각 돌연변이를 가진 두 종류의 defective λ phage를 각각 다른 숙주세포에서 배양시킨다. 완전한 capsid가 만들어질 수는 없지만 다른(나머지) 모든 coat protein들은 축적된다. 두 숙주세포를 파괴 후 재조합 DNA와 혼합시키면 in vitro packaging이 일어난다.1. 서로 다른 phage protein gene에 mutation이 일어난 2종류의 defective λ strain을 이용

자연과학| 2013.05.23| 2페이지| 1,000원| 조회(257)

Transfection, mutation, phage DNA, in vitro, recombination

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DNA cloning

1. cloning이란?DNA를 조작하여 조작된 DNA를 증식시켜 원하는 DNA를 다량으로 얻어내는 것을 cloning 이라고 한다. 조작된 DNA를 실은 vector를 박테리아에 넣어주어 조작된 DNA가 박테리아 핵 내에 삽입되는 방법을 이용하여 증식시키기도 하며 PCR을 이용하여 증식시키기도 한다. cloning 과정에 의해 재조합 된 개체의 모임을 clone 이라 부른다. 즉 cloning 과정의 목적은 조작된 DNA를 다량으로 얻어내는 것이다.2. cloning의 과정1) 유전자를 설정하고 그 유전자를 얻어낸다.2) 얻은 유전자를 vector에 삽입한다.3) 유전자가 삽입된 vector(recombinant DNA)를 bacteria 세포 내로 주입한다.4) 재조합 DNA 분자를 `복제'를 통해 증폭시킨다.5) 수많은 세포 분열을 통해 클론을 생성시킨다.6) Bacteria 중에서 올바르게 만들어진 clone을 확인하고 선택한다.3. vector DNA- 절단된 유용한 DNA의 조각을 이어서 증폭시키기 위해 사용되며, 스스로 증식할 수 있 는 DNA분자- DNA단편을 운반해 숙주세포의 내부까지 운반해 주는 운반체- 플라스미드(plasmid)나 박테리오파지(bacteriophage)4. Plasmid를 이용한 Cloning1) 동물의 유전자로부터 절단 효소 BamHI를 이용하여 타겟 DNA 절편을 획득2) 작은 원형 DNA인 plasmid를 E.coli에서 분리3) BamHI로 plasmid 한 곳을 절단4) DNA 연결 효소로 동물 유전자가 삽입된 원형 plasmid를 재조합5) Transformation (형질 전환)6) 복제: 박테리아 증식6) DNA 절편을 분리5. bacteriophase λ를 이용한 Cloning1) 부착: 박테리오파지 입자가 박테리아와 조우 (박테리오파지는 박테리아 막의 특정 구성 물질을 인식하여 박테리아 세포막에 부착)2) 주입: 박테리아 세포막에 부탁한 박테리오파지는 자신의 유전물질을 숙주 세포로 주입3) 복제: 박테리아로 유입된 박테리오파지의 유전물질은 숙주 세포의 효소를 이용하여 자 신의 유전물질과 단백질을 합성4) 조립: 생성된 박테리오파지의 유전물질과 단백질은 조립되어서 새로운 박테리오파지를 만듦5) 방출: 박테리오파지의 유전자로 인해 생성된 효소가 박테리아의 세포벽을 이루는 펩티 도글리칸을 분해하기 때문에 박테리아가 삼투압을 더 이상 버티지 못하고 파괴되어 새로운 박테리오파지를 방출6. 선별1) 방법1 - 항생제 저항성 이용(1) 플라스미드 DNA에는 두 군데의 항생제 내성(resistant) 부위가 존재한다.(엠피실린(Amp), 테트라사이클린(Tet))따라서 대장균의 경우 Amp 와 Tet의 항생제를 처리하더라도 죽지 않고 살 수 있다.(2) 클로닝(cloning)에 사용되는 대부분의 플라스미드는 그들의 숙주세포에게 항생제에 대한 저항성(내성)을 부여하기 때문에 플라스미드를 흡수하지 않는 숙주세포를 죽게 할 수 있는 선택배지(Amp와 Tet가 포함된)에서 배양하면 된다.(3) 사람의 인슐린 유전자DNA가 삽입될 플라스미드의 제한부위를 특정 유전자의 중간에 오도록 조작한다.→사람의 인슐린DNA가 대장균의 플라스미드 DNA의 중간에 삽입되면 유전자는 기능을 잃어버리게 된다. 그렇게 되면 Amp이 들어 있는 선택배지에서 재조합 된 대장균은 죽게 된다. 그러므로 외래 DNA가 삽입되지 않은 플라스미드는 유전자의 기능을 나타내어 Amp배지에서는 살지만 재조합된 플라스미드는 기능을 상실한다.(4) 따라서 기능을 상실한 세균을 찾으면 된다.

자연과학| 2013.05.23| 2페이지| 1,000원| 조회(519)

plasmid, DNA cloning, Transformation, vecto..

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