UV spectrophotometer실험 일자:실험 조:학번:이름:제출일:(1) AbstractUV assay는 단백질 자체의 분광학적 특성인 자외선 흡광 현상을 이용하는 단백질 정량법이다.단백질을 구성하는 아미노산 중 방향족 고리를 지닌 아미노산인 Tyr의 Phenol group과 Trp의 indole ring의 자외선 흡광이 정량적인 성직을 갖기 때문에 가능하며 즉, Tyr잔기나 Trp잔기의 숫자가 많을수록 자외선 흡광이 많아지며 용액 중에 존재하는 단백질 농도에 비례하게 된다. 자외선 흡광계수를 알면 시료의 농도를 측정할 수 있는데 이에 Lambert-Beer의 법칙이 사용된다.이번 실험은 BSA(bovine serum albumin) solution을 계열희석하여 여러 농도의 샘플을 준비하고 spectrophotometer를 이용하여 각 농도의 흡광도를 측정하여 그 관계를 알아볼 것이며 계열희석방법을 알고 spectrophotometer의 원리를 이해하는 것이 이번 실험의 목표이다.농도와 흡광도의 관계를 ANOVA 그리고 multiple comparison test를 사용하여 좀 더 정확하게 알 수 있다.(2) IntroductionUV spectrophotometer는 자외선을 사용하며, 이 영역의 빛을 사용하면 분자의 결합전자가 들뜨게 되면서 빛의 흡수가 일어나고 이것을 측정한다. 분자의 구조를 밝히는 데에는 결정적이지 못하며, 주로 파이전자계를 확인하는데 사용된다. 단일결합의 경우 결합전자가 들뜨는데 필요한 에너지가 매우 크므로 이 영역에서는 사용할 수 없다.UV는 분석물의 농도 측정에도 유용하게 쓰이며 Lambert-Beer의 법칙을 이용하여 그 농도를 계산 할 수 있다.* Lambert-Beer의법칙A = ebc = log I? / log IA : 흡광도e : 흡광계수(L mol?¹ cm?¹)b : 시료의 길이(cm)c : 시료의 농도(M)BSA solution의 농도 측정을 통해 계열희석법, 결과분석에 이용되는 ANOVA 그리고 multiple comparison test를 알고 spectrophotometer의 원리를 이해한다.* 실험방법1. 10mg/mL 의 BSA(bovine serum albumin) solution을 100mL 준비한다.2. 용액을 희석하여 각각 10, 8, 6, 4, 2 mg/mL가 되도록 준비한다.3. 각각의 샘플이 3개씩 되도록 준비한다.4. 각각의 용액과 대조군(증류수)를 well plate에 100uL씩 넣는다.5. UV spectrophotometer를 이용하여 280nm에서 흡광도를 측정한다.6. BSA농도 vs 흡광도를 확인하고 표를 통해 나타낸다.7. 표준편차를 사용하여 각 농도에서의 에러바를 표시한다.8. ANOVA와 multiple comparison test를 사용하여 데이터를 분석한다.(3) Data and Results 농도별 흡광도 농도vs흡광도 Multiple comparison test(4) Discussion을 보아 용액의 농도가 짙어질수록 흡광도가 커지는 것을 알 수 있다. 이는 용액의 농도가 짙어질수록 흡광도의 값은 커진다는 Lambert-Beer의 법칙을 통해 예측할 수 있는 결과이다. 그러나 을 보면 각 농도에서 표준편차의 오차범위가 작지 않다는 것이다. 이는 측정된 수치 값으로는 농도가 짙어질수록 흡광도가 커진다는 것을 예상할 수 있지만 과연 이것이 믿을만한 것인가라고 생각해볼 수 있다.둘 이상의 집단을 세부적으로 분석할 수 있는 ANOVA와 Multiple comparison test를 이용한다면 위 문제를 해결할 수 있을 것이다. 분석결과 에서 예상했던 결과와는 전혀 다르게 “A=B=C=D=E=F“로 분석되었다. 결정계수 0.96으로 용액의 농도와 흡광도과 선형관계임을 거의 정확하게 나타내고 있음에도 위와 같은 결과가 나오게 된 것은 각 농도에서 표준편차가 크기 때문이라고 생각된다. 실험에서 용액을 잘 섞지 않아 단백질이 침전되거나 용액을 옮기는 중에 기포가 생기거나 하면서 오차가 누적됐을 것이다. 똑같이 설계된 실험에서 표준용액을 사용한다면 각 단계에서 발생할 수 있는 오차를 최대한 줄일 수 있기 때문에 농도가 짙어짐에 따라 흡광도가 증가하는 결과를 얻을 수 있을거라 생각한다.
