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항산성 염색 및 그람 염색 실험

[항산성 염색 및 그람 염색 실험 결과 보고서]서론실험 목적 Acid-fast stain(항산성 염색) 및 Gram stain(그람염색)을 하여 미생물의 특징을 살펴보고 차이점을 안다.Acid-fast stain(항산성 염색)염색이 잘되지 않지만 한 번 염색하면 금속이나 산과 알코올의 혼합용액에 의해서도 잘 탈색되지 않는 항산성균의 성질을 이용하여 항산성균을 선택적으로 염색하는 염색법. 대표적인 것이 질-닐슨염색법이다. 이것은 균체를 염기성 푹신과 매염제로서의 카르보닐산을 포함하는 염색액으로 가온에 의해 강력히 염색하여 염산알코올로 탈색한 후 메틸렌 블루액으로 대비 염색한다. 그밖에 형광염색법으로 오라민-로다민법이 있다. 이것은 균체를 형광색소(오라민, 로다민)를 포함하는 염색액으로 염색하여, 염산알코올로 탈색한 후 과망간산칼륨용액으로 대비 염색한다. 형광현미경을 사용하여 확인한다. 균체는 황등색의 형광을 발색한다.Gram stain(그람염색)1884년 덴마크의 의사 H. C. J. 그람(1853∼1938)이 고안한 특수 염색법으로, 표본을 아닐린수(水)·겐티아나액(液)으로 물들여서 아이오딘·아이오딘화칼륨액으로 처리한 후, 순(純)에탄올로 씻으면, 조직은 탈색되지만 균은 탈색되지 않고 자주색으로 보인다. 그러나 그 후 여러 가지 균종이 발견되자 그 속에는 조직과 마찬가지로 에탄올 세정에 의하여 탈색되는 균도 있다는 것이 밝혀졌다. 이때 탈색되는 균을 그람 음성균, 탈색되지 않는 균을 그람양성균이라 부르기로 하면서 이 염색법은 당초의 목표와는 달리 세균의 분류에 이용되기도 하였다. 그 후 양성·음성균은 화학요법제에 대한 감수성뿐만 아니라, 균의 증식에 필요한 영양소의 종류, 물리·화학적 자극에 대한 반응, 생산하는 독소, 병변 등 각 방면에서 차이가 있다는 것을 알게 되면서 그람염색법의 의의는 증대하였다.기구 및 재료항산성 염색 slide glass, cover glass, 백금이, 증류수, 여과지, 트레이, 배양된 균(Mycobacterium abscessus, Staphylococcus, Nocardia salmonicida),염색시약(carbol fuchsin stain solution, acid alcohol, methylene blue stain solution)그람염색slide glass, cover glass, 백금이, 증류수, 여과지, 트레이, 배양된 균(Mycobacterium abscessus, Staphylococcus aureus, Nocardia salmonicida),염색시약(Crystal violet stain solution, Gram’s iodine, ethyl alcohol, Safranine)실험 방법항산성 염색슬라이드 글라스를 알코올로 깨끗이 닦아서 준비 한 후 증류수를 한 방울 떨어뜨렸다.멸균한 백금이를 이용하여 균을 취해서 슬라이드 글라스에 넓고 얇게 펴 발랐다.2번에 다시 한 번 대조용 균을 펴 발랐다.(1번 : Mycobacterium abscessus+Staphylococcus aureus, 2번 : Nocardia salmonicida+Staphylococcus aureus,)3번을 공기건조 시킨 후 불꽃에 두세 번 통과 시켜 화염 고정하였다.준비 된 표본에 carbol fuchsin 염색액을 듬뿍 떨어뜨려 마르지 않도록 주의 하면서 증기로 가온했다.(끓지 않도록 주의하였다)표본을 식힌 후 acid alcohol로 탈색 한 후 증류수로 수세 하였다.methylene blue로 대조 염색 후 수세하였다.물기를 제거하고 건조 시킨 후 현미경을 이용하여 관찰하였다.그람염색슬라이드 글라스를 알코올로 깨끗이 닦아서 준비 한 후 증류수를 한 방울 떨어뜨렸다.멸균한 백금이를 이용하여 균을 취해서 슬라이드 글라스에 넓고 얇게 펴 발랐다.2번에 다시 한 번 대조용 균을 펴 발랐다.(3번 : Mycobacterium abscessus+Staphylococcus aureus, 4번 : Nocardia salmonicida+Staphylococcus aureus)3번을 공기건조 시킨 후 불꽃에 두세 번 통과 시켜 화염 고정하였다.Crystal violet으로 1분간 염색 후 증류수로 수세하였다.Iodine으로 1분간 염색 후 증류수로 수세하였다.alcohol으로 20초간 탈색 한 후 증류수로 수세하였다.Safranin으로 20초간 대조 염색 후 증류수로 수세하였다.물기를 제거하고 건조 시킨 후 현미경을 이용하여 관찰하였다.결과 및 고찰1번 : Mycobacterium abscessus+Staphylococcus aureus2번 : Nocardia salmonicida+Staphylococcus aureus,3번 : Mycobacterium abscessus+Staphylococcus aureus4번 : Nocardia salmonicida+Staphylococcus aureus,위의 표와 같은 염색된 것을 확인 할 수 있었으며 각 염색법에 따른 미생물의 특성을 확인 할 수 있었고 서로 다른 미생물을 구분 할 수 있었다. 항산성 염색의 경우 그림 1과 2에서 볼 수 있듯이 붉은 색으로 염색되어 나타나는 것이 항산성 세균인 Nocardia salmonicida와 Mycobacterium abscessus이며 그람 염색의 경우 모두 그람 양성을 나타내는 것을 확인 할 수 있었다. 균이 가지고 있는 특성을 확인하여 포도상을 하고 있는 Staphylococcus aureus와 약간 구부러진 막대기 형태의 Mycobacterium abscessus 그리고 Nocardia salmonicida를 구분 할 수 있었다.Gram염색 시 주의 할 점이 몇 가지가 있다. 탈색시간을 너무 오래 하면 그람양성균이 그람 음성균으로 나타 날 수 있고 도말 한 후 완전 건조 하지 않고 화염 고정하였을 시 탈색이 잘 되지 않거나 찌꺼기 같은 것으로 잘못 판단할 수 있다. 또 도말이 고르지 못하고 두텁거나 조밀하면 탈색 시 crystal violet이 남아 있거나 또한 그람양성균이 음성균으로 나타 날 수도 있다. 이렇듯 몇 가지 문제 점 등으로 그람 양성균이 쉽게 위음성을 나타낼 수 있기 때문에 주의하여서 실험에 임하여야 한다. 실험도중에도 문제점이 발생 하였는데 균을 도말 할 시 균을 너무 많이 취하여서 현미경으로 관찰하기가 어려워서 다시 한 번 도말하였다. 반대로 균이 너무 적게 취해져서 균이 보이지 않기도 하기 때문에 적절하게 균을 취해서 도말 하는 것이 필요하다. 항산성 염색의 경우 증기로 가열 할 시 열에 의해 끓어 넘치지 않도록 주의 하여야 하므로 가열 하는 동안의 주의를 가지고 관찰 하여야 한다.

자연과학| 2015.08.11| 5페이지| 2,000원| 조회(730)

미생물, 그람염색, 항산성 염색, 염색법, 그램염색, 동정, 미생물 동정

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CAMP test를 통한 미생물 동정

서론실험 목적CAMP test를 이용하여 적혈구를 파괴하는 용혈성 세균중 β용혈을 일으키는 연쇄상구균을 구분하는 실험으로써 용혈성 세균의 란스필드 Type-B를 알아보는 실험이다. β용혈은 적혈구의 완전 용혈로써, 혈액배지위에 도말한 세균을 배양하여 배양된 모습과 양상을 확인하여 연쇄상구균들 중에서 Type-B가 어떤 세균인지 알아본다.CAMP test란?균종이 생성하는 CAMP factor (인자)를 검출하는 시험이다. CAMP 시험의 이름은 최초 보고자인 Christie, Atkins와 Munch-Peterson의 이름 첫 자를 딴 것이다. 세균이 세포외로 분비하는 CAMP 인자는 내열성의 단백질로서 적혈구에 대한 직접적인 용혈작용은 없으나 Staphylococcus aureus의 phospholipase C (sphingomyelinase)인 β-lysin이 CAMP 인자에 의해 감작된 혈액과 반응하여 용혈성이 증가된다. S. aureus의 일부 균주는 확산성의 β-lysin ( β-hemolysin, β-toxin, β-staphylolysin)을 생성하며 동물의 분리주에서 흔하고 사람에서 분리되는 균주에서는 적다. 이러한 β-lysin은 적혈구의 sphingomyelin을 분해하는 phospholipase C 활성을 가지고 있으며, 적혈구의 sphingomyelin 성분에 따라 CAMP 반응이 달라진다.란스필스 분류법이란?Lancefield가 개발한 용혈성연쇄상구균의 혈청학적분류법. 군특이성항원(群特異性抗原)과 형특이성항원(型特異性抗原)이 있으며, 침강반응 혹은 응집반응을 사용하여 실시한다. 군특이성항원 (群特異性抗原)은 균체세포벽유래(菌體細胞壁由來)의 다당체(多糖體)로서 C물질이라고 일컬어진다. C물질 항원성(抗原性)의 차를 항혈청(抗血)과의 침강반응(沈降反應)에 의해 조사하여 A, B, C D, E, F, G, H, K, L, M, N, O 13군(群)으로 Bergey의 분류에서 Streptococcus Pyogenes로 되어 있다. Lancefield는 또한 A군균(群菌)의 균형(菌型)을 M항원(抗原)에 의해 결정했다. M항원(抗原)은 형특이항원(型特異抗原)으로서 세포벽표층(細胞壁表層)에 존재하는 단백이다. 현재 50형(型)으로 분류되고 있다.실험 기구 및 재료혈액 한천 배지, 백금이, Staphylococcus aureus, 연쇄상구균 6종(Streptococcus)검사방법β-lysin을 생성하는 Staphylococcus aureus를 백금이를 이용해 혈액 한천평판배지의 중앙에 한 줄로 그었다.시험할 균주 6종류를 한배지에 2개씩 1)에 약간 간격을 주고 직각으로 그었다.배양한 후 24h 뒤에 결과를 관찰하였다.실험 결과위의 사진에서 볼 수 있듯이 1,3,5번 균에서 완전 용혈 및 삼각형 모양의 용혈모양을 확인 할 수 있었다.고찰실험 결과를 통해 란스필드 분류법에 따른 미생물의 특성을 확인 할 수 있었다. 이러한 특성을 이용하여 비슷한 특성을 보이는 미생물을 서로 분류 할 수 있었으며 이러한 방법으로도 미생물을 동정 할 수 있다는 점을 배웠다. 실험 결과를 확인 하던 도중 혈액배지 중앙에 접종한 Staphylococcus aureus와 후에 접종한 연쇄상구균의 용혈환이 겹쳐서 그냥 이어져 있는 부분을 발견 할 수 있었는데 이는 처음 접종할 시 둘 사이의 간격이 너무 좁아서 그런 것으로 확인 할 수 있었다. 둘 사이의 간격이 너무 좁을 시 특성을 제대로 확인 할 수 없으므로 적절한 간격을 유지 하는 것이 필요 하다는 점을 확인 할 수 있었다. 또한 Staphylococcus aureus가 제대로 용혈을 보이지 않은 배지도 있었는데 시간을 좀 더 두고 배양을 시킨 다면 더욱 확실한 결과를 확인 할 수 있을 것이다.

자연과학| 2015.08.11| 2페이지| 1,500원| 조회(1,527)

CAMP, 미생물 동정, 용혈성, CAMP test

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용혈성, 형광 색소형성, Flavobacterium sp.배양특성에 대한 결과 정리

[용혈성, 형광 색소형성, Flavobacterium sp.배양특성]실험 결과 정리미생물의 용혈성 테스트 결과α 용혈성β 용혈성γ 용혈성표1미생물의 용혈성 테스트 결과 표1과 같이 나타났다. 표1의 α용혈성을 살펴보면 혈액배지 위의 콜로니 주변에 녹색의 용혈환(溶血環)이 생기는 형태의 용혈임을 확인 할 수 있다. 이는 Staphylococcus parauberis로 추측할 수 있다. β용혈성의 경우 혈액배지에서 세균이 생산하는 독소로 말미암아 일어나는 용혈 가운데 완전 용혈에 의해서 투명한 용혈환(溶血環)이 생기는 용혈임을 확인 할 수 있다. 이는 Staphylococcus iniae로 추측할 수 있다. γ용혈성은 혈액배지에서 용혈성을 나타내지 않는 것으로 colony가 형성 되었지만 특별한 용혈환(溶血環)이 형성 되지 않는 것을 확인 할 수 있다.Pseudo F 배지에서의 형광색소 형성 실험 결과그림 1 에서와 같이 Pseudo F 배지에서 Pseudomonas 종류의 미생물은 형광색소를 생성하는데 이는 fluorescein에 의해서 이다. Pseudo F 배지는 Pseudomonas의 fluorescein 생성을 증진시키기 때문에 다른 배지에서 보다 형광색소를 잘 관찰할 수 있다. 특히 P. aeruginosa는 다른 Pseudomonas보다 형광 빛을 더 많이 나타내는 것을 확인 할 수 있으며 이를 이용하여 P. aeruginosa와 다른 Pseudomonas를 구분 할 수 있다.Cytophaga 배지에서의 Flavobacterium sp.배양특성

자연과학| 2015.08.11| 4페이지| 1,000원| 조회(110)

용혈성, 형광 색소형성, Flavobacterium sp.배양

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항생제 감수성 검사

서론실험 목적 항균제 감수성 검사법 중 희석법을 이용하여 빈용 되는 수산용 항균제에 대한 주요 어병세균의 감수성을 알아본다. 또한 세균에 대해 항생제의 최소 억제농도(Minimal inhibitory concentration,MIC)와 최소 살균농도(Minimal bactericidal concentration, MBC)를 알아본다. 또한 그람음성균에 대한 항생제의 살균력을 알아본다.원리 항생물질이란 어떤 생물 또는 미생물에서 생성되는 물질로서 다른 미생물의 성장 및 발육을 억제 또는 사멸시키는 물질로서 정의된다. 항균제에 관한 개념 중 항균제 감수성이란 세균이 항균제에 대한 반응 정도를 말하며 일반적으로 효과적인 감염증 치료를 위하여 병원균이 높은 감수성을 보이는 항균제를 선택하는 것이 매우 중요하다. 따라서 항균제의 투여 전에 세균의 항균제 감수성 검사를 실시하는 것이 원칙이다. MIC는 액체배지나 고체배지 둘 다 사용가능 한 방법으로 DISK확산법 보다 많은 시간이 소요되지만 최소억제농도(minimal inhibitory concentration, MIC)의 값을 바로 알 수 있다는 장점이 있다. 특히, 어떤 세균의 감수성 여부가 애매할 때는 희석법에 의한 MIC의 측정이 일반적으로 최선의 방법으로 받아들여지고 있다. 결과의 편차를 줄이기 위하여 표준화되어야 하는 인자에는 배지의 선택, 항생제의 안정성, 세균의 접종 size, 세균의 성장속도, 배양시간 등이 있다.Microdilution법Microdilution법은 96well plate에 시험제제의 농도를 정하여 2배 희석 계열로 제조하고 이와 균액을 1:1로 혼합 후 28℃에서 24시간 배양한다. 24시간 후 96well plate를 육안으로 관찰 시 균이 자라지 않은 최저농도를 MIC로 결정한다.AmoxicillinAmoxicillin은 합성 페니실린계 항생물질이며 대표적인 베타-락탐계열 항생물질로서 중금속이 있으면 불안정하여 분해되거나 불활성화 될 수 있다. 일반적인 항생제들과는 다르게 2가 양이과시켰을 때 용액은 그 빛을 흡수 또는 산란시킬 수 있고 이 때 흡수된 빛의 양은 용액의 세포농도에 비례함을 이용한 것이다. 이때 투과된 빛의 양은 시료의 균체 수에 반비례하게 된다. 따라서 여러 가지 비율로 희석된 배양액의 흡광도(Optical Density, OD)를 측정한다.재료 및 방법재료 및 기구96well plate, BHIB, BHIA, 세균배양액, spreader, 원심분리기, 인큐베이터, 흡광도 측정기, PBS, 항생제(Amoxicillin sodium), Ep-tube, 약수저, 전자 미량 저울, 오토피펫.실험 방법MIC (Minimal Inhibitory concentration)24시간 broth에 배양한 세균 1ml을 Ep-tube에 두 개씩 취한 후 원심분리 했다.(3000rpm, 4℃, 10min)상층액(BHIB)을 제거 한 후 1ml PBS를 넣고 충분히 vortex 후 원심분리 했다. (3000rpm, 4℃, 10min)나) 의 과정을 1회 반복했다.상층액(PBS)을 제거 후 1ml BHIB를 넣고 충분히 vortex 했다.세균 최종농도 5*105 CFU/ml로 희석했다. (2배 높게)항생제를 10구간 2배 희석계열로 단계희석 했다. (2배 높게)96well plate에 항생제 100㎕를 분주하고 세균 희석액 100㎕를 분주했다.한 개의 워싱 한 ep-tube의 세균액을 10배씩 희석하여 96well plate에 200㎕씩 분주했다.흡광도 측정기에서 620nm로 값을 측정했다.10의 -5승, -6승, -7승은 100㎕씩 BHIA에 spreading했다.96well에 분주한 것은 24시간 인큐베이터(28℃, 120rpm)에서 배양했다.BHIA에 도말한 것은 48시간 인큐베이터(28℃, 120rpm)에서 배양했다.세균이 자라지 않은 구간을 MIC로 결정했다.MBC (Minimal bactericidal concentration)96well-plate에 200ul 씩 BHIB를 분주했다.MIC가 결정된 값의 well부터 세균이 자라지 CFU/㎖0.080.1170.830.790.80.79E.tarda실험수업BHIB원액2*************001.28×10 CFU/㎖0.090.5340.1360.0980.0910.0910.0940.4790.1420.0990.0960.093평균0.0920.50650.1390.09850.09350.092표1. 620nm에서 E.tarda와 S.iniae의 흡광도 값표1은 E.tarda와 S.iniae를 워싱한 후 BHIB와 PBS를 각각 넣고 원액을 만든 후 10배씩 희석하여 10배, 100배, 1000배, 10000배까지 희석한 후 620nm에서 흡광도를 측정한 것이다. 실험결과 각 각 5×10 CFU/㎖, 1.28×10 CFU/㎖로 나타났다. 두 균주 모두 원액 값을 제외한 나머지 값이 비슷한 수준임을 확인 할 수 있었다.실험 결과E.tarda MICS.iniae MIC표.2 E.tarda와 S.iniae의 MIC값표2는 실험에 사용한 E.tarda와 S.iniae의 MIC 값을 나타내고 있다.첫 번째 E.tarda MIC와 S.iniae MIC에 사용한 균주는 각 각 E.tarda와 S.iniae이며 사용한 액체배지는 BHIB이고 사용한 항생제는 Amoxicillin sodium이다. 96well plate에 표기 된 NC는 Normal control로서 배지만 200㎕분주 한 것이고, BC는 Bacteria control로서 배지 100㎕와 세균 희석액 100㎕를 넣은 것이다. 그 외는 항생제와 세균을 100㎕씩 넣은 것이다. NC는 자라지 않고, BC는 자란 것을 확인했다. 첫 번째 농도구간은 16㎍/㎖이며 두 번째 농도는 2배 희석한 8㎍/㎖이다. 10개 농도구간까지 2배씩 희석했다. 위 표에서 E.tarda의 MIC값은 1㎍/㎖로 나타났으며 S.iniae의 MIC 값은 측정이 불가 하였다.실험결과E.tarda MBCS.iniae MBC표.3 E.tarda와 S.iniae의 MBC 값표3은 mic 값이 나온 농도 구간부터 더 높은 농도를 이용하여 MBarda에서는 MBC값이 8㎍/㎖, S.iniae에서는 0.25㎍/㎖가 나온 것을 확인 할 수 있었다.E.tarda colony countingS.iniae colony counting표.4 E.tarda와 S.iniae colony counting 결과표.4는 BHIA에 E.tarda 희석액과 S.iniae 희석액을 각 배지당 100㎕씩 분주하여 도말한 것이다. E.tarda의 경우 10과 10을 각각 2번씩, S.iniae의 경우 10,10,10을 각각 한번씩 평판배지에 도말 후 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. E.tarda는 10에서 15개, 14개의 colony가 counting되었고, 10에서는 187개, 196개가 나왔다. 따라서 실험에 사용한 E.tarda의 원액 값은 1.6825X109CFU/㎖으로 나타났으며 S.iniae의 경우 10에서만 6개의 colony가 counting되었다.Edwardsiella tardaStreptococcus iniae사용배지BHIA, BHIB 사용전배양 조건BHIB에서 24h,28℃MIC값1㎍/㎖모두 자라지 않음.MBC값8㎍/㎖0.25㎍/㎖원액평균값1.6825X10CFU/㎖6X10CFU/㎖OD620(원액)0.560.117표.5 결과정리 실험 결과를 정리 해보면 위와 같다고찰항균제 감수성 검사법 중 하나인 Microdilution법을 이용하여 수산용 항균제에 대한 주요 어병세균의 감수성에 대해 알아보는 실험을 하였다. 사용한 항생제는 Amoxicillin으로 국내 양식장에서 많이 사용되고 있는 항생제 중에 하나이다. 합성 페니실린계열의 항생물질이며 대표적인 베타-락탐계열의 항생제로 본 실험에서는 Amoxicillin을 이용하여 양식어에 질병을 일으키는 주요 어병세균인 E.tarda와 S.iniae에 대한 감수성 실험을 하였다.실험 결과를 살펴보면 S.iniae의 경우 MIC값이 나타나지 않았는데 이는 항생제의 농도와 균의 감수성 범위가 겹치지 않아서 나온 결과라고 추측이 된다. 그 이유 중 하나로 S.iniae의결과가 나온 것을 확인 하면 항생제에 대한 감수성이 뛰어나서 균이 자라지 않았다고 추측 할 수 있다. 이 경우 균 희석액의 농도가 매우 낮아서 항생제에 저항하여 균이 자라지 못했거나 항생제를 희석한 농도가 너무 높아서 제대로 된 MIC값을 측정하지 못했을 경우가 있다. 이번 실험의 경우 colony counting결과를 보면 균 희석액의 농도가 너무 낮아서 MIC값이 제대로 측정 되지 않았다고 할 수 있다. 실험 시 균액의 농도가 너무 낮은 이유는 제대로 된 정량을 지키지 못하였거나 신선하지 않은 균을 사용하였을 경우 등으로 나타 날 수 있는데 후자는 실험실에서 그 전날 전배양한 균을 사용하였기 때문에 아니라고 볼 수 있다. 그렇다면 실험자의 실험 부주의로 인한 균희석액의 농도가 낮아졌다고 할 수 있다. 따라서 실험을 하는 실험자는 정량과 방법을 제대로 숙지하고 실험에 임하여야 한다. 다음 실험에서 제대로 된 균 희석액을 가지고 항생제에 대한 감수성 테스트를 한다면 더욱 확실한 결과를 얻을 수 있다. 또한 Microdilution법 자체가 적은 양을 가지고 테스트하는 방법이기 때문에 적은 차이로도 그 결과가 크게 바뀔 수가 있다. 따라서 더욱 정확한 결과를 얻고 싶다면 Microdilution이 아닌 다른 감수성 테스트 방법을 함께 이용하여 항생제에 대한 감수성을 실험해 보는 것이 좋다.S.iniae의 경우 MIC 결과를 얻지 못했지만 E.tarda의 경우 MIC값을 제대로 구할 수 있었다. 1㎍/㎖라는 결과가 나왔는데 실제 현장에서 이 농도의 항생제를 사용하였을 때 질병이 감소하고 MBC결과인 8㎍/㎖의 농도로 항생제를 사용하였을 시 균이 제거 된다는 점을 알 수 있었다. 수산생물을 양식할 시 가장 중요한 점이 양식어류가 질병에 걸리지 않고 건강한 상태로 출하 되는 것인데 그러기 위해선 적절한 예방과 치료대책이 필요하다. 적절한 대책을 하지 않고 치료만 하겠다고 맞지 않는 항생제 및 치료약물을 과다 투여하게 된다면 해양환경이 오염될 뿐만 아니라 그 약물에 대다.

의/약학| 2015.08.11| 6페이지| 2,000원| 조회(925)

항생제, 감수성, mbc, MiC, microdillution법

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항산성 염색 및 그람 염색 실험 결과 보고서

[항산성 염색 및 그람 염색 실험 결과 보고서]1. 서론가. 실험 목적Acid-fast stain(항산성 염색) 및 Gram stain(그람염색)을 하여 미생물의 특징을 살펴보고 차이점을 안다.나. Acid-fast stain(항산성 염색)염색이 잘되지 않지만 한 번 염색하면 금속이나 산과 알코올의 혼합용액에 의해서도 잘 탈색되지 않는 항산성균의 성질을 이용하여 항산성균을 선택적으로 염색하는 염색법. 대표적인 것이 질-닐슨염색법이다. 이것은 균체를 염기성 푹신과 매염제로서의 카르보닐산을 포함하는 염색액으로 가온에 의해 강력히 염색하여 염산알코올로 탈색한 후 메틸렌 블루액으로 대비 염색한다. 그밖에 형광염색법으로 오라민-로다민법이 있다. 이것은 균체를 형광색소(오라민, 로다민)를 포함하는 염색액으로 염색하여, 염산알코올로 탈색한 후 과망간산칼륨용액으로 대비 염색한다. 형광현미경을 사용하여 확인한다. 균체는 황등색의 형광을 발색한다.다. Gram stain(그람염색)1884년 덴마크의 의사 H. C. J. 그람(1853∼1938)이 고안한 특수 염색법으로, 표본을 아닐린수(水)·겐티아나액(液)으로 물들여서 아이오딘·아이오딘화칼륨액으로 처리한 후, 순(純)에탄올로 씻으면, 조직은 탈색되지만 균은 탈색되지 않고 자주색으로 보인다. 그러나 그 후 여러 가지 균종이 발견되자 그 속에는 조직과 마찬가지로 에탄올 세정에 의하여 탈색되는 균도 있다는 것이 밝혀졌다. 이때 탈색되는 균을 그람 음성균, 탈색되지 않는 균을 그람양성균이라 부르기로 하면서 이 염색법은 당초의 목표와는 달리 세균의 분류에 이용되기도 하였다. 그 후 양성·음성균은 화학요법제에 대한 감수성뿐만 아니라, 균의 증식에 필요한 영양소의 종류, 물리·화학적 자극에 대한 반응, 생산하는 독소, 병변 등 각 방면에서 차이가 있다는 것을 알게 되면서 그람염색법의 의의는 증대하였다.2. 기구 및 재료가. 항산성 염색slide glass, cover glass, 백금이, 증류수, 여과지, 트레이, 배양된 균(Mycobacterium abscessus, Staphylococcus, Nocardia salmonicida),염색시약(carbol fuchsin stain solution, acid alcohol, methylene blue stain solution)나. 그람염색slide glass, cover glass, 백금이, 증류수, 여과지, 트레이, 배양된 균(Mycobacterium abscessus, Staphylococcus aureus, Nocardia salmonicida),염색시약(Crystal violet stain solution, Gram’s iodine, ethyl alcohol, Safranine)3. 실험 방법가. 항산성 염색1) 슬라이드 글라스를 알코올로 깨끗이 닦아서 준비 한 후 증류수를 한 방울 떨어뜨렸다.2) 멸균한 백금이를 이용하여 균을 취해서 슬라이드 글라스에 넓고 얇게 펴 발랐다.3) 2번에 다시 한 번 대조용 균을 펴 발랐다.(1번 : Mycobacterium abscessus+Staphylococcus aureus,2번 : Nocardia salmonicida+Staphylococcus aureus,)4) 3번을 공기건조 시킨 후 불꽃에 두세 번 통과 시켜 화염 고정하였다.5) 준비 된 표본에 carbol fuchsin 염색액을 듬뿍 떨어뜨려 마르지 않도록 주의 하면서 증기로 가온했다.(끓지 않도록 주의하였다)6) 표본을 식힌 후 acid alcohol로 탈색 한 후 증류수로 수세 하였다.7) methylene blue로 대조 염색 후 수세하였다.8) 물기를 제거하고 건조 시킨 후 현미경을 이용하여 관찰하였다.나. 그람염색1) 슬라이드 글라스를 알코올로 깨끗이 닦아서 준비 한 후 증류수를 한 방울 떨어뜨렸다.2) 멸균한 백금이를 이용하여 균을 취해서 슬라이드 글라스에 넓고 얇게 펴 발랐다.3) 2번에 다시 한 번 대조용 균을 펴 발랐다.(3번 : Mycobacterium abscessus+Staphylococcus aureus,4번 : Nocardia salmonicida+Staphylococcus aureus)4) 3번을 공기건조 시킨 후 불꽃에 두세 번 통과 시켜 화염 고정하였다.5) Crystal violet으로 1분간 염색 후 증류수로 수세하였다.6) Iodine으로 1분간 염색 후 증류수로 수세하였다.7) alcohol으로 20초간 탈색 한 후 증류수로 수세하였다.8) Safranin으로 20초간 대조 염색 후 증류수로 수세하였다.9) 물기를 제거하고 건조 시킨 후 현미경을 이용하여 관찰하였다.4. 결과 및 고찰그림 1그림 21번 : Mycobacterium abscessus+Staphylococcus aureus2번 : Nocardia salmonicida+Staphylococcus aureus,그림 3그림 43번 : Mycobacterium abscessus+Staphylococcus aureus4번 : Nocardia salmonicida+Staphylococcus aureus,위의 표와 같은 염색된 것을 확인 할 수 있었으며 각 염색법에 따른 미생물의 특성을 확인 할 수 있었고 서로 다른 미생물을 구분 할 수 있었다. 항산성 염색의 경우 그림 1과 2에서 볼 수 있듯이 붉은 색으로 염색되어 나타나는 것이 항산성 세균인 Nocardia salmonicida와 Mycobacterium abscessus이며 그람 염색의 경우 모두 그람 양성을 나타내는 것을 확인 할 수 있었다. 균이 가지고 있는 특성을 확인하여 포도상을 하고 있는 Staphylococcus aureus와 약간 구부러진 막대기 형태의 Mycobacterium abscessus 그리고 Nocardia salmonicida를 구분 할 수 있었다.

자연과학| 2015.01.09| 4페이지| 1,500원| 조회(1,291)

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