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Quantitation of protein using BSA standard

B-5조2013.11.11TitleQuantitation of protein using BSA standardMaterialsp20, p200, p1000, rack, tip, tube, incubator, spectrophotometer, vortex, 96-well plate, 증류수, BCA reagent (A).(B), BSA solution,농도를 모르는 protein, 쓰레기통Methods1. 7개의 1.5㎖ Tube에 증류수를 각각 40㎕ 넣는다.2. 2㎎/㎖(2000㎍/㎖)인 stock solution(BSA solution)을 1000㎍/㎖의 Tube에 넣고 Vortex를 이용해 잘 섞어준다.3. 2번의 Tube에서 40㎕를 추출하여 500㎍/㎖ Tube에 넣고 Vortex를 이용해 잘 섞고 이것을 다시 40㎕를 추출하여 250㎍/㎖ Tube에 넣고 잘 섞어준 뒤 이를 다시 40㎕를 추출하여 125㎍/㎖ Tube에 넣는 방법으로 나머지에도 차례대로 적용한다.(serial dilution)혼합액40㎕추출후 투입혼합액40㎕추출후 투입혼합액40㎕추출후 투입혼합액40㎕추출후 투입혼합액40㎕추출후 투입혼합액40㎕추출후 투입증류수40㎕1000㎕증류수40㎕500㎕증류수40㎕250㎕증류수40㎕125㎕증류수40㎕62.5㎕증류수40㎕31.25㎕증류수40㎕0㎕BSA용액40㎕vortexvortex로 섞음vortexvortexvortexvortexvortex2X Gel(50㎕) + sample(50)mix together1:11X+-4. BCA solution의 A는 p1000피펫을 이용하여 1.8㎖를 뽑고 B는 p200피펫을 이용하여 36㎕을 추출하여 conical tube에 넣고 vortex를 이용하여 잘 섞는다.5. 3번 과정에서 7개의 Tube에서 각각 25㎕씩 추출하고, 4번의 BCA solution을 200㎕뽑아 96-well plate에 넣고 잘 섞어준다.(pipetting)6. 마지막 96-well plate에는 4번의 BCA solution을 200㎕과 농도를 모르는 단백질을 첨가하여 잘 섞어준다.(pipetting)7. incubator에 37℃, 30분의 조건으로 놓는다.8. spectrophotometer에 562~590㎚로 맞추고 값을 확인한다.Result단백질농도(㎕)흡광도(㎚)00.188(-0.188)=031.250.192(-0.188)=0.00462.50.2(-0.188)=0.0121250.263(-0.188)=0.0752500.3(-0.188)=0.1125000.557(-0.188)=0.36910000.965(-0.188)=0.777x0.178(-0.188)=-0.01*농도를 모르는 단백질의 농도:-0.01=0.0008x-0.0312x=26.5㎕Discussion이번 실험은 BSA solution을 이용한 단백질을 정량(단백질 양이나 농도를 알아보는 것)의 실험이다. 이 실험에서 BSA solution(2000㎍/㎖)은 농도를 알고 있는 단백질로 stock solution으로 사용되었는데 이 때 standard를 잡는 이유는 나의 sample을 이 실험의 기준안에 들어오게 하기 위해 설정한 것이다.-농도를 모르는 단백질 : 세포를 추출하여 cell lysis buffer에 넣으면 cell의 mambrane break가 일어나 cell 안의 단백질이 액체상태가 되는데 이를 인큐베이션에 20분정도 처리하고 원심분리기(centrifuge)에 넣어 작은 덩어리(pellet)과 맑은 액체(supernatant)로 분리하게 되는데 이때 Sup을 농도를 모르는 단백질로 사용하게 된다.Method4는 BCA solution을 만드는 과정으로 BCA reagent (A)와 BCA reagent (B)를 50:1의 비율로 혼합하는 것이다. 이때, Method5의 비율이 1:8으로 BCA는 8의 비율이 필요하므로 8*200으로 총 1600㎕가 필요하지만 여유롭게 1800㎕를 만들었다. 따라서 BCA reagent (A)용액은 1.8㎖(p1000을 이용하여 900㎕씩 2번), BCA reagent (B)용액은 36㎕(p.200을 이용)로 50:1의 비율로 혼합했다. (1.5㎖ Tube에는 용액용량이 넘치게 되므로 이때는 Conical Tube를 사용하도록 함.)Method5에서는 위에 언급한 바와 같이 Method3과 Method4를 1:8의 비율로 혼합하게 되는데 Method3의 7개의 Tube에서 각각 25㎕씩, Method4의 BCA solution에서는 200㎕을 추출해 차례대로 96-well plate에 넣고 피펫을 이용해 잘 섞어준다.(Pipetting)Method8에서 incubator에서 37℃, 30분의 조건으로 하는 이유는 그 때 가장 단백질이 활성의 조건이 되기 때문이다. 또한 Method9에서 spectrophotometer를 562~590㎚로 맞추어야 하지만 여건상 595㎚로 실험을 진행하였다.이론적으로 실험 후 나온 결과에서 그래프를 그려보면 (0,0) 직선의 그래프가 나와야 하는데(농도가 0일 때 흡광도도 0) 실험값은 그렇지 않았다. 그 이유는 BCA solution 자체의 색이 약간 존재하므로 spectrophotometer는 단백질이 있건 없건 색이 있는데 값을 부여하는 기기이므로 이럴 때 단백질 농도는 0이지만 흡광도는 0이 아닐 수 있다. 때문에 단백질 농도가 0일 때 나온 흡광도 값을 나머지 단백질 농도에서 나온 흡광도의 값에서 빼는 것을 통해 (0,0)을 지나는 직선을 그릴 수 있을 것이다.그래프를 그려서 나온 식(y=ax)을 통해 농도를 모르는 단백질의 흡광도에서 농도를 구할 수 있는데, 그래프의 y값에 흡광도를 대입하여 x값에 대해 식을 풀면 농도(x)의 값을 구할 수 있다. 우리조의 실험값에서 심각한 오류가 발견되었는데 Method6에서 BCA solution을 200㎕과 농도를 모르는 단백질을 첨가하여 섞었어야 했는데 이때 농도를 모르는 단백질을 첨가하지 않아 색이 변하지 않았고 흡광도 값도 제대로 나오지 않아 A조의 기록을 이용하여 단백질의 농도를 구하였다.*β-mercaptoethanol(환원제):S-H결합을 끊어서 선형(Lenear)이 되게 함*끓인다:3차구조, 4차구조의 엉킨 단백질을 선형(Lenear)으로 풀어줌*Sodium dodecyl sulfate(SDS,계면활성제):Protein을 감싸서 (-)charge가 되게 함→전기를 걸어줌→모두 (+)charge로 이동-무거운 것은 적게 이동-가벼운 것은 많이 이동reference단백질 프로토콜/안태호/전남대학교출판부/2012/p.42~43약품생화학실험/약품생화학분과회/신일북스/2011/p.57~58Type of colorimetric protein assay1)Lowry assay알칼리성에서 단백질이 Folin-Ciocalteau시약을 만나 환원되면서 착색되는 원리를 이용한 것으로 Biuret원리(알칼리성에서 단백질의 펩타이드 결합과 구리가 반응해 Cu++이온을 생성)에 기초를 두고 있다. 생성된 구리가 무기염혼합물인 Folin시약과 Folin-Ciocalteu반응을 하는데 phosphomolybdotungstate가 구리에 의한 방향족 아미노산의 산화에 의해 heteropolybdenum blue로 환원되는 반응에 의해 진한 푸른색을 발색한다.-장단점● 단백질이 침전되어 있더라도 측정할 수 있으며, 단백질의 양에 비례하여 색도가 증가함.● 0.01~1.0㎎정도의 미량정량에도 사용가능.● Biuret원리과 밀론 시험의 장점을 모아놓은 방법으로 발색정도가 강함.● pH에 매우 민감하며 준비과정이 복잡하다.● Biuret원리에 기초를 두고 있기 때문에 단백질의 종류에 따라 그 값이 변할 수 있음● 단백질용액에 Folin-Ciocalteu반응을 방해하는 물질들이 있는 경우 제거를 하거나 보정을 해주어야 함. (방향족 화합물, 완충용액, 황화합물, 당, EDTA 등에 의해 방해를 받음.)2)BCA Assay현재 Bradford Assay와 함께 가장 많이 쓰이고 있는 단백질 정량방법이다. Lowry assay를 개량한 방법으로 Folin시약 대신 bicinchoninate(BCA)를 사용한다는 차이점이 있다. 단백질이 구리 이온Cu 2+, Cu 1+)을 환원 (Reduction) 시킬 수 있는 성질을 이용한다. 단백질에 의해 환원 된 구리 이온은 BCA용액과 반응을 해서, 보라빛의 화합물을 생성하게 된다. 이 화합물은 빛의 특정 영역(562nm)에서 구리 이온이 담긴 용액과 BCA용액 각각보다 빛의 흡수율이 높기에, spectrophotometer를 사용해서 측정하면 흡수율 차이를 측정할 수 있다. 단백질의 양이 많으면 보다 많은 보라빛 화합물이 생성되었을 것이다. 그리고 그 화합물은 빛을 더 많이 흡수하니까 흡수율이 증가하고, 그것에 비례해서 샘플 안에 있는 단백질 양을 측정 할 수 있다.- 장단점● 일반적인 버퍼물질에 간섭을 덜 받음● 높은 온도에서 한다면 보다 민감하고 빠른 반응을 할 수 있음● 계면활성제와 같이 사용할 수 있음.● 반응시약이 안정적.(최종 시료의 안정성)● 서로 다른 단백질 사이에 반응의 차이가 거의 없음.● Lowry assay를 사용했을 때보다 방해를 주는 물질이 없음.

자연과학| 2013.11.18| 5페이지| 1,000원| 조회(312)

단백질정량, Bradford assay, Spectrophotometer, L..

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[에너지소사이어티-지금세계의화두는에너지다]1장~6장

에너지소사이어티지금 세계의 화두는 에너지다제1장 : 세계는 지금 에너지를 중심으로 움직이고 있다.환경 문제는 인간이 해결해야 할 난제중의 난제이다. 이미 수십억 명의 사람들이 식수와 농업 등에 필요한 물 부족에 시달리고 있다. 인구가 늘어나고 경제가 발달할수록 물 수요는 증가할 것이다. 물 부족 문제를 해결하기 위해서는 풍부한 바닷물을 마실 수 있는 물로 바꾸어 가지고 와야 하는데 이를 위해서는 풍부한 바닷물을 마실 수 있는 물로 바꾸는 과정이 필요한데 이 과정에서 에너지가 필요하다. 그 외에도 농지를 개간하고, 비료를 생산하고, 수확하며, 곡식과 채소를 소비자에게 전달하는 것, 환경과 가난, 군사력의 투입과 질병을 막기 위한 약과 백신의 생산 등 수많은 문제들의 열쇠는 에너지가 쥐고 있다. 오늘날 인류가 해결해야 할 과제에 한 가지 추가하고 싶은 것이 있다면, ‘기후변화’이다. 이미 지구의 평균기온 상승으로 생태계가 교란되고 북극과 그린란드, 알프스의 만년설은 녹아내리고 있고, 해수면이 상승하여 섬이 가라앉아 기후난민이 발생하고 있으며, 허리케인과 홍수, 가뭄으로 인간의 삶이 영향을 받게 되면서 생존의 문제가 논의되기 시작했다. 각국 정상들은 어떻게든 이 기후변화를 조금이나마 막아보겠노라고 이산화탄소 저감에 대해 골몰하고 있다. 하지만 이산화탄소라는 단어 뒤에는 더 중요한 것이 있다. 바로 ‘에너지’ 이다. 기후변화의 협상역시 단순히 온실가스배출을 줄여 지구온난화를 막아보자는 것은 아닌 듯 보인다. 화석연료 에너지, 즉 석탄, 석유, 천연가스를 이용하여 인류는 현대의 문명사회를 건설했다. 화석연료 에너지가 문명 건설의 원동력이 된 것이다. 그러나 화석연료를 사용하면 할수록 이산화탄소를 비롯한 환경 오염물질이 배출되었다. 문명사회를 굴러가게 하는 원동력이 덫이 되어 돌아온 것이다. 수백만 년의 시간 속에 식물이 저장해놓은 에너지를 마음껏 꺼내 썼던 인간의 활동이 지구 균형에 문제를 일으켰고, 오늘날 우리들이 이야기하는 합의된 사실, 즉 인간 활동으로 배출된 온대규모의 삼림벌채가 불가피했으며, 결과적으로 전혀 효율적인 연료가 아니었다. 삼림이 황폐해지면서 원료가 점점 고갈되었고 인간은 또 다시 새로운 연료 에너지원을 찾기 시작했다. 석탄은 수억 년 전 고생대, 아직 인류가 존재하지 않았을 때 살던 식물들이 땅 속에 묻혀 오랜 시간동안 열과 압력을 받아 만들어진 것으로 나무연료와는 비교할 수 없는 에너지를 뿜어냈다. 인간의 도전은 기술을 발달시켰고, 새로운 도구를 발명했다. 그리고 그로 인해 새로운 땅과 자원을 얻을 수 있게 해주었다. 자원 확보의 우위는 상대적인 권력과 한발 더 나아갈 수 있는 에너지의 확보를 의미했다. 세계는 급속도로 바뀌기 시작했다. 산업혁명 이전, 영국은 17세기에서 18세기까지 100년 동안 인구가 40%이상 증가했다. 인구가 늘어난 만큼 많은 에너지가 필요했다. 이미 16세기부터 목재 자원이 고갈되기 시작했던 영국은 자원고갈, 인플레이션, 물가 상승 등의 사회적, 경제적 문제에 봉착했다. 이와 같은 불안은 17세기 영국의 내전으로 이어짐과 동시에 에너지 문제를 해결하기 위해 석탄 이용기술이 발달하기 시작했다. 이는 산업의 공업화로 이어져 농업과 수공업 위주의 경제 시스템을 공업과 기계를 사용하는 제조업 위주의 경제 시스템으로 바뀌어갔다. 생산이 기계화 되면서 숙련공이 아닌 저임금 여성이나 소년들로도 충분히 공장에서 생산이 가능해졌다. 이와 같은 현상은 단순히 노동력과 생산량의 문제만이 아니었다. 인간이 점차 기계에 의해 소외되기 시작했다. 그리고 이어지는 인간의 도구화는 산업화와 공업화를 통해 점차 고착되어갔다. 사람들은 도시의 공장으로 몰려들었고, 그 이후에도 18세기의 산업혁명은 석탄을 연료로 물을 끓여 증기의 힘을 이용하는 증기기관이라는 기계의 힘을 기반으로 인류의 문명은 어느 시기보다 빠르게 발전해 나갔다. 그러나 목재 자원이 그러했듯이 자원은 유한하기에 인간의 증가하는 에너지 수요는 새로운 에너지 자원을 요구했다. 석유는 이러한 욕구를 충족시켜준 최고의 에너지 자원이었고, 제 2차 위 에너지혁명이라 한다. 이 후 1960년 석유가 발견되기 전까지 극빈층에 머물러 있던 중동의 5개 수출국(사우디아라비아, 이란, 이라크, 쿠웨이트, 베네수엘라)이 석유수출국OPEC(Organization of Petroleum Exporting Countries)을 결성하고 석유의 가격을 결정하여 불과 100여년 만에 세계에서 가장 큰 목소리를 낼 수 있는 존재가 되었다. 유럽의 대 러시아 에너지 의존도가 높아질수록 국제 정치와 경제 구도에서 주도권을 잡을 가능성도 높아지는 것이다. 우크라이나는 러시아와 유럽을 잇는 송유관이 지나간다는 지정학적 이점 때문에 러시아를 상대로 높은 에너지 협상력을 가질 수 있었다. 때문에 미국, 러시아, 유럽, 중국 등은 에너지에 사활을 걸 수밖에 없다. 석유 또한 자원이 한정되어 있기 때문에 앞으로 얼마 지나지 않아 고갈이 되기 마련인데 전 세계는 이제 석유를 넘어선 신에너지자원을 찾기 위해 최선의 노력을 하고 있다. 보다 효율적이지만 온실가스를 줄일 수 있는 에너지원을 가장 먼저 찾아 실용화하고 기술을 개발해 나가면서 에너지 권력화를 위해 각 국들이 노력을 경주하고 있다.석유와 석탄 등 화석연료의 무분별한 사용은 이산화탄소 CO₂를 다량 배출하여 급속한 기후변화를 불러왔다. 즉, 기후변화는 인간이 사용하는 ‘에너지문제’라 해도 과언이 아닌 것이다. 이 때문에 현대사회는 에너지 공급 시스템의 혁신을 요구하고 있다. 기후변화협약에 대응한 각국의 움직임이 주로 신재생에너지 개발과 온실가스 배출량 규제로 이루어지고 있는 것만 봐도 쉽게 알 수 있다. 세계는 지금 에너지 중심으로 움직이고 있으며, 에너지가 미래를 결정할 것이라는 대해 의심의 여지가 없다. 그래서 정부는 물론 기업과 가정마다 녹색정책, 녹색경영, 녹색기술, 녹색구매 등 이른바 ‘녹색혁명’이 한창이다. 하지만 명확한 문제의 이해와 인식 없이 시대의 흐름에 따른 그저 막연한 외침은 아닌지 다시 한 번 되돌아볼 필요가 있다.먼저인류의 마음이 움직이지 않고서는 아무리 신재생에OPEC은 이 중 약 9억 달러분을 수출한다. 중동 국가들은 유래 없는 최고의 호황기를 누렸다. 중동에는 석유만 있는 것이 아니다. 만약 천연가스의 가치를 더하면 더 엄청난 수치가 나올 것이다. 중동국가에 몰리는 오일머니는 이와 같이 엄청난 자본의 실탄을 제공한다. 에 따르면 2009년 상반기동안 아랍에미리트의 펀드에 의해 약 100억 달러가 투자되었다고 한다. 중동 오일머니의 힘은 세계경재의 축을 바꾸어 놓고 있다. 석유로 벌어들인 돈은 멈추어 있지 않다. 땅 속 깊은 곳에서 오랜 시간 동안 갇혀 있던 유산은 전 세계를 활보한다. 돈은 돈을 부르며, 자본시장은 자본에 의해 움직이고 관리된다. 중동이 무서운 이유는 그들이 갖고 있는 석유 때문이기도 하지만, 동시에 그것으로 창출되는 ‘부’ 때문이다. 중동은 에너지에 이어 자본으로 세계 시장을 잠식하기 시작했다.말이 되는 픽션중동 산유국들이 OPEC을 설립한 1960년 이후, 그들은 석유파동 등을 통해 입지를 굳힌 뒤, 석유자원에 의존한 세계경제 발전에 힘입어 오일머니를 쓸어 담기 시작했다.중동국가들의 경제가 발전할수록, 인구가 증가할수록, 건물이 지어질수록 그들이 사용할 에너지는 과거 산업혁명 이후 유럽과 미국이 그랬듯이 폭증할 것이다. 더욱 우려되는 점은 중동국가 국민들은 에너지절약에 대한 기본 개념이 없다는 것이다. 대부분의 중동국가에서 전기와 수도 등은 자국민들에게 거의 무료로 제공되고 있고, 휘발유도 매우 저렴한 가격에 보급되고 있다. 따라서 그들에게 에너지 절약이란 먼 나라 이야기일 뿐이다. 카타르, 바레인, 아랍에미리트, 쿠웨이트 등 중동 산유국의 1인당 에너지 소비량은 세계 최고 수준을 자랑한다. 카타르의 1인당 에너지 소비량은 우리나라의 약 5배가량 된다, 자원이 저렴하고 풍부할수록 인간은 그 가치를 망각하게 된다.세계 석유 수요는 꾸준히 증가할 수밖에 없기 때문에 석유가격은 크게 내려가지 않을 것이다. 떨어지더라도 그것은 일시적인 현상일 뿐 OPEC의 가격조절 정책으로 다시 50달러 이상의 유가 수많은 전쟁들, 이 모든 인류의 역사는 에너지 때문에 일어난 일들이다.I am your Energy실제로 석유수요의 증가에 가장 크게 기여한 것은 교통수단의 발달이다. 경제와 산업이 발달한다는 것, 소득이 높아진다는 것은 인간이 같은 시간 동안 더 많은 경제활동을 통해 가치를 창출한다는 뜻으로 해석될 수 있다. 경제가 발달하면서 자동차, 선박, 비행기 들 문명의 도구를 빈번하게 사용하면서 인간의 활동성과 이동성이 증가하게 되고 그만큼 많은 에너지를 사용하게 되는 것이다. 타 분야는 기술 향상으로 인한 효율 증가 등으로 절감효과를 볼 수 있으나, 교통과 수송에서 늘어나는 수요를 효율 향상으로 상쇄하기는 불가능하다.이와 같은 에너지 수요 때문에 매년 발표되는 세계에서 가장 이익을 많이 내는 기업은 항상 에너지 석유기업이 차지한다. 우리나라 정유기업도 예외는 아니다. 그들이 정제하는 석유는 진정한 우리의 에너지 Ourenergy이다.-경제가 발달하면서 자동차, 선박, 비행기 등 문명의 도구를 빈번하게 사용하면서 인간의 활동성과 이동성이 증가하게 되고 그만큼 많은 에너지를 사용하게 되는 것이다. 경제발전을 위해 더 많은 에너지를 필요로 하고 발전된 경제는 더 많은 에너지를 필요로 하는 구조 속에서 세계의 부는 더운 중동으로 흘러들어갈 것이다. 에너지의 사용과 경제발전의 상호관계 속에서 더욱 많은 부가 에너지 소유국으로 이동하고 있다.제5장 금융위기와 석유시장의 변화, 그리고 그린버블-새로운 시대의 변환점우리는 석유 없이 살 수 있다.아무리 유가가 비싸진다고 하더라도 현존하는 세계의 산업은 적어도 당분간은 석유를 사용할 수밖에 없는 구조를 갖고 있다. 1970년대 OPEC이 의도적으로 석유 감산조치를 취하여 전 세계를 강타한 석유파동은 중동의 위력을 여실히 보여준 사건이었다.중동 산유국들은 유가가 비쌀수록 좋지만, 반대로 유가가 떨어지면 근심이 쌓인다. 한동안 고유가는 산유국에 부를 가져다주었지만, 금융위기로 인한 소비자의 구매력 감소로 이어져 석유의 수요를 떨어뜨렸.

자연과학| 2013.10.25| 8페이지| 2,000원| 조회(67)

에너지소사이어티-지금세계의화두는에너지, 에너지자원과환경, 에너지소사이어티

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Measuring pH

B-5조생명과학전공 *************.10.07TitleMeasuring pHMaterialspH미터기, Electrode, D.W, Pipette, Tip, Tube,pipet aid, serological pipetteMethods①1. pH=-log[H] 공식을 이용하여 0.1M HCl의 pH값을 구한다.2. 1M HCl용액을 1/10로 희석하여 0.1M HCl용액을 만든다.3. 만든 0.1M HCl용액을 pH미터기를 이용하여 pH를 측정한다.4. 이론상으로 구한 pH의 값과 실험을 통해 얻은 pH값을 비교해본다.Methods②1. Kw=[H?][OH?]공식을 이용하여 0.005M NaOH의 pH값을 구한다.2. 1M NaOH용액을 1/200로 희석하여 0.005M NaOH용액을 만든다.3. 만든 0.005M NaOH용액을 pH미터기를 이용하여 pH를 측정한다.4. 이론상으로 구한 pH의 값과 실험을 통해 얻은 pH값을 비교해본다.Methods③1. pH=pKa+log[A?]/[H?A] 공식을 이용하여 용액의 pH값을 구한다.1. 빈 Tube 2개에 Pipette을 이용해 아래 표와 같이 용액을 넣는다.1M acetic acid1M sodium aceD.Wsolution①(=10㎖)0.25M(=2.5㎖)0.1M(=1.0㎖)6.5㎖solution②(=10㎖)0.1M(=1.0㎖)0.25M(=2.5㎖)6.5㎖2. D.W를 이용해 Electrode를 헹구고 물기를 조심스럽게 제거한다.3. pH미터기의 Read버튼을 눌러서 화면을 띄우고, pH4용액과 pH7용액을 Calibration버튼을 눌러서 기준을 잡는다. (용액이 바뀔 때마다 Electrode를 꼭 세척하도록 한다.)4. Electrode를 solution①에 담구고 Read버튼을 눌러서 pH를 측정한다.5. Electrode를 D.W를 이용해 세척하고, 다시 solution②에 담구고 Read버튼을 눌러서 pH를 측정한다.6. 이론상으로 구한 pH의 값과 실험을 통해 얻은 pH값을 비교해본다.Result①-이론값:pH=-log[0.1]=-log10 ^{-1}=1-실험값:0.970-오차:0.030Result②-이론값:pH=[H?][0.005]=1×10 ^{-14} [H?]=1×10 ^{-14}/0.005→pH=-log(10 ^{-14}/0.005)=-[log10 ^{-14}-log5/1000]=-[-14-(log5-log10³)]=-[-14-(0.698-3)]=11.698-실험값:10.144-오차:1.554Result③[solution①]-이론값:pH=4.76+log0.1/0.25=4.76+log4/10=4.76+(log4-log10)=4.362-실험값:3.995-오차:0.367solution②-이론값:pH=4.76+log0.25/0.1=4.76+log5/2=4.76+(2log5-log10)=5.156-실험값:4.734-오차:0.422Discussion이번 실험은 pH미터기와 Electrode를 이용하여 pH값을 구하고, 이론상 나온 pH값과 직접 실험을 통해 나온 값을 비교해보는 실험이었다. pH미터기와 Electrode를 이용하여 pH값을 구할 때는 구하려는 용액의 pH를 측정하기 전에 먼저 standard로써 두 point를 잡는 것이 좋은데 experiment③에서 이론상 pH가 4.362, 5.156이므로 pH4용액[산성]과 pH7용액[중성]을 기준으로 두고 Calibration버튼을 눌러 영점조절의 역할을 하도록 한다. (기준 용액으로 pH4, pH7, pH10이 있다.) serological pipette의 volume은 최대 10㎖정도인데 한번에 그 이상을 옮기려하면 pipet aid의 고장을 유발하므로 그 이상을 옮기려면 두 번에 나눠하는 것이 좋다.이번 실험에서 사용된 이론은 pH=-log[H], Kw=[H?][OH?],pH=pKa+log[A?]/[H?A]인데, 특히 pH=pKa+log[A?]/[H?A]는 짝산, 짝염기가 있고 평행상수를 알고 있을 때 pH를 구할 수 있다.이번실험은 대체적으로 오차가 있었는데 실험①에서는 0.030,실험②에서는 1.554, 실험③에서는 각각 0.367, 0.422로 나타났다.실험①과 실험②에서는 용액을 제조할 때 오차가 생겼을 수 있고, 또는 pH측정기계의 결함에 의한 오차 일 수도 있다. 이때, 1M NaOH를{1} over {200} 0.005M NaOH로 낮출 때는, 한번에 낮추지 않고{1} over {10},

자연과학| 2013.10.25| 3페이지| 1,000원| 조회(118)

pH미터기, electrode, pipet aid, serological pi..

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Preparation of 2x SDS-Gel Sample Buffer

B-5조생명과학전공 *************.10.21TitlePreparation of 2x SDS-Gel Sample BufferMaterialspH미터기, Electrode, Voltex, Stir plate, Pipette, Pipet aid, Tip, E-Tube, Weighting paper, Balance,Tris-HCl, β-mercaptoethanol, Sodium dodecyl sulfate(SDS), Bromophenol blue(BPB), Glycerol, ddH _{2}OMethods[Preparation of 2x SDS-Gel Sample Buffer 만드는법]SolutionStock ConcentrationFinalConcentrationDilutionFactorTris-HCl(pH6.8)1M100mM{1} over {10}→100㎕β-mercaptoethanol100%5%{1} over {20}→ 50㎕SDS10%4%{4} over {10}→400㎕BPB1%0.1%{1} over {10}→100㎕Glycerol100%20%{1} over {5} →200㎕ddH _{2}O150㎕1. 위 표와 같이 용액을 Pipette을 이용해 E-Tube에 담고 Voltex를 이용해 잘 섞어준다.[Tris-HCl(pH6.8) 50㎖ 만드는법]Tris의 분자량=121.1, 1M={121.1} over {L}={12.11} over {100ml}={6.055} over {50ml}1. 물을 용액의 7~80%만 넣어준다. (약 30㎖)2. Tris를 6.055 넣고 Stir plate를 이용해 섞어준 후, pH를 측정한다. (9~10정도의 수치가 나옴)3. Pipette을 이용해 HCl을 조금씩 넣으면서 pH6.8로 맞춘다.4. 50㎖에 맞게 물을 추가한다.Result2x SDS-Gel Sample Buffer[1㎖(=1000㎕)의 파란색 점도가 조금 있는 액체]를 만들었다.[Tris-HCl(pH6.8) 50㎖ 만드는법]에서,1. Tris를 Weighting paper와 Balance를 이용해 6.055g을 넣고 Stir plate를 이용해 섞어준 후, pH를 측정한 결과 10.775가 나왔다.2. HCl을 약 1㎖씩 첨가하니 pH가 8.265,???로 점점 pH가 감소했다.Discussion이번 주 실험은 2x SDS-Gel Sample Buffer을 만드는 실험으로, 이후 2주차에 걸쳐 protein측정용액을 만들고, Gel로 만들어 전기영동을 하는 실험이다.완충액이란, 외부로부터 어느 정도의 산이나 염기를 가했을 때, 영향을 크게 받지 않고 수소이온농도를 일정하게 유지하는 용액으로 간단히 pH변화를 최소화하는 물질이다. 완충용액은 정반응과 역반응이 균형을 이루는 것이 중요한데 강산, 강염기는 정반응이 역반응에 비해 턱없이 우세하기 때문에 균형이 잘 맞지 않는다. 반면에 약산과 약염기는 해리도가 낮기 때문에 정반응과 역반응이 대체로 균형을 잘 이루고 있기 때문에 완충용액으로 약산과 약염기를 주로 사용한다. 여기서 Tris는 Pka가 8.0X로 가장 이상적인 Buffer range는 7~9이다.이번실험에서 사용한 장치로 Vortex와 Stir plate가 있는데 두 종류 모두 용액을 섞어주기 위해 사용하는 장치이나, Vortex는 적은 양의 용액을 섞을 때, Stir plate는 많은 양의 용액을 섞을 때 사용하는 것에 차이가 있다. HCl을 옮길 때 Auto pipet은 HCl의 연기 때문에 사용할 수가 없기 때문에 Pipet aid를 이용해 옮긴다.이번 실험에서 사용한 β-mercaptoethanol용액은 강력한 환원제로 cysS-Scys + 2 HOCH2CH2SH→ 2 cysSH + HOCH2CH2S-SCH2CH2OH로시스테인 간의 이황화 결합을 깨버려서 단백질의 3차구조를 풀어버리는 역할을 한다. Sodium dodecyl sulfate는 (-)charge를 띠고 있는 세제이며, Bromophenol blue는 염색을 위해 사용하는 용액으로 갈색의 빛깔을 띠고 있다가 염색을 하게 되면 푸른색으로 색이 바뀌게 된다. Glycerol은 무게감을 주기 위해 사용되는데 밀도가 물보다 높아 점성이 있다. 이때 p.1000과 Tip의 아래쪽을 약간 잘라 구멍을 크게 한 후 사용하면 좋다.[Tris-HCl(pH6.8) 50㎖ 만드는법]에서 Pipette을 이용해 HCl을 조금씩 넣으면서 pH6.8로 맞출 때, HCl을 넣으면 열이 발생하여 온도가 약30℃정도로 실온보다 높아지게 되며 이때의 pH 또한 높아지게 된다. 따라서, 조금 시간을 두고 온도가 실온인 25℃정도가 될 때까지 기다렸다가 pH를 측정해야 정확한 측정을 할 수 있다.완성된 2x SDS-Gel Sample Buffer는 -20℃에서 보관하면 오래보관이 가능하다.reference줌달의 일반화학/Zumdahl/화학교재연구회/2011/p.75~76생물학용어사전/정용재/이학전사/1999/p.38~1832013/10/21 생화학[HOMEWORK]Q.Tris PKa는 8.0X → 이상적인 buffer range pH7~9 , 하지만 이번 실험에서는 pH6.8로 만들었습니다. 왜 그럴까요?A. 단백질 전기영동법 중,SDS PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-polyacrylamide Gel Electrophoresis)-이 방법은 아미노산 측 사슬끼리의 결합(S-S결합 등)을 절단하여 아미노산이 다수 연결된 단일사슬의 polypeptide 상태로 만든다. 이것으로 polypeptide 사슬이 길수록 gel의 망에 걸려 이동도가 작게 되고, 짧은 분자일수록 이동도가 크게 된다. 그러나 단백질은 그것을 구성하는 아미노산 조성의 차이에 따라 각각 특유의 전하를 가지기 때문에, 전압을 걸면 각각의 전하에 따라 이동하게 되고, 단백질의 크기(분자량)의 차이에 의한 분리를 할 수 없다. 거기서 샘플의 단백질의 Charge를 똑같이 (-)로 하기 위해 음이온성 계면활성제인 SDS를 단백질에 결합시켜, 각각의 단백질의 Charge를 거의 일정하게 만든 후에 전기영동을 실시한다. 이렇게 함으로써 단백질의 분자량의 차이로 분리하는 것이 가능하게 된다.즉, SDS-PAGE는 질량의 차이를 이용한 분리방법으로, SDS를 이용하여 모든 단백질이 동일한 (-)Charge를 띄도록 만든 후 질량에 의한 polyacrylamide gel상에서의 이동속도 차를 이용하여 분리하게 되고, 이 때 sample buffer에 DTT나 mercaptoethanol이 첨가되어 있어 disulfide bond도 끊어지게 되어 단백질은 1차구조를 형성하여 이동하게 되는 것이다.[pH를 다르게 하는 이유]-식물체내에서 추출한 단백질은 SDS에 의해서 (-)Charge를 띠고, 전기영동을 하기 위한 Buffer에는 glycine과 Cl-가 들어있다. pH6.2에서는 Glycine이 이온화되지 못하여 중성상태이나, pH6.8에서는 일부분 (-)Charge를 띠는 상태가 된다. 전류가 흐르는 상태에서 Cl-와 Glycine사이에 단백질이 끼어 다같이 (+)쪽으로 흘러 Stacking과 Separating gel 분기점에 모인다. 이후, pH8.8에서는 Glycine이 모두 (-)Charge를 띄게 되어 Cl-와 Glycine이 먼저 빠르게 내려가고 단백질들은 사이즈에 따라서 Separating gel에서 분리되기 시작한다.Stacking gel과 Running gel은 acrylamide의 함유량도 차이를 보이지만 pH의 차이가 두 gel이 다른 역할을 하게 하는 핵심요소이다. Sample을 loading한 후 전기장을 걸어주면 단백질을 비롯한 여러 이온들이 gel을 이동하게 되는데 이 이온들에는 Cl-와 glycine 이온들이 있다. 이 이온들은 electrophoresis buffer 내에 함유된 이온들로서 이 두 이온이 단백질의 이동에 큰 역할을 하게 된다.?Stacking gelGlycine 이온은 net charge가 0이 되는 pH값이 6.2인데 stacking gel의 경우 pH가 6.8이므로 이로 인해 Cl-와 glycine 간의 이동속도의 차이가 생기게 된다. Cl-, 단백질, glycine은 모두 (-)를 띄게 되는데 Cl-는 그 분자량이 아주 작기 때문에 가장 빨리 내려가게 되고 glycine은 일부만 (-)를 띄기 때문에 이동속도가 가장 느리게 된다. 따라서 이동속도는 Cl->단백질>clycine의 순서가 된다.

자연과학| 2013.10.25| 5페이지| 1,000원| 조회(245)

완충용액, Tris-HCL, Sodium Dodecyl Sulfa, β-Mer..

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