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분자생물학실험 (분생실) Cryosection, Immunohistochemistry 레포트 입니다.

vnbmmmmfffCryosection, Immunohistochemistry서론실험 날짜 (Date)2019.05.13 / 2019.05.14 / 2019.05.28실험 목적 (Purpose)Cryosection의 정의와 특징에 대하여 알아본다Immunohistochemistry(IHC)의 정의와 특징에 대하여 알아본다.이론적 배경(Principle)Cryosection 정의 ; Cryosection은 microtome을 이용하여 frozen tissue를 낮은 온도에서 일정한 두께로 잘라, 이어지는 실험을 위한 시료를 준비하는 방법이다.모식도Cryosection 특징Paraffin or resin-embedded section과의 비교장점 ; 항원성(antigenicify)의 유지가 잘 된다. Dehydration 과정이 필요하지 않기 때문에, 비교적 짧은 시간 내에 sectioning/labeling/observation 할 수 있다.단점 ; 물리적으로 보다 불안정한 시료를 얻게 된다Cryoprotectant ; Sucrose는 대표적인 cryoprotectant인데, 급속 냉각 시 얼음 결정의 형성을 최소화하고, 형태의 손상을 막는다. 주로 30% sucrose 용액에 담가두었다가 사용한다.이론과 방법은 명확한 편이나, tissue fixation, anti-roll plate의 간격, 습도, chamber와 chamber 밖의 온도차이 등의 다양한 요인에 따라 실험 결과가 극명한 차이를 보일 수 있는 만큼 실험 전 과정을 예민하게 진행해야 한다.이어지는 실험에 따라 적정한 두께로 설정하여 section한다. (우리 실험에서는 20nm)Cryosectioning temperature ; Cryostat chamber의 optimal temperature은 sectioning tissue의 성질, frozen 방법(fresh/prefixed with cryosectioning에 따라 달라진다.) , frozen block을 -70’C freezer에서 꺼ction을 holding / d ; microtome blade holder / e ; tissue sections이 놓이는 곳 / f ; anti-roll plate 시료가 이것의 아래를 지나가며 평평해짐 / g ; blade protector사. cryosection 결과1. Typical ; 찢어지거나 의깨진 부위 없이 평평하다2. Scrunching ; 연약해진 block이 으깨진 경우, chamber의 온도를 보다 낮게 설정하여 오류를 줄일 수 있음 ( 붓을 이용해서 잘 피면 살릴 수도 있음)3. Shattering ; block이 깨지거나 조각난 경우. Chamber의 온도를 보다 높게 설정하여 오류를 줄일 수 있음Immunohistochemistry의 정의 ; Antigen – Antibody interaction을 이용하여 세포나 조직의 단백질을 localization하는 실험 방법이다.항원 항체 반응(antigen – antibody interaction)체내에서 일어나는 면역반응 중 하나로, 민감성과 특이성이 매우 높은 반응이다.이를 이용하는 IHC는 목적하는(target) 단백질(antigen)에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한다.Detection을 위한 probe와 항체가 결합하는 방식에 따라 직접법(direct method)와 간접법(indirect method)으로 나뉜다.직접법목표 단백질과 결합하는 Primary antibody에 probe가 부착되어 있는 경우비특이적인 염색이나 배경염색(background staining)의 가능성은 적지만, 서로 다른 protein을 detection하기 위해 각기 다른 antibody를 사용해야만 한다는 단점이 있음간접법2-1. 표지항체법 ; Primary antibody의 Fc region에 결합하는 secondary antibody에 probe가 직접 부착되어 있는 경우2-2. 비표지 항체법 ; Primary / secondary antibody에 probe를 부착하지 않고 추가적인 st할 수 있다.Specimen fixationIHC에 사용될 시료는 그 특성에 따라 아래 조건을 충족하도록 적절히 고정되어야 한다.목표 단백질의 위치를 파악하는데 용이하도록 해야 한다.Antigenicity를 잃지 말아야 하며, antibody의 접근성이 확보되어야 한다.Antigenicity retrieval3-1. 고정과정에서 손상된 항원성을 회복하는 방법3-2. Heat – induced antigen retrieval ; Tissue의 종류에 따라 90~110’C에서 진행되며 Aldehyde fixation(formalin fixation)과정 중 cross –link를 끊어 항원의 3차구조를 회복하기 위함3-3. Proteolytic antigen retrieval ; proteolytic enzyme을 처리하여 항원의 3차구조를 회복하기 위함. 0.05~0.1%의 enzyme을 5~30min간 처리한다.Chemical fixation ; Aldehyde(formaline), aceton, alcohol을 이용하는 방법으로, specimen의 종류의 따라 선택한다Snap freezing ; 대개 액체 질소를 이용하여 급속 냉각 시켜 고정한다.BufferWashing과 antibody dilution에 이용하는 buffer의 조성이 IHC 결과에 큰 영향을 줄 수 있다.적정농도로 희석된 antibody를 사용해야 최적의 결과를 얻을 수 있다. 이는 사용하는 antibody의 종류에 따라 다르므로, 미지의 antibody를 사용할 경우, 각기 다른 농도의 solution으로 반복적인 실험을 통해 적절한 농도를 찾아야 한다.pH ; Immunoglobulin의 등전점(isoeletric point)부근의 pH를 사용하며 보통 7.4근처이다주로 PBS(Phosphate buffered saline)나 TBS(Tris-Buffered saline)을 이용한다. (alkaline phosphate conjugated antibody를 포함한 실험에서는 phosphary antibody를 얻은 동물에서 serum을 취해 사용한다.BSA(Bovine serum albumin)나 Dried milk를 이용하기도 하는데 이는 IgG를 포함하고 있을 가능성이 있고, secondary antibody로 사용되는 anti-bovine, anti-goat, anti-sheep 등은 bovine IgG에 강하게 결합하므로 background staining을 증가시킬 수 있다.Primary antibody를 얻은 동물에서는 blocking을 위한 serum을 취하지 않는다.재료 및 방법실험 재료 (Materials)Cryosection한 슬라이드, PBS, Triton X-100, nutator, cover-slide, tube, ice, micropipette, 전자 현미경 등실험 방법 (Method)(Cryoseciton은 조교님께서 준비해 주셨음.)Cryo-section 후 slide는 RT에서 1시간만 건조시키고 -20’C에서 보관한다.1XPBS + 0.4 triton X-100으로 10min 3번 washing 한다.PBS+0.4% Tx-100 + MoM serum(50ul 이하/1ml) + 10% sheep serum로 1hr 이상 blocking 한다. (slide 1개당 400ul)PBS+0.4% Tx-100 + 2% sheep serum + Antibody(monoclonal 1;250)을 처리하고 4’C(cold room)에서 O/N으로 staining 한다. (slide 1개당 300ul)PBS+0.4% Tx-100으로 rinse 후 10min 3번 washing 한다(nutator 이용)PBS+0.4% Tx-100+2% sheep serum + Secondary antibody(1:250)을 Dark site에서 1hr 이상 staining한다 (slide 1개당 300ul)PBS+0.4% Tx-100으로 rinse 후 10min 3번 washing 한다(nutator 이용)Mounting gel을 뿌리고 covlament 단백질은 2H3 antibody로 IMC을 진행하여 WT과 MT의 단백질 발현 정도 차이를 관찰하는 실험 이었다.앞서 조교님들께서 PCR을 통해 WT과 MT sample을 만들어 주셨는데 WT로 알고 있던 tissue에는 예상대로 관찰된 것이 없었지만, MT로 알고 있던 tissue에서는 다른 형광 표시가 나타날 것이라 예상하였지만 역시 관찰된 것이 없었다.4장의 사진 모두 테두리 부분에 색을 조금 띄는데 이는 background staining이다. 예상대로 나타났으면 특정 부분에서만 관찰이 되어야 하는데 tissue의 전반적인 부분에서 관찰이 되기 때문이다.또한 예상한 결과였으면 488nm 파장에서만 특별하게 초록색으로 검출되었을 것이다(secondary antibody에 부착된 probe가 GFP이였기 때문). 하지만 흰색으로 관찰되는 것으로 보아 제대로 probe가 발현이 안되었음을 알 수 있었다.관측이 제대로 되지 않은 이유는 secondary antibody 처리 후 dark site에서 빠르게 cover glass를 덮었어야 했는데, 여러 조가 순서대로 진행하다 보니 형광물질이 다 날라갔을 것이다. 또한 secondary antibody 처리 후 2주간 보관 후 관찰 하였기 때문에, 형광 물질이 날라갔을 것이다.처음 transformation부터 마지막 IHC까지 한 학기에 걸쳐 경험해 보았다. 이 실험들을 연속적으로 한 번에 경험할 수 있는 기회가 있었으면 좋겠다는 아쉬움이 있다.질문 있습니다! 실험 때 여러 개의 슬라이드를 만들었었는데, 보내주신 4개의 tissue가 들어있는 슬라이드를 어떤 기준으로 선택하게 되었는지 궁금합니다.한 학기 동안 수고하셨습니다.참고문헌(Reference) Hyperlink "https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=DBX1" https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=DBX1 Hyperlink "http:3

자연과학| 2019.08.11| 7페이지| 1,000원| 조회(1,944)

immunohistochemistry, 분자생물학실험, 에이쁠레포트, cryo..

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분자생물학실험 (분생실) Embryo Embedding (cryosection용) 레포트 입니다.

Embryo Embedding서론실험 날짜 (Date)2019.05.07실험 목적 (Purpose)Mouse embryo Embedding의 특징과 방법에 대해 알아본다.이론적 배경(Principle)Head tissue를 sucrose에 넣어 보관하는 이유 ; 30% sucrose에 의해 녹는점이 낮아져서 ice crystal이 잘 생기지 않고 ,생기더라도 작게 생기기 때문에 최대한 sample에 attack을 가하지 않게 한다. (그 이유는, metallic ion에 결합하고 세포 자체를 dehydrate 시키는 등의 작용으로써 세포 내 수분이 어는 동안 전체 얼음 결정의 볼륨이 커지는 것을 줄이기 때문이다.) 또한 삼투 조절해서 조직이 상하지 않게 한다.일반 DW말고 OCT(Optimal Cutting Temperature) compound 사용 이유 ; cryosection용 샘플을 준비하는 데 쓰이는 끈적한 시약이며 때문에 cutting 시에 조직이 뒤틀리지 않게 잡아주는 역할을 한다. 글리콜과 수지의 수용성 블렌드로서 -10’C 이하의 온도에서 저온 유지 장치 절편을 위한 편리한 표본 모체를 제공한다. OCT는 염색 과정 중에 슬라이드에 잔류물을 남기지 않아 바람직하지 않은 배경 염색을 제거한다. OCT compound에 장착된 해부 된 조직은 -20~-80’C 사이에서 동결 될 수 있다. 발색 된 IHC 실험을 위해 개발되고 최적화된 시약이다. 10.24% w/w polyvinyl alcohol + 4.26% w/w polyethylene glycol + 85.50% w/w nonreactive ingredients 로 구성되어 있다.재료 및 방법실험 재료 (Materials)지난 시간 준비한 mouse embryo의 head sample(조교께서 PCR 통해 WT/MT 구분해주셨음), sucrose, PBS, tube, vial, OCT, 스포이드, 현미경실험 방법 (Method)(2019.05.03 실시) < Embryo의 head를 sucrose에 보관>Sucrose 12g을 PBS 40ml에 녹인다.각각 sample에 있는 PFA를 제거하기 위해 PBS로 5분씩 3번 washing 한다.PFA를 제거한 sample에 sucrose를 담아 저온실에서 overnight한다.후에 4’c 냉장실에서 보관한다.(2019.05.07 실시) Mold에 labeling한 후 OCT를 조금 채운다.OCT를 채운 mold는 영하 72’C 냉장고에서 15분정도 얼린다.OCT를 얼리는 동안 저온실에서 vial을 가져와 용액을 뺀 후 OCT를 잠길 정도로 넣어서 4’C 냉장고에 보관한다.얼려진 mold 위해 OCT를 살짝 넣어서 tissue가 달라붙지 않게 한다.WT과 MT를 각각 하나씩 정해진 위치에 놓고 현미경으로 tissue를 관찰하며 자리를 맞춘다. (WT과 MT는 조교님께서 PCR을 통해 확인해 주셨음)자리를 맞춘 mold는 영하 72’C에서 보관한다. (보관 시 꼭 평평한 곳에서 보관!) 실험 결과 (Result)- 이 상태로 얼려서 다음 실험에 cryosection을 진행한다.논의 (Discussion)지난 Dissection에서 채취한 tissue는 protease k를 넣어 오버 나잇 하면 PCR 샘플로 쓸 수 있다.Mold에 labeling 할 때 mouse의 type, 넣어준 genotype, embryo의 부모의 각각의 number, 몇 번째 embryo인지 순서, 임신 날짜, WT/MT 표시를 해주어야 하는데 학부 실험이라 디테일이 살짝 부족하여 아쉬움을 느꼈다.현미경을 다루는 것과 현미경 하에서 무언가 조작하는 것에 서툴렀는데, 이도 많이 연습이 필요하다고 생각했다.Embedding 시에 brain의 위치와 높이를 맞추는 것이 어려웠다. 조교님께서 sample 만드는 것을 보여주셨지만 미숙함을 느껴 너무 아쉬웠다.참고문헌(Reference)Hedrich, Hams J / The Laboratory Mouse / Elsebier Academic Press / 2010 / pp.555-569Hogan, Brigid, Manipulating The Mouse Embryo / Cold spring Harbor Laboratory Press / 1994 / pp.19-23,97-98

자연과학| 2019.08.11| 3페이지| 1,000원| 조회(139)

embryo, 분자생물학실험, embedding, 에이쁠레포트, ㄱㅎ대, 분생실, Molecularbiology

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분자생물학실험 (분생실) Embryo Dissection (배아해부) 레포트 입니다.

Embryo Dissection서론실험 날짜 (Date)2019.04.30실험 목적 (Purpose)Mouse embryo의 특징과 Dissection 방법에 대해 알아본다.이론적 배경(Principle)Mouse Embryonic Development쥐의 임신기간은 약 19일로, 27단계 (by Theiler stage definition)의 과정을 거쳐 태어난다.(출처 ; Hedgehog: functions and mechanisms / Markku Varjosalo and Jussi Taipale /Genes & Dev. 2008. 22:2454-2472)D0 ; fertilization / d2.5; compaction / d4.5 ; implantation / d7.5; blood islands / d7.5~ 9.5 ; gastrulation / d8.5 ; 1st somite(분절형성) / d8.5~12 ; somitogenesis/ d10.5 ; fore& hind (앞,뒷다리), limb bud(팔,다리싹) / d8.5~19.5 ; turning foetal growth and development / d8.5~14.5 ; organogenesis)쥐의 임신은 발정 주기를 확인하여 인위적으로 제어할 수 있다.질 내 세포를 채취해 염색 후 관찰했을 때 발정 주기에 따라 발견되는 세포의 종류가 다르다.발정휴지기 (diestrus) ; 다핵형 백혈구 (Polymorphonuclear leukocytes) 가 주로 관찰된다.발정전기 (proestrus) ; 각질화 (cornification)된 표피 세와 몇몇의 PMN이 발견된다.발정기 (estrus) ; 대부분의 각질화된 표피세포만 관찰된다 (4~5일)발정후기 (metestrus) ; 발정 정기와 유사Mating과 배란은 모두 발정기에 일어난다. Timed breeding을 위해서 암컷이 발정 전기일 때 수컷과 함께 둔다.Vaginal plug쥐의 발정기는 굉장히 짧은 편이기 때문에, 질 내 세포를 관찰하여 breeding 하는 것은 효율적이지 못하다.Vaginal plug는 수컷의 coagulating gland 와 vesicular gland로부터 분비된 물질이 암컷의 질부에서 응고된 것으로, mating이 있었는지 확인할 수 있는 지표가 된다.Embryo Dissection안락사 (Euthanasia)올바른 안락사의 조건 ; painless, rapid unconsciousness, and death, minimum restraint, fear and physiological stress.죽음의 인지와 확인 ; 인지(recognition) – 심박 정지, 자극에 대한 무반응 , 확인(confirmation) – 혈액/ 심장/ 내장의 제거안락사의 방법경추 탈골 (cervical dislocation) ; 두개골과 뇌를 척수로부터 분리하여 즉각적인 뇌의 손상을 일으키는 안락사 방법이다. 수의근(voluntary muscle)과 신경의 기능은 즉시 멈추게 되나, 불수의근(involuntary muscle)의 움직임은 발생할 수 있다.이산화 탄소 기법 ; 70% 농도의 CO2의 흡인은 빠른 마취효과가 있고, 이것이 지속되면 사망에 이르게 된다 (5~6분)Barbiturate ; sodium pentobarbital은 인체에 무해하나 동물에게 주사시 안락사에 이용될 수 있다.경추 탈골의 과정Mouse를 cage에 올려 앞발로 그물망을 잡도록 유도한다.엄지와 나머지 손을 두개골 하단에 두어 적당한 힘을 주어 비트는 동시에 반대 손으로 꼬리를 잡아당겨 탈골시킨다.두개골 하단을 누르는 일은 spatular나 연필로 대체해 실시할 수 있다.Embryo의 분리실험에 사용할 임신한 쥐를 absorbent paper에 올리고 70~90% Ethanol로 흠뻑 적신다. (쥐의 털로 인한 contamination을 방지)쥐의 배 쪽 피부를 살짝 꼬집어 올려 작게 가위집을 낸다.벌어진 피부를 붙잡고 머리와 꼬리쪽으로 늘려 복막이 드러나도록 한다.폴셉(forcep)과 가위를 이용해 복막(peritoneum)을 날라낸다.창자를 위쪽으로 걷어 올리면, 난소와 나팔관, 자궁을 확인할 수 있다.자궁 부위를 분리하면 PBS(Phosphate – Buffered Saline)에 넣어 둔다. (차게 유지한다.) (PBS ; Cell culture나 immunoflorescene 연구에 주로 이용. pH유지하고 cell의 삼투암을 유지한다.)Uterine horn 주변의 탈락막(decidua, fatty tissues)을 제거한다.착상 위치를 잘라 embryo를 분리한다.재료 및 방법실험 재료 (Materials)Ice, 1.5ml tube, petri dish, 4% PFA, 1X PBS buffer, 스포이드(transfer pipette, 끝을 잘라 놓는다.), 알코올, forcep, 12.5일 임신기간 갖은 mouse, 현미경실험 방법 (Method)알코올로 가위랑 forcep을 소독한다.경추탈골 시켜서 mouse를 안락사 시킨다.1.5ml tube를 ice에 박아서 준비하고 (labeling) x2(head용, tissue용)Petri dish에는 1xPBS를 부어 놓는다.배 중간 부분을 집게로 잡은 후 알코올로 소독한 가위로 자른다. 복막을 제거하고 embryo를 얻는다. 얻은 embryo는 1X PBS에 놓는다. (작은 dish에는 embryo 두 개가 적당), forcep은 중간 중간 소독한다.(embryo 채취 후 실험은 항상 1XPBS 에서 진행한다.)하나의 embryo를 막 제거, yolk sac, 등을 제거한 후 head와 tissue를 잘라낸 후 각각 tube에 담는다. (head는 1XPBS를 포함하여, tissue는 그냥 tube에 담는다)Embryo가 들어있는 1.5ml tube에 1XPBS를 제거한 후 fix를 위해 4% PFA를 넣는다.Tapping을 통해 embryo가 가라앉지 않게 한다. 저온실에 가서 shaker에서 2h fix한다.실험 결과 (Result)임신한 mouse에서 얻은 embryo의 head와 tissue를 각각 tube의 담고 head는 4% PFA에 넣어 fix한다.논의 (Discussion)이번 실험은 앞으로의 실험에서 쓰일 brain을 채취하는 과정이었다. 후에 brain을 slice 후 antibody 처리하여 활성을 확인 할 예정이다. 오늘 채취한 tissue는 PCR을 통해 mutant embryo인지 genotype을 확인하기 위해 채취한 것이다.Brain과 tissue를 채취 할 때 현미경을 사용하여 보는 것이 익숙하지 않아 현미경을 사용하지 않고 눈으로 보다가 여러 번 경고를 받았다. 현미경 사용에 익숙해질 필요성을 느꼈다.참고문헌(Reference)Hedrich, Hams J / The Laboratory Mouse / Elsebier Academic Press / 2010 / pp.555-569Hogan, Brigid, Manipulating The Mouse Embryo / Cold spring Harbor Laboratory Press / 1994 / pp.19-23,97-98

자연과학| 2019.08.11| 5페이지| 1,000원| 조회(207)

쥐해부, 분자생물학실험, 에이쁠레포트, ㄱㅎ대, 분생실, Molecularbiol..

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분자생물학실험 (분생실) Restriction Endonuclease Digestion (제한효소) 레포트 입니다.

Restriction Endonuclease Digestion , Get electrophoresis서론실험 날짜 (Date)2019.04.09실험 목적 (Purpose)Restriction Endonuclease Digestion의 정의와 방법에 대해 알아본다.이론적 배경(Principle)정의 ; Enzyme digestion (restriction digestion, DNA fragmentation)은 restriction endonuclease를 이용하여 특정 sequence를 포함한 DNA를 특정 size로 잘라 시료를 준비하는 방법이다.Restriction endonuclease(restriction enzyme) ;정의 ; nuclease의 일종으로 특정위치 (restriction site)의 DNA 분자 내 phosphodiester bond를 잘라내는 효소를 의미한다. (Nuclease에는 DNA strand의 말단에서 nucleotide를 하나씩 제거하는 ‘Exonuclease’와 DNA strand 내에서 내부의 phosphodiester bond를 끊는 ‘Endonuclease’가 있다.)분류 ; Restriction modification system(RM system)에 따라 3가지 type으로 구분한다RM system ; Bacteria를 포함한 prokaryotic organism에서 외부 DNA 유입에 대응 하기 위한 기작으로, restriction enzyme의 작용(restriction)과 self DNA를 보호하기 위한 방법인 methylation을 포함한다.Type 1 enzymesRestriction digestion과 modification을 모두 수행한다.Mg2+, S-adenosylmethionine, ATP를 cofactor로서 필요하다.DNA restriction site가 non-specific하고 fragment의 size는 1000bp 이상인 경우도 있다.Target DNA가 잘리기 전에 modification되기 때문에 유전공학적 가치는 떨어진다.Type 2 enzymes;Restriction과 Modification을 위한 단백질이 서로 분리되어있다.Mg2+를 cofactor로서 필요로 한다DNA를 specific한 site에서 자른다는 점을 이용하여 생명공학적으로 사용되고 있다. ( genome mapping, cloning, sequencing 등)Type 3 enzymes;Type 1 enzyme와 비슷하게 digestion과 modification을 동시에 수행한다.Recognition sequence의 3’end 쪽 25-27개의 bp를 인식해서 잘라낸다Mg2+가 cofactor로서 필요한다.우리가 이번 실험에서 사용한 Sal1 enzyme은 Type 2 endonuclease;Twofold rotational symmetry ; 짧은 DNA 부분이 중앙에 대해 180’ 회전시 동일하다 (palindrome)Digestion 이 후 DNA end의 모양에 따라 두 가지로 분류된다. (+ 특징)Stricky Cohesive end ; Unpaired nucleotides(overhang)을 가진 ssDNA가 있는 경우 Overhang은 상보적인 DNA와 수소결합을 통해 annealing 될 수 있다.5’ - overhang : 5’-G↓AATTC-3’3’-CTTAA↓G-5’3’ – overhang : 5’-GAGCT↓C-3’3’-C↓TCGAG-5’DNA ligase에 의한 연결 효율이 좋지만, 상보성이 없으면 연결이 되지 않는다.Blunt end ; overhang을 가진 ssDNA가 없는 경우5’-CCC↓GGG-3’3-‘GGG↓CCC-5’DNA ligase에 의한 연결 효율은 나쁘지만, 어느 end 간에도 연결이 가능하다Enzyme은 50% glycerol을 함유한 buffer에서 -20’C에서 저장한다. 실온에 오래두면 활성을 잃기 때문이다. 또한 glycerol을 넣어주면 얼지 않고 -20’C에서 저장이 가능하다. 얼었다 녹으면 결정에 의한 attack이 있을 수있기 때문이다.효소 반응의 변수 ; NaCl 농도 (buffer에 의해 조절 – two cut시 낮은 농도에서 높은 것으로), pH, 반응온도(보통 37’C, two cut시 65~80’C에서 heat inactivation), DNA와 Enzyme의 비율 등 (+두 종류의 enzyme이 같은 NaCl 농도와 같은 온도에서 활성을 가지면 같이 자를 수 있다.)Glycerol이 과하게 많은 등의 특정 조건에서 특이적 sequence 이외에서도 절단이 비특이적으로 일어난다.1 unit enzyme ; 1ug의 lamda DNA를 1 hour 동안 완전히 자르는데 필요한 양.재료 및 방법실험 재료 (Materials)Sal 1 enzyme , Miniprep.한 plasmid DNA (농도 35ng/ul과 40ng/ul) sample, 10xbuffer, DW, pipet, rack, tube, 전기영동 준비물(gel, 전기영동기계, BB solution), incubator 등실험 방법 (Method)DW 7ul miniprep.DNA 10ul, 10xbuffer 2ul, enzyme 1ul 순서로 tube에 담아 sample을 만든다. (sample 1 = enzyme 넣지 않은 것 , sample 2 = enzyme 넣은 것)Pipet으로 bubble이 생기지 않게 잘 섞어준 후 Brief centrifuge 하여 반응 할 재료들이 바닥에 모이도록 한다.37’C incubator에서 1 hour incubating 한다.Sample 10ul과 bb solution 3ul을 넣어 로딩 준비한다.완성된 agar gel에 ladder 3ul, 각각의 sample을 순서대로 13ul씩 로딩한다.220V에서 8분간 전기영동한다.결과를 확인한다. ; gel에 UV를 쏘아 형광불질을 통해 밴드를 확인한다.실험 결과 (Result)빨간 네모 안에 있는 band 가 우리 조의 결과 이다.왼쪽 band가 오른쪽 band 보다 살짝 아래 있음을 알 수 있다.논의 (Discussion)이번 실험은 지난 Miniprep DNA에 하나는 Sal1 restriction enzyme을 처리하고, 하나는 enzyme을 처리하지 않은 sample들을 전기영동을 통해 restriction enzyme이 잘 처리 되었는지, 그리고 plasmid DNA와 linear DNA의 구조에 따른 size를 비교해보는 실험이었다.실험 결과 왼쪽에 있는 band는 농도 35ng/ul에 enzyme을 처리하지 않은 Plasmid DNA 이고, 오른쪽 band는 농도 40ng/ul에 Sal1 enzyme을 처리한 Linear DNA이다.Nick이 있는 circular DNA는 부피가 제일 크기 때문에 전기 영동시 제일 위에 band가 나타나고, 그 다음 linear DNA, supercoiled circular DNA 순서로 band가 나타난다. 때문에 실험이 잘 진행된다면 각각의 sample에 하나의 band만 나타날 것이고, enzyme을 처리하지 않은 DNA가 enzyme을 처리한 DNA 보다 아래쪽에서 band가 나타날 것으로 예상하였다.Ladder를 통해 왼쪽 band의 size는 8kbp, 오른쪽 band의 size는 10kbp의 크기를 알게 되었다. 같은 길이의 bp를 가진 DNA이지만 supercoiled/linear 구조에 의해 linear DNA가 supercoiled DNA 보다 size가 크다는 예상이 사실임을 확인 할 수 있었다.또한 band가 하나씩 나왔기 때문에 외부 contamination도 없었음을 알 수 있었다.Band의 밝기가 옅은 이유는 보통 100ng/ul의 농도의 DNA 이여야 하는데 아직 미숙한 실력이기에 transformation 등의 과정에서 농도가 낮게 나와 35 , 40ng/ul의 농도를 가졌기 때문이다.참고문헌(Reference)Asubel, Fredirick M / Current Protocols In Molecular Biology / Wiley / 2003 / pp338-359CARSON, Susan / Molecular Biology Techniques pbk / Elsevier / 2012 / pp29-34

자연과학| 2019.08.11| 5페이지| 1,000원| 조회(220)

제한효소, 분자생물학실험, endonuclease, Restriction en..

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분자생물학실험 (분생실) Plasmid Preparation (Mini-prep) 레포트 입니다. 평가A좋아요

Mini-prep(Plasmid Preparation)서론실험 날짜 (Date)2019.04.02실험 목적 (Purpose)DNA minipreparation의 정의와 방법에 대하여 알아본다.Transformat (E. coli)로부터 Plasmid를 분리한다.이론적 배경(Principle)정의 ; Plasmid preparation은 plasmid DNA의 순수분리를 위한 방법으로, bacterial culture와 그에 상응하는 plasmid DNA의 양에 따라서 mini-preparation, midipreparation, maxipreparation 등으로 분류한다. 우리가 실험한 mini-preparation은 50~100ug의 DNA를 얻는데 사용하는 방법이다.Miniprep – alkaline lysis대부분의 plasmid DNA 분리 protocol은 plasmid DNA가 가지는 두 가지 특징에 착안하여 설계 되었다.Plasmid는 supercoiled circular DNA이다.Plasmid는 chromosome 보다 size가 작다.pH 12.0~12.5의 alkaline condition을 거친 linear DNA는 denaturation 되지만 circular DNA는 그렇지 않다는 점을 이용한 방법을 alkaline lysis 혹은 alkaline extration이라고 한다.Alkaline lysis 시약&시료의 역할 및 원리LB broth ; bacteria를 배양하기 위해 사용되는 액체 배지이다.Solution 1 ; glucose + EDTA + Tris-Cl(pH8.0) + lysozymeEDTA(Ethylenedinitrilo Tetra-acetic Acid) ; EDTA는 cell wall의 2가양이온(Ca2+)과 결합하여 cell wall을 약화시킨다. 또한 lysis 이후에 bacterial nuclease의 cofactor인 Mg2+와 결합하여 DNA의 degradation을 막는다.Glucose ; Lysis bu되어 용액을 등장액 상태로 만들고 삼투압을 조절함으로써 Cell의 갑작스러운 bursting을 방지한다.Lysozyme ; bacteria cell wall의 peptidoglycan의 베타 1,4 bond를 가수분해한다.Tris-Cl ; Tris는 buffer의 tris aminomethane을 완충제로 하여 pH를 일정수준으로 유지시켜주는 buffering agent로 뒤에 Cl은 HCl로 pH를 맞추는 것이다.Solution 2; NaOH, SDSNaOH(Sodium Hydroxide) ; 염기성의 pH 환경을 조성한다. Linear DNA는 염기성 환경에서 denaturation 된 후 다시 상보적인 염기와 다시 결합할 수 없는 반면, circular 한 plasmid DNA는 pH를 다시 조정하면 자신의 상보적인 염기와 보다 쉽게 renaturation 할 수 있다.SDS ; Sodium Dodecyl Sulfate로 cell membrane을 용해시켜 구성물들이 밖으로 나올 수 있게 한다.Solution 3; KOAs, Glacial acetic acidKOAs ; Potassium Acetate ; Plasmid DNA를 기타 chromosomal DNA나 다른 cellular debris와 분리하기 위해 사용한다. Single stranded DNA는 고염도 용액에서 insoluble 하기 때문에 침전시켜 분리할 수 있도록 한다. KOAs가 SDS와 만나면 insoluble한 KDS를 형성하고, 이로써 SDS를 분리할 수 있다.Glacial acetic acid ; 99.75%이상 고농도의 acetic acid로서, 염기성 환경을 중화시켜 Circular DNA를 renaturation 시킨다.이렇게 얻어낸 Plasmid DNA는 외부 stress에 민감하기 때문에 cell lysis 이후 vortexing 하지 말고 섞을 때 반드시 gentle 하게 inversion 하여 수행한다.재료 및 방법실험 재료 (Materials)Transformat coli, 3차 증류수, Alkaline lysis시약(S1,S2,S3), centrifuge, 전기영동을 하기 위한 준비물, 기본 실험준비물(pipet, rack 등)실험 방법 (Method)LB Broth에 ampicillin 2ul, 4ul을 tip 채로 넣어준다.각각 LB plate에서 colony 하나를 따서 tip 채로 넣어준다.항온실(35’C)에서 incubator에 rpm 180-200으로 16시간 O/N 배양한다.E. coli 배양액을 1.5ml tube에 채워 넣는다.Centrifuge 12000rpm 30sec 후 상층액은 버리고 1,2번 과정을 반복한다.Pellet을 다 가라앉힌 tube에 S1 buffer 250ul을 넣고 vortex해서 pellet을 충분히 풀어준다.Pellet이 다 풀어진 tube에 S2 buffer를 250ul 재빠르게 넣은 후 gentle하게 inversion 5회 실시한다.S3 buffer를 350ul 넣고 inversion 10회 후 centrifuge 12000rpm 10min 진행한다.상층액 850ul을 따서 column에 넣고 centrifuge 7000rpm 30sec 후 걸러진 액체는 버린다.Aw 500ul을 넣고 centrifuge 7000rpm에 20sec 후 걸러진 액체는 버린다.Pw 700ul을 넣고 centrifuge 7000rpm에 20sec 후 걸러진 액체는 버린다.남은 washing buffer를 제거 하기 위해 Centrifuge 7000rpm 5sec동안 공회전 시킨다.새 tube에 column을 옮긴 후 Pre-heat된 50’C DW 50ul을 넣고 1min 뒤에 centrifuge 7000rpm 30sec 진행한다.삼각 플라스크를 3차 증류수로 3번 washingTAE buffer 100ml agar 1g 넣고 3분 전자레인지에 돌린다.Agar가 굳지 않을 정도로 식힌 후 (약 25분) noble view 10ul 넣어준다.트레이에 부어 식힌다.완성된 agar gel에 lad 각각의 sample(DNA 10ul BB solution 3ul)을 순서대로 13ul씩 로딩한다.220V에서 15분간 전기영동한다.결과를 확인한다. ; gel에 UV를 쏘아 형광불질을 통해 밴드를 확인한다.LB broth E.coli 처음 centri 후Electorphoresis실험 결과 (Result)논의 (Discussion)이번 실험은 지난 시간까지 transformation 후 배양한 E. coli에서 Cell을 깨고 Plasmid DNA를 얻어 확인하는 실험이다. 원래 계획은 얻은 plasmid DNA를 O.D 값을 측정하여 농도를 알아보려 하였으나 실험실 사정상 전기영동을 통해 Plasmid DNA를 잘 얻었는지 확인 하는 것으로 계획을 바꿨다.Ladder 포함 왼쪽에서 4,5번째 band가 우리 조의 band이다. LB broth에서 배양할 때 4번째는 amp 2ul, 5번째는 amp 4ul을 넣어주었다. 이미 plate에서 배양을 할 때 amp을 넣어주어 항생제 내성이 없는 균들은 다 사라졌고, transformation 한 E. coli가 amp 저항이 있어 살아난 것을 확인하였지만 broth에서 배양할 때에도 amp를 넣어주는 이유는 plate와 같은 환경을 만들어주어 stress를 받지 않고 plate와 같은 환경에서 자랄 수 있도록 해 준 것이다.Amp 2ul을 넣은 E. coli와 4ul을 넣은 E. coli의 band를 비교하여 amp을 더 많이 넣어주었을 때 어떠한 일이 일어나는지, 혹은 일어 나지 않는 지를 비교하면 좋았을 것이다. 하지만 2ul의 band가 잘 나오지 않은 이유는 sample을 만드는 과정에 둘 다 band가 한 줄로, 같은 위치에서 나타나는 것을 보아 별 문제가 없는 것 같았다. 하지만 전기영동을 기다리는 과정에서 다른 조원이 sample을 떨어뜨리는 실수가 있었고, 그 때 뚜껑이 열려 일부 DNA가 소실되어 loading 양에 차이가 있었다. 2ul sample에 맞추어 4ul sample의 volume을 을 수도 있는데 실험 당시에 그 생각을 하지 못하였다. 혹은 양은 비슷하게 넣었는데 loading시 technic의 문제로 일부가 흘러나갔을 수도 있다.( 우리조의 4ul band와 다른 조의 2,4ul band를 비교해 보아도, 3조의 2ul band는 우리 조의 4ul band 보다 진하게 나왔고, 4조의 2ul band는 우리 조의 4ul band 보다 연하게 나오는 것을 보아 LB broth에서배양할 때 2ul, 4ul amp 차이는 크게 영향을 미치지 않음을 예측하였다.)실험 과정에서 Aw, Pw의 역할. 둘 다 washing buffer이다. Aw는 E. coli에 있었던 endonuclease가 일부라도 남아있을 것을 대비하여 endonuclease를 없애기 위해 사용한 washing buffer이다. Pw는 DNA 말고 negative charge를 띄고 있는 다른 물질을 제거하기 위해 사용한 washing buffer 이다.Q. Alkaline Lysis의 mechanism을 쓰시오.앞서 princple에 각각 Solution 1,2,3에 있는 물질들의 작용과 역할을 적었다.Q. 3차 증류수를 넣었을 때 bead에서 plasmid DNA가 왜 떨어지는지 이유를 쓰시오.DW에 의한 hydration이 ion-exchange site의 밀도와 bead(resin)와 다른 ion(우리는 DNA) 간의 selectivity를 줄이기 때문이다.참고문헌(Reference)Asubel, Fredirick M / Current Protocols In Molecular Biology / Wiley / 2003 / pp75-84Das, Surajit, and Dash / Microbial Biotechnology – a Laboratory Manual for Bacterial Systems / SpringerVerlag / 2015 / pp28-33CARSON, Susan / Molecular Biology Techniques pbk / Elsevier / 208-39

자연과학| 2019.08.11| 6페이지| 1,000원| 조회(671)

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