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생화학실험레포트 Transformation (형질전환)

Transformation1. Abstract이번 실험에서는 competent cell에 heat shock을 통해 ligate를 주입하여 transformation시키는 실험을 하였다. Transformation된 cell pellet을 plate에 spreading 한 후 colony가 형성되는 것을 관찰하였다.2. Introduction1) Transformation이란??형질전환(Transformation)이란 외부 DNA를 숙주 세포 내에 넣어주어 세포가 원래의 성질과는 다른 새로운 유전형질을 추가로 얻게 되는 것을 말한다.?3) Competent cell이란?Competent cell이란 정상적인 bacteria에 화학적 처리를 하여 DNA가 잘 들어갈 수 있게 만든 cell을 의미한다. ligation을 마친 DNA나 circular 형태의 plasmid를 증폭하기 위해서, 혹은 cloning을 끝내고 완성된 vector를 expression하기 위해서 E.coli에 transformation 해야 하는데, 이 때 사용하는 E.coli host cell을 competent cell이라고 부른다.3. MaterialsCompetent cell, Ligate, LB plate, X-gal, IPTG, Shaking incubator, Bacterial incubator, Water bath4. Methods1. Deep-freezer에서 미리 만들어 놓은 competent cell을 가져와 얼음에 둔다.2. Competent cell이 녹은 후 ligate를 5ul 넣는다.3. 얼음에서 7분간, 42℃ water bath에서 1분 30초 동안, 다시 얼음에서 7분간 처리한다.4. LB broth를 750ul 넣어둔다.5. Shaking incubator에서 200rpm, 37℃, 1시간 배양한다.6. 1시간 동안, 사용할 plate를 bacterial incubator에서 pre-warming한다.7. 1시간 후, 배양된 cell을 1300rpm, 22℃, 10분간 원심분리한 후 상등액을 제거한다.8. 새로운 LB broth를 100ul를 이용하여 형성된 cell pellet을 re-suspension 후, 미리 준비한 plate에 spreading한 후 bacterial incubator에서 overnight로 배양한다.9. 다음날 plate에 형성된 colony의 수를 확인한다.5. Results6. Discussion1. Competent cell을 제작하는 방법은 무엇이 있는가?? divalent cation(Ca2+, Rb2+)을 사용한다.(주로 CaCl2) 세포막에 존재하는 Diacylglycerol의 (-) charge를 중화시킴으로써 DNA phosphate의 (-) charge와 척력을 줄이고, 또한 세포막 고유 charge가 변함에 따라 막 구조의 불안정을 야기시켜 막이 흐물흐물해지게 되는데, 이렇게 만든 competent cell에 heat shock을 가하면 불안정해진 막을 통해 DNA가 들어가게 된다.* Competent cell 제조 시 항상 낮은 온도 (약 4℃)에서 수행해야 함 → 저온유지는 세포막을 응고시켜 charge의 분포를 안정화시키며 cation에 의하여 효과적인 charge shield 형성에 도움을 줌? Electroporaion : 세포와 DNA의 혼합액에 고전압을 순간적으로 흘려주어 세포막에 통로가 생겨 DNA가 통과되도록 하는 방법2. Transform 된 colony를 확인하는 방법은 무엇인가?? Antibiotics resistance gene을 이용한 selection2개의 antibiotic resistance gene 중 하나에 MCS가 존재 → 형질 전환이 일어난 대장균은 Ampicillin 내성을 나타내고 Tetracycline 감수성을 나타내게 됨 → Ampicillin배지에서 살아남고 Tetracycline배지에서 죽는 colony를 선별? Lac Z를 이용한 color selection* IPTG : Allolactose analog로 lac repressor에 결합하여 repressor tetramer를 lac operator에서 제거 → Lac Z gene을 활성화 → β-galactosidase발현* X-Gal : Lactose analog로 β-galactosidase에 의해 분해되면 푸른빛을 띤다 → blue colony 형성∴ Lac Z의 MCS에 target gene이 재조합되지 않은 대장균의 colony는 X-Gal을 분해할 수 있으므로 푸른빛을 띠고, target gene이 재조합된 대장균의 colony는 X-Gal을 분해할 수 없어 흰색을 띤다.

자연과학| 2017.04.13| 5페이지| 1,000원| 조회(421)

형질전환, Transformation, 생화학실험, 형질도입, 생화학실험레포트

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생화학실험레포트 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 평가A+최고예요

Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)1. AbstractSDS-PAGE를 이용한 일반적인 단백질 분리는 단백질을 분자량에 따라 분리하는 방법이며 가장 보편적이고, 간단한 방법 중의 하나이다. 지난 실험때 추출한 단백질에 reducing agent(SDS)를 가하여 polyacrylamide gel내에서 전기영동시킨 후 staining하여 분자량을 확인하였다.2. Introduction전기영동은 전기장 안에서 하전된 입자가 반대 전하를 띈 양극 또는 음극 쪽으로 이동하는 현상을 말한다. 물질의 이동 속도는 입자의 전하량, 크기와 모양, 용액의 pH와 점성도, 용액에 있는 다른 전해질의 농도와 이온의 세기, 지지체의 종류 등 여러 가지 요인에 의해 결정된다. Gel을 이용한 분자의 이동이 gel의 pore size는 미세 통로의 크기이며 capacity를 결정한다. Acrylamide를 cross-linker로 중합한 polyacrylamide은 acrylamide와 cross-linker의 농도 및 비율에 의해 gel내 미세통로의 크기를 조절할 수 있어 다양한 크기의 생체 분자들을 분리할 수 있을 뿐만 아니라 높은 정밀도와 고 분해능으로 오래 전부터 단백질, 핵산 등의 분리에 널리 사용되어 왔다.Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)는 단백질을 비교, 정량, 동정하는데 빠르고 효과적인 방법이다. SDS-PAGE는 단백질을 주로 분자량에 따라서 분지한다. SDS는 단백질의 소수성 부분에 결합하여 단백질의 접힘을 파괴하여 사슬을 펼쳐진 형태로 만들어 SDS-단백질 결합체가 일정한 전하 대 질량비를 갖게 함으로서 gel에서 분자량 크기에 따라 분리하게 된다.단백질 전기영동에 있어서 광범위하게 쓰이는 SDS-불연속 전기영동법 (SDS-discontinuous PAGE)은 gel이 pH와 acrylamide 농도가 다른 두 부분으로 되어 있어 많은 용적의 시료를 로딩 하더라도 좋은 해상도를 얻을 수 있는 장점이 있다.3. Materials단백질, SDS-loading buffer, 30% acrylamide mix, Running buffer, 1.5M Tris-HCl (ph8.8), 1M Tris-HCl (ph6.8), 10% SDS, 10% APS, TEMED, Size marker, pipet, tip, beaker, heat block, tube? Fixing solution (50% methanol, 10% glacial acetic acid)? Staining solution (0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250, 50% methanol, 10% glacial acetic acid)? Destaining solution (40% methanol, 10% glacial acetic acid)? Storage solution (5% glacial acetic acid)4. Methods1. Gel casting unit을 조립한다2. Resolving SDS-Polyacrylamide gel 제작 (20~30min)12% resolving SDS-polyacrylamide gelD.W3.3ml30% acrylamide mix4.0ml1.5M Tris-HCl (ph 8.8)2.5ml10% SDS100ul10% APS100ulTEMED4ulTotal10mlmix후 조립된 glass plate 사이에 resolving gel을 붓는다 (이때 comb의 끝에서 1~1.5cm 정도의 stacking gel를 위한 공간을 남긴다)3. 물 또는 ethanol, iso-propanol을 조심스럽게 resolving gel 위에 overlay한다.20~30min후 물 또는 ethanol, iso-propanol을 제거하고 DW로 여러 번 washing4. Stacking SDS-Polyacrylamide Gel 제작 (20~30min)5% Stacking SDS-polyacrylamide gelD.W2.1ml30% acrylamide mix500ul1M Tris-HCl (ph 6.8)380ul10% SDS30ul10% APS30ulTEMED3ulTotal3mlResolving gel위에 stacking gel을 붓고 comb를 꽂음SamplingProtein (20ug)4X Dualcolor Protein loading buf5ul20X Reducing agent1ulUp D.W 20ul5. Protein sampling6. 준비된 sample은 100℃에서 5min후 ice에 보관7. Comb를 조심히 뽑고, gel을 2~3번 washing8. Gel running tank에 장착후 running buffer를 넣은후, molecular weight size marker와 sample을 loading후 BPB가 gel 끝에 올 때까지 전기 영동을 한다(80V 15min, 100V 1H~1H30min)9. Gel을 running buffer에 잠시 담궈둔다.10. Gel을 fixing solution에 1시간 동안 보관한다11. Staining solution으로 gel을 20분간 염색한다. 이때 staining solution이 포함되어 있는 gel container를 살살 흔들어 준다12. De-staining solution을 이용하여 색이 빠질때까지 gel을 행궈준다13. De-stain된 gel은 storage solution에 보관한다5. Results오른쪽에서 5번째 밴드입니다.6. Discussion? Stacking gel이 필요한 이유는 무엇인가?Stacking gel은 단백질들의 Starting line을 동일하게 만들어 줌으로 분자량의 차이에 따른 비교를 좀 더 정확하게 할 수 있도록 해준다. Stacking gel에서는 낮은 pH조건으로 인해, glycine이 거의 중성을 띠게 되므로 국부적인 전류 감소현상이 유발된다. 따라서 이동도가 빠른 Cl-와 이동도가 느린 glycine이온 사이에서 높은 전위차가 발생하게 되고, 이런 전위차로 인해 glycine이 Cl-를 빠르게 뒤쫓게 된다. 그리고 단백질은 이 둘 사이에서 축적되어 이동되어진다. Cl-와 glycine 이온의 간격은 수 mm로서 많은 용적의 시료에 있던 단백질들도 running gel에 들어가기 전에 이 사이에 축적되어 해상도를 높이는 효과를 보게 된다. 그러나 이때에는 stacking gel이 large-pore gel이므로 미세통로 크기에 따라 단백질의 molecular sieving이 일어나지 않는다.? SDS-polyacrylamide gel이 전기 영동이 잘되었는지는 어떻게 확인할 수 있는가?Loading이 완료된 gel을 Staining solution으로 염색Coomassie blue : 단백질의 positively charged amino acid와 aromatic amino acid에 결합

자연과학| 2017.04.13| 5페이지| 1,000원| 조회(255)

생화학실험, 전기영동법, SDS PAGE, Sodium Dodecyl Sulf..

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생화학실험레포트 Restriction enzyme digestion & agarose gel electrophoresis (제한효소 및 전기영동법)

1. Abstract이번 실험에서는 지난 시간까지 재조합한 후 추출한 plasmid에 EtBr, loading dye와 restriction enzyme을 처리하여 agarose gel electrophoresis한 후 UV 존재하에서 확인하는 실험을 하였다. restriction enzyme을 처리한 DNA와 처리하지 않은 DNA를 각각 전기영동하였다.2. Introduction제한효소는 분자생물학의 기본 작업인 클로닝은 물론 유전체의 비교분석 실험 등에 널리 사용되고 있는 기초적인 실험도구 중 하나이다. 현재까지 약 18,000여종의 제한효소가 다양한 미생물에서 보고되고 있으며, 이중 약 640여종이 제품화되어 판매되고 있는 실정이다. 제한효소는 미생물의 방어기작 중 하나로 외래 유전물질의 침입에 대처하기 위한 미생물의 자구책으로 진화하고 있다. Methyltransferase에 의해 메틸기가 유전자에 수식되는 방법으로 이뤄지며, 제한효소는 메틸기가 도입된 자기 유전자와 메틸기가 없거나 메틸화 패턴이 다른 외래 유전자를 정확히 구분하여 절단함으로써 외래유전자를 제거한다.

자연과학| 2017.04.13| 5페이지| 1,000원| 조회(388)

제한효소, 생화학실험, Restriction Enzyme D, 전기영동법, Ag..

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생화학실험레포트 Protein extraction & Quantification 단백질추출 및 정량

Protein extraction & quantification1. Abstract이번 실험에서는 BSA standard에 Bradford reagent를 넣어 각 농도별 흡광도를 측정하여 standard curve를 그린 후 그에 따라 미지시료의 농도를 알아내는 실험을 하였다. 이 중 이번 실험에서 사용한 단백질 정량법은 Bradford assay이며 이 방법은 Coomassie Blue G-250라는 염료가 단백질과 결합할 때 최대 흡광도(λmax)가 465nm에서 595nm로 이동하게 되고 595nm에서 최대흡광을 하면 푸른색을 띈다는 것을 이용한 정량법이다. 이번 실험에서는 단백질 시료의 흡광도가 0.2615로 standard curve에 적용시켜본 결과 그 농도가 약 0.985117㎍/μl 임을 알 수 있었다.2. Introduction단백질 정량이란 시료 내에 포함된 단백질의 양 또는 농도를 구하는 과정으로 대부분의 생화학 실험의 기본이 되는 과정이다.Bradford assay는 UV-Visible spectrophotometer를 이용, 흡광도를 측정하여 standard 물질인 BSA (Bovine Serum Albumin)을 기준으로 자신의 시료에 단백질이 얼마만큼 들어있는지 측정하는 방법 중 하나이다. 신속하고 간편하게 단백질을 정량할 수 있어 널리 쓰인다. Dye로는 Coomassie Blue G-250를 사용하며, 이 Dye가 단백질과 결합래 생기는 파장의 변화를 측정한다.세포내의 pH에서 Bradford reagent는 전하를 띠게 되는데, protein의 아미노산도 전하를 띠고 있으므로 서로 결합하게 된다. 결합하게 되면 색깔이 갈색에서 푸른색으로 바뀌게 되는데 이것이 파장 595nm의 빛으로 관찰될 수 있다. 단백질과 결합한 Bradford reagent의 양이 증가할수록 빛의 흡수 역시 늘어나기 때문에 이 원리로 단백질의 양을 측정할 수 있다. 하지만 detergent에 영향을 받으므로 cell lysis나 그 외 실험 중 detergent를 사용하면 측정값에 오차를 나타 낼 수 있다. 또, 반응액 자체가 산성이라 지질이 많이 함유된 샘플에서는 침전이 생길 수 있다.Spectrophotometer는 특정 파장의 빛이 화학물질에 의해 흡수되는 정도를 측정하는 측정이기다. 보통 용액 상태의 시료를 빛을 잘 통과시키는 96 well-Plate에 넣고 단일 파장의 빛을 비추어 빛이 시료에 의해 흡수되는 정도를 측정한다. 특정 파장의 빛이 시효에 흡수되는 정도를 흡광도(absorbance)라 하며 A또는 OD(optical density)로 나타낸다.실제 시료용액의 흡광도는 시료자체에 의한 흡광 뿐 아니라 96 well-Plate이나 완충액과 같이 시료용액을 이루는 다른 물질에 의한 흡광까지 합쳐져서 측정된다. 이 중 시료 자체에 의한 흡광만을 측정하기 위해서는 시료의 양을 통제 변인으로 설정한 대조군의 흡광도를 측정하여 알고자 하는 시료의 흡광도와 대조군 사이의 흡광도의 관계를 규명하면 된다.3. MaterialsCentrifuge, Pipet, Cell, lysis buffer, Bradford reagent, 96-well plate, ELISA reader, Bovine serum albumin (BSA)4. Methods1. Cell in 1.5ml microfuge tube (1 x 105 이상)2. Tube에 lysis buffer (RIPA)를 200ul를 넣고 pipetting3. -20℃ for 20 min4. Centrifugation 13,000rpm, 4℃ for 20 min5. fresh tube를 준비함6. centrifugation이 완료되면 상등액만 조심히 fresh tube로 옮김7. ice나 -20℃ 냉동고에 보관8. BSA를 준비함9. 96-well microplate에 BSA (200ng, 400ng, 600ng, 800ng, 1000ng)를 준비함 (BSA = 100ng/ul)0200ng400ng600ng800ng1000ng추출BSA (ul)0ul + 50(DW)2ul + 48(DW)4ul + 46(DW)6ul + 44(DW)8ul + 42(DW)10ul + 40(DW)1ul (단백질)+49ul (DW)Bradford reagent (ul)5050505050505010. Bradford를 넣고 5분후 ELISA reader를 이용하여 값을 측정함. 측정한 data를 이용하여 standard curve를 그려준다.11. Standard curve를 이용하여 추출한 단백질의 양을 계산함5. Results6. Discussion1. 추출한 단백질의 양은 얼마인가?→ 0.985117μg/1μl2. 세포나 조직에서 단백질 추출시 단백질 변성을 막기 위해선 어떠한 처리를 해야하는가?→ Protease inhibitor을 처리, 저온처리3. Bradford assay의 단점은?→ Coomassie dye ligand는 단백질의 positive charged된 부분에 결합하기 때문에 Basic amino acid인 His, Lys, Arg 잔기가 필요하다.→ Coomassie dye는 염, detergent, 지방 등에 의해 쉽게 영향을 받는데 sample에 이러한 것들이 조금이라도 존재할 경우 정량값의 오차가 커진다.

자연과학| 2017.04.13| 4페이지| 1,000원| 조회(808)

생화학실험, Protein extraction, Protein Quantif..

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생화학실험레포트 plasmid DNA isolation (mini-prep) 평가A좋아요

Plasmid DNA isolation (mini-prep)1. Abstract이번 실험에서는 지난 시간에 배양한 미생물의 단일 colony를 분리 후 배양하여 resuspension solution, lysis solution 등을 넣어 cell wall과 cell membrane을 파괴한 뒤 plasmid를 추출하는 실험을 하였다.2. Introduction박테리아에서 존재하기도 하고 존재하지 않기도 하는 수상한 DNA가 바로 plasmid이다. 박테리아에는 자신이 꼭 가져야 할 chromosomal DNA 이외에 아주 작고 동그란 DNA가 따로 있을 수 있다. 이 DNA가 plasmid이다. 이 DNA는 replication origin이 있어서 chromosomal DNA와는 상관없이 자가 복제(self-replication)할 수 있다. 세포 내에서 chromosomal DNA가 복제된다면, 이 세포는 반드시 구 대로 나뉘어져야 한다. 그런데, plasmid는 한 세포내에서도 많은 수를 가지고 있을 수 있다. 한 세포당 몇 개까지 가질 수 있는가를 plasmid의 copy number라고 하고 이는 plasmid의 성질에 다라서 다른데, 많게는 1,000개까지 된다. 즉, 어떤 plasmid는 한 세포에 1,000개의 동일한 plasmid를 가질 수 있다는 것이다.Plasmid DNA를 추출하는 기본적인 원리는 박테리아의 cell wall과 cell membrane을 부수고 DNA 만을 분리하는 것이다. 이때 중요한 것은 박테리아가 원래 가지고 있는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 구분하여 분리하는 것이다. 이 둘은 모두 DNA이므로 성질이 비슷하기 때문에 구분하여 분리하기가 쉽지 않다. 다행이 chromosomal DNA는 분리 과정에서 linear 형태가 되고 크기가 상당히 크기 때문에 이런 성질의 차이를 이용하면 분리할 수 있다. 여기서는 kit를 사용하여 분리하는 방법에 대해 알아보겠다.3. MaterialsDokdo-PrepTM Plasmid DNA Mini-prep Kit (EBD-1001, Elpis Biotech)- Dokdo-PrepTM Spin Column (Spin column contains 2ml collection tube)- Cell Resuspension Solution (Sol Ⅰ)- Cell Lysis Solution (Sol Ⅱ)- Neutralization Solution (Sol Ⅲ)- Wash Buffer (Before use, add 80ml of absolute ethanol (>98%) to 20ml Wash Buffer- Elution Buffer- RNase A SolutionMini centrifuge1.5ml centrifuge tubePipette and Tip4. Methods①. White colony를 조심히 따서 항생제가 포함된 LB broth에 overnigth으로 배양한 cell을 4℃에서 2500rpm으로 10분 동안 원심분리 하여 cell down 시킨후, 상등액을 완전히 제거한다.②. Cell resuspension solution을 250ul 넣고 pellet과 섞이도록 잘 pipetting 한 후 새로운 fresh tube로 옮긴다.③. Cell lysis solution을 250ul 넣고 조심히 4~5회 inverting 해준다. 이때 용액의 점성이 높높아지는 것 확인할 수 있다.④. Neutralization solution을 350ul 넣고, 조심히 4~5회 inverting 해준다. 이때 흰색 덩어리가 생기는 것을 확인할 수 있다.⑤. 상온에서 13,000rpm으로 10분간 원심분리 한다.⑥. 흰색 덩어리가 벽에 붙어 있는데, 떨어지지 않게 용액만 Spin column으로 옮긴다.⑦. 상온에서 13,000rpm으로 1분간 원심분리 한다.⑧. Collection tube로 빠져나온 용액을 버리고, column을 collection tube에 다시 끼운다.⑨. Wash solution을 750ul 넣고, Repeat Step 7-8.⑩. 상온에서 13,000rpm으로 1분간 원심분리한 후, collection tube는 버리고 column을 새로운 1.5ml centrifuge tube에 끼운다.⑪. 50~100ml의 elution buffer를 넣고, 상온에서 1분간 기다린다.⑫. 상온에서 13,000rpm으로 1분동안 원심분리한다.⑬. Nano-drop이나 spectrophotometer를 이용하여 추출한 plasmid를 정량한다.5. Resultsng/ulA260A280260/280260/230Constant1차35.250.7050.4831.461.63502차35.090.7020.4541.551.6150평균35.170.70350.46851.5051.6250A260은 260nm에서의 흡광도이고, A260 = 1일때 DNA 농도는 50ng/ul이다.A260/A280의 비가 1.8~2.0이면 단백질로 인한 오염이 적고 고순도의 핵산샘플이라고 볼 수 있고, 그 이하인 경우엔 단백질이 많이 섞여있다고 할 수 있다.6. Discussion①. Plasmid DNA가 없을 때 어떻게 처리하여야 하는가 혹은 무엇을 확인하여야 하는가?plasmid DNA가 분리되지 않았다면, plate에 배양했던 competent cell의 colony를 다시한번 확인해야한다. target gene이 재조합되지 않아 β-galactosidase가 발현된 cell들의 colony는 X-Gal을 분해하여 푸른 색을 띠게 되는데, 푸른색의 colony가 아닌 흰색 colony로부터 cell들을 추출하여 배양하여야 한다. 또한 배지에 항생제가 제대로 도포되지 않아 형질전환된 cell들이 제대로 selection되지 않았을 수 도 있다.

자연과학| 2017.04.13| 3페이지| 1,000원| 조회(405)

플라스미드, DNA isolation, Plasmid DNA isolatio, 플라스미드 DNA

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