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[서울대학교] Cell Transfection

Cell Transfection1. 실험과정 및 결과(1) 1주차 : 계대배양① 기존의 medium을 제거하고 DMEM F12(serum이 없는 medium)으로 washing한다.② Trypsin을 추가하여 배지에 부착된 세포(HFF cell)들을 떼어내고 잘 반응하도록(trypsin이 효소이기 때문) 37℃에서 5분동안 incubation한다.③ MEM(serum있는 medium)으로 반복적으로 washing 하여 trypsin을 제거한다.④ Tube에 넣어 300rpm으로 5분 동안 원심분리하여 상층액인 medium은 제거하고 밑에 가라앉은 세포를 추출한다.⑤ MEM(Serum을 포함하는 medium) 10ml으로 resuspension한다.⑥ 결과물을 well에 1~2ml씩 넣어 흔들어주고 incubation한다.* 이때 well마다 적합한 세포의 수를 맞추기 위해 이를 cell counting 을 실시해야 하지만 실습에선 생략했다.(2) 2주차 : Transfection① DNA vector(GFP포함)를 lipofectamine과 함께 넣어 30분간 incubation한다.② Incubation한 결과물들을 well에 각각 500μL씩 넣어주고 다시 incubation한다.(3) 3주차 : 결과확인PreAfterAfter_GFP2. 논의(1) Lipofectamine의 역할(2) Transfection의 효율이 낮은 이유와 그 해결책① Confluency : Confluency란 쉽게 말해서 세포의 밀도를 나타내는 개념이다. 세포 밀도가 적합하지 않거나 stationary phase에 있는 세포를 transfection에 사용하면 안된다. 왜냐하면 세포 밀도가 너무 높으면 contact inhibition으로 인해 핵산을 덜 받아들이거나 도입된 유전자의 발현이 떨어질 수 있고, 활발하게 분화하고 있는 세포가 stationary phase의 세포에 비해 외부의 핵산을 더 잘 받아들이기 때문이다. 반면 세포 밀도가 너무 낮을 경우도 transfection 효율이 낮으므로 적당한 범위의 cofluency가 필요하다. 이번 실험에서는 cell counting을 실시하지 않았기 때문에, 이것이 바로 transfection에 가장 크게 영향을 끼친 요인이라고 생각한다.☞ Cell counting을 통해 transfection에 적합한 confluency를 맞춘다. Cationic lipid transfection reagent를 이용할 경우, 70~90%의 confluency 혹은 5×105~2×106 cells/mL의 밀도가 높은 효율을 얻는데 적합하다.② Serum : 일반적으로 serum은 transfection 효율을 높이지만, cationic lipid transfection reagent를 이용한 transfection의 경우 그렇지 않을 수도 있다. 왜냐하면 serum의 몇몇 단백질들이 DNA-lipid complex의 형성을 방해하기 때문이다.☞ Serum의 존재를 고려하여 cationic lipid transfection reagent의 최적화된 양을 다시 설정한다.③ Antibiotics : Cationic lipid transfection reagent는 세포막의 투과성을 증가시키기 때문에 DNA vector가 세포 내로 들어갈 때 항생제도 같이 들어가서 세포에 독성을 나타내고, transfection효율을 감소시킬 수 있다.☞ 항생제 사용을 되도록 피한다. 하지만 이는 반대로 오염될 가능성을 높이기 때문에, 오염을 방지할 다른 대책을 세워야 한다.④ Type of molecule transfected : 일반적으로 plasmid가 DNA vector로 가장 널리 사용되는데, linear한 형태보다 supercoiled(나선 모양으로 꼬인)한 plasmid DNA가 transfection 효율이 높다.☞ Plasmid가 linear할 경우 supercolied한 형태를 사용한다.⑤ Contamination : 오염된 세포나 medium은 transfection 결과에 큰 악영향을 끼칠 수 있으므로 주의해야 한다.☞ 이번 실험에서 조교님이 언급했던 clean bench의 laminar air flow와 항생제들이 오염을 방지하는 역할을 한다.

의/약학| 2016.04.13| 1페이지| 1,000원| 조회(237)

생명공학, 생화학, 생물, plasmid, 서울대학교, 생물공학, 세포배양, Cell..

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[서울대학교] Cell culture - Subculture (세포배양, 계대배양) 평가B괜찮아요

4. Cell culture - Subculture1. Cell culture시 유의사항세포 배양 시 고려해야 할 점은 다음과 같이 크게 3가지 측면으로 나눌 수 있다. 먼저 세포가 필요한 영양과 환경을 모두 갖추었는지 확인해야 한다. 이번 실습에서는 African green monkey의 신장에서 얻은 Vero cell을 사용하였고 medium으로 DMEM을 사용하였다. DMEM에는 세포 성장을 위한 각종 아미노산과 이온, 에너지원이 포함되어 있고, phenol red라는 성분이 포함되어 pH indicator의 역할을 하고 FBS(fetal bovine serum)는 growth factor를 함유하고 있어 세포 성장을 돕는다. 두 번째로, 세균에 의한 오염도 주의해야 한다. 이를 위해 세포배양은그림 1. Cell growth curve와 subculture2. 결과 및 고찰Trypsin을 처리하기 전과 후에 세포의 모양을 다음과 같이 현미경으로 관찰하였다.그림 2. Trypsin 처리 전(왼쪽)과 처리 후(오른쪽) Vero cell의 현미경 관찰그림 2에서 볼 수 있듯이, trypsin처리 전과 후의 세포 형태에 많은 차이가 있다. Trypsin 처리 전에는 약간 각이 져 있으면서 오밀조밀하게 모여있는 반면, trypsin 처리 후에는 동그란 모양으로 자유롭게 부유하는 세포를 많이 관찰할 수 있었다. 하지만 trypsin처리 후에도 plate에 부착되어 있는 세포들이 많다고 생각했었는데, 이 세포들을 plate로부터 더 떼어내기 위해서는 trypsin을 버리지 않고 함께 incubation을 하거나 incubation시간을 증가시키면 될 것으로 생각한다. 하지만 trypsin처리가 너무 과하면 세포가 손상될 수 있으니 주의해야 한다.또한 중간에 세포들이 녹아있는 medium을 버리는 과정이 포함되어 있다. 이는 다음과 같은 의미를 가지고 있다. 세포가 trypsin에 의해 plate로부터 잘 분리되어 medium에 균등하게 녹아있다고 가정했을 때, 버려준 medium의 양만큼 원래 배양되어 있던 세포의 수도 감소하고, 그만큼 새로운 세포가 그 자리를 차지하게 될 것이다. 만약 버려준 medium의 양이 작으면 새로운 세포가 성장할 수 있는 공간이 작기 때문에 나중에는 노쇠한 세포밖에 실험에 사용할 수 밖에 없고, 심하면 monolayer가 죽을 수도 있으므로 medium을 너무 많이 남기지 않도록 한다.사실 이번 실험에서 가장 문제되는 것은 bacteria에 의한 오염이다. 왜냐하면 subculture는 원칙적으로 clean bench에서 실시해야 하지만 이번에는 일반 실습실에서 진행하게 되었기 때문이다. 이렇게 실습환경이 좋지 않았기 때문에 세균에 의한 오염을 방지할 수 있는 대책으로 먼저 항생제(penicillin-streptomycin) 농도를 평소에 사용하는 것보다 높게 유지하는 것을 생각해 볼 수 있다. 하지만 항생제가 과도하면 오히려 세포에 독성을 나타낼 수도 있기 때문에 세포를 해치지 않을 정도까지만 증가시켜야 한다. 또한 세포 배양 과정 중에 세균에 의한 오염 여부를 수시로 체크하는 것도 중요하다고 생각한다. 예를 들어 설명하자면, 일반적으로 배양되는 세포들은 Mycoplasma의 감염에 취약하다고 한다. Mycoplasma는 그 크기가 1μm도 되지 않을 정도로 작아서 육안으로 감염 여부를 판단하기 불가능하다. 그러므로 그림 3에서 볼 수 있듯이 MycoAlert kit같은 Mycoplasma 진단 키트를 통해 정기적으로 세균에 의한 오염 여부를 판단하는 것이 중요하다.3. 참고자료Nicole C., Magda B., Abdu F(2009), “Growth and Maintenance of Vero Cell Lines”, Curr Protoc Microbial.Mariotti E, Mirabelli P, Di Noto R, Fortunato G, Salvatore F(2008), “Rapid detection of Mycoplasma incontinuous cell lines using a selective biochemical test”, Leukemia Research.

의/약학| 2016.04.13| 2페이지| 1,000원| 조회(722)

세포, 미생물, 세균, 바이러스, 생화학, 생물, 의학, 서울대, 세포배양, 수의학

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[서울대학교] ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

3. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay1. Indirect ELISA의 원리 및 각 시약의 역할바이러스의 진단방법은 다음과 같이 분류된다.단백질 검출법IFA(Immunofluorescence assay)ImmunoblottingELISAIndirect ELISA핵산 검출법PCRSandwich ELISAReal-time PCRComparative ELISAHybridization형태학적 진단Electron microscopyX-ray crystallography표1. 바이러스 진단방법의 분류이번 실습에서는 PRRS(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome)를 진단하기 위해 Indirect ELISA를 사용하였으며, 구체적인 원리는 그림 1을 참고하면 된다.이번 실습에 사용된 시약의 역할은 다음과 같다.* 양성 및 음성대조군2개를 이용해 평균값을 구하여 판정의 유효성을 검증하고 Sample의 S/P ratio를 구하는데 이용한다.* Conjugate2차항체라고도 부르며, 발색효소가 붙어있어 기질을 첨가하면 발색반응을 나타내 이를 측정할 수 있다.* TMB Substrate Solution3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine을 의미하며, 이는 2차항체에 부착된 효소와 반응하는 기질이 포함된 용액이다.* Stop Solution효소의 활성을 떨어뜨려 발색반응을 정지시킨다. 만약 효소활성이 지속될 경우 시간에 따라 검출하고자 하는 항체의 양과 상관없이 넣어준 TMB solution의 양에 따라 발색정도가 달라지기 때문에 정해진 시간에 반응을 중지시켜야 할 필요가 있다. 산 성분이기 때문에 피부에 자극을 유발할 수 있으므로 주의한다.2. 실험 결과 및 고찰 표2. Sample의 흡광도와 이를 바탕으로 얻은 S/P ratio와 양성 및 음성 판정(1) 흡광도 측정450nm에서의 흡광도를 측정하였다. 양성 및 음성 대조군의 흡광도를 이용하여 이 판정이 유효한지 알 수 있다.여기서 , 는 각각 양성 및 음성 대조군 흡광도의 평균값이다. 이를 -≥0.150 ≤0.150 에 대입하여 식이 만족되면 판정이 유의미하다고 할 수 있는데, 우리 조는 =0.409, =0.072로 두 식을 만족시킨다.(2) S/P ratio 계산(3) 양성/음성 판정S/P≥0.40 → 양성, S/P

의/약학| 2016.04.13| 2페이지| 1,000원| 조회(233)

면역, 미생물, 세균, 바이러스, 생화학, 생물, 서울대, 기생충, ELISA, PRRS

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