단백질 정량(Biuret method)실험 일자 : 2016년 3월 16일실험자 : 정다은(14010641)1. 실험목적주목적비색법 중 하나인 뷰렛 방법으로 흡광도를 측정하고, standard curve를 이용해 단백질 농도를 모르는 미지시료의 단백질함량을 측정할 수 있다.실험원리, 배경지식Biuret반응단백질 용액에 동량의 수산화나트륨을 가하고, 황산구리 수용액을 가한 뒤 진탕(vortexing)하면 적자색에서 청자색이 나타난다. 이 반응은 biuret (H2NCONHCONH2)라는 유기화합물이 나타나는 것 때문에 명명되었고, 펩티드 결합을 2개 이상 갖는 경우에 일어난다. 따라서, 유리 아미노산과 dipeptide에서는 일어나지 않는다(1).Biuret법우선 알칼리 용액(NaOH)에 황산구리를 넣은 뒤에 여기에 단백질을 넣으면 용액 중의 2가 Cu 양이온과 단백질의 peptide bond가 반응하며 킬레이트 복합체를 형성한다(2). 이런 자색을 띠는 킬레이트 복합체를 spectrophotometer로 560nm에서 흡광도를 측정하면 이를 이용해 standard curve를 얻을 수 있다.뷰렛반응(식품분석, 지구문화사 p118 그림 8-20)각 시약의 역할Cupric sulfate (CuSO4.5H2O) 황산구리 구리 이온을 낸다Sodium Potassium Tartrate (NaKC4O6.4H2O) 1가 양이온을 내어 용액내에 존재하는 다른 음이온에 달라붙음으로써 구리이온을 안정화시킨다Sodium hydroxide (NaOH) 용액상의 pH를 낮춰 알칼리성으로 만들어 단백질이 완전히 녹을 수 있도록 만들어준다.2. 재료 및 방법실험기구(원료)정밀저울, 비커, 메스실린더, 시험관, 시험관 혼합기(boltexing), 메스플라스크, 피펫, 시험관꽂이, 시약스푼, 칭량접시, 큐벳, Spectrophotometer시험관 혼합기 Spectrophotometer큐벳시약Cupric sulfate (CuSO4.5H2O)Sodium Potassium Tartrate (NaKC4O6.4H2O)Bovine serum albumin (BSA)Sodium hydroxide (NaOH)D.W미지시료(우유)실험과정Bovine serum albumin(BSA)을 피펫을 이용해서 시험관에 각각 1ml 기준으로 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 2, 3% 농도로 제조한다. 이때 0% 농도는 증류수를 1ml 넣도록 한다. BSA와 더불어 측정하고자 하는 단백질 미지시료 또한 100배로 희석해서 1ml 따서 시험관에 넣는다. 100배로 미지시료를 희석하는 이유는 결과에 있어 표준곡선을 넘는 범위의 흡광도에 미지시료가 있을 경우 정확도가 떨어지기 때문이다.마찬가지로 피펫을 이용해서 각 농도의 BSA 1ml에 biuret 4ml를 넣고 시험관 혼합기를 사용해 vortexing해 섞어준 후 실온에서 20~30분 방치한다. 마찬가지로 미지시료에도 biuret 4ml를 넣고 vortexing 해준 뒤 실온에 방치한다.각 농도의 BSA와 미지시료에 뷰렛을 넣은 뒤 vortexing하면 색깔이 변한다.제일 왼쪽이 미지시료, 그리고 3, 2, 1, 0.8, 0.6, 0.4, 0.2, 0% 순의 BSA이다.실온에서 방치한 각 농도의 혼합물을 피펫을 이용해 큐벳에 1.5ml씩 따서 넣은 뒤 Spectrophotometer를 이용하여 540nm에서 각 농도의 BSA와 미지시료의 흡광도를 3번씩 측정한다. 이때 기준을 잡기 위해서 증류수만 1.5ml 따서 큐벳에 넣은 뒤 spectrophotometer 첫 칸에 넣은 뒤 영점을 맞추고 BSA와 미지시료의 흡광도를 측정한다.좌) 큐벳에 피펫으로 1.5ml씩 각 농도의 BSA+뷰렛 혼합물과 미지시료+뷰렛 혼합물을 따서 넣는과정우) 0점 조절을 위한 증류수 큐벳을 넣은 사진. 두번째 칸에 측정을 원하는 큐벳을 넣고 닫은 뒤 영점조절을 하고 당기면 흡광도가 측정된다.큐벳에 담은 각 농도의 BSA+뷰렛 혼합물과 미지시료+뷰렛 혼합물측정된 값을 이용하여 standard curve를 그린다.3. 결과각 BSA 농도와 미지시료의 흡광도를 측정한 결과 다음과 같은 값들이 나왔다.농도를 x축으로 각 농도별 흡광도 평균값을 y축으로 해 분산그래프(standard curve)를 a만들고 추세선을 그려보면 다음과 같은 그래프와 식이 나온다.그러나 이 경우 R스퀘어 값이 0.7로 회귀방정식의 정확도가 떨어지므로 최대한 1에 근접하도록 오차가 발생할 가능성이 적은 낮은 농도의 BSA농도로만 분산그래프를 그려보았다.농도 0.8%까지만 standard curve를 그려보았을 때 R스퀘어 값이 0.98으로 전보다 비교적 원래 값에 더 근사한 회귀방정식을 얻을 수 있었다.이 회귀식을 사용해 미지시료의 흡광도로 단백질 농도를 역으로 산출해보면,미지시료의 흡광도가 0.072가 나왔으므로 회귀방정식의 y값에 이를 대입하면0.072=0.614x+0.03080.614x=0.072-0.0308=0.0412X=0.067처음 사용한 미지시료가 100배 희석한 시료이므로, 나온 x값에 100을 곱해주면0.067 x 100 = 6.7결론적으로, 미지시료의 단백질 농도는 약 6.7%이다.추가적으로 0.8%까지의 표준곡선일 때보다 0.4%농도까지로 범위를 축소했을 때 R스퀘어 값이 0.9988로 거의 1에 근접하므로 회귀방정식이 실제 값에 더 근사하다. 이 표준곡선을 사용해서 미지시료의 단백질 함량을 계산해보면0.072=0.4917x+0.04570.4917x=0.072-0.0457=0.0263X=0.053마찬가지로 희석계수 100을 곱해주면0.053 X 100 = 5.3이 경우 미지시료의 단백질 농도는 약 5.3%이다.4. 고찰Standard curve를 통해 미지시료의 단백질 함량을 측정해본 결과, standard curve를 BSA농도 0.8%까지의 흡광도 값으로 만든 경우 6.7%가 나왔고, 농도 0.4%까지 흡광도 값을 이용해 만든 경우 5.3%가 나왔다. 두 standard curve의 단백질 농도에는 약간의 차이가 있었고, R스퀘어 값이 1에 더 근사한 후자의 표준곡선으로 얻은 회기 방정식의 경우가 더 정확한 식일 것이다.결과로 나온 흡광도 값들을 보면 일직선상에 있지 않고 벗어난 경우가 많으며 단백질의 농도가 높아질수록 그래프가 직선이 아니라 휘어진 형태로 관찰됬는데 이 이유에 대해 몇 가지 예측을 해 보았다.
