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동물원 코끼리의 동물복지평가(발표 대본 첨부)

Telos of elephant Intake: 300kg, 100L Most time: eating group life: 7-15Role of zoo elephant 1.Education 2.Recreation&Entertainment3.Research4.ConservationImportance of assessing the welfare of zoo animal-give opportunities for improvement of animal welfare

사회과학| 2022.02.11| 22페이지| 2,000원| 조회(135)

동물복지평가, 동물원 평가, 동물원 복지평가, 코끼리 복지평가, 코끼리 복지

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Cold exposure mouse의 iBAT, eWAT, ingWAT에서 UCP1 발현 정도를 알아보기 위한 qPCR 보고서

Cold exposure mouse의 IBAT, IWAT에서UCP1 발현 정도를 알아보기 위한 qPCR 보고서Ⅰ. Introduction1. Classification of fat cells지방세포는 지방조직을 이루는 주된 세포로 기능과 형태적인 특징 그리고 분화 기원에 따라 구분된다.(1) 백색지방세포(White fat)에너지를 지질형태로 저장하거나 에너지가 필요할 때 저장된 지질을 분해한 후 다시 사용할 수 있게 조절하는 역할을 한다. 황백색이며 보통 피부 아래(피하 지방)와 복강(내부 지방)에서 발견된다. 백색 지방 세포는 일반적으로 크기가 다양한 둥근 세포이며 하나의 큰 지질 방울이 있다. 이 물방울들은 굶주리거나 에너지 수요가 증가할 때 지방산으로 전환될 수 있다.(2) 갈색지방세포(Brown fat)외부 추위에 맞서 체온을 유지할 수 있도록 열을 발생하는 지방세포로 많은 수의 미토콘드리아를 보유하고 있으며, Uncoupling protein 1(UCP1)과 같은 열 발생 조절 단백질들을 발현시키고 작고 많은 지질 방울을 형성한다. 이러한 특징으로 인해 에너지를 저장하는 흰색지방세포와는 달리 오히려 열 발생을 통해 에너지를 소모하게 된다. 근육세포와 같은 전구세포(Myf5+/Pax7+ precursor)로부터 분화되고, 견갑골, 쇄골, 신장 등의 위치에서 주로 발견된다. 갈색 지방 세포는 전통적으로 신생아에게만 발견되고 유아기에 사라질 것이라고 믿어왔지만 2009년 양전자단층촬영(PET) 등의 방법으로 성인에게서도 작동한다는 사실을 밝혀내 갈색 지방 세포가 일생 동안 몸 안에 존재한다는 것이 알려졌다.(3) 베이지색 지방세포 (Beige fat)흰색과 갈색 사이의 중간 특징을 가지고 있다. 갈색 지방 세포와 같은 역할을 하지만 백색 지방 세포와 비슷한 영역에서 발견된다. 백색 지방세포와 동일한 stem sell에서 나오지만, 체온이 떨어지면 열을 생산하기 위해 에너지를 태움으로써 갈색 지방 세포와 같은 기능을 한다. 흰색 지방세포나 흰색 지방전구세포(A 변성(Denaturation)단계이다. 이중가닥 DNA에 약 94-96℃ 고온처리를 해 분리시킨다. 변성 온도는 DNA내 G+C 양과 길이에 따라 달라진다.2단계는 혼성화(Annealing) 과정이다. ~65℃에서 이미 제작된 DNA 프라이머를 단일가닥 DNA와 결합시킨다. 반응온도와 DNA 프라이머의 길이는 정비례하는데 이는 DNA 프라이머의 GC 결합 때문이다. 결합 온도는 반응의 정확성을 결정하는 중요 요소로 Tm이 너무 높으면 프라이머가 주형 DNA에 약하게 결합되어 혼성화가 잘 되지 않고, 너무 낮으면 프라이머가 비특이적으로 결합하는 수소결합을 형성해 원하는 PCR 산물을 얻기 힘들다. 보통 30초 가량 지속되며 5’→3’ 방향으로 DNA가 합성된다.3단계는 DNA 중합효소에 의한 신장 단계(extension)다. 70-74℃ 정도로 가열시키는데, 이는 고열세균(호열세균)의 효소의 활성온도이다. 효소의 종류는 Taq, Tfl, Pfu polymerase등이 있다. Taq 중합효소를 많이 이용하는데 초당 60개의 속도로 진행한다고 알려져 있으나 조건에 따라 다르며, 보통 1분에 2,000-4,000 염기쌍을 중합하도록 한다. 1kb마다 1분을 배당하면 충분히 반응이 일어나며 마지막 사이클에서 10분정도 시간을 충분히 주는 게 좋다.5. qPCR(정량적 PCR, quantitative PCR)qPCR은 PCR을 이용하여 핵산을 검출, 특성화, 정량화하는 데 사용되는 기술이다. qPCR은 표준 PCR 과정에 형광 염료, 형광측정계라는 두 가지 요소를 추가한다. 형광 표지를 이용해 시간에 따라 데이터의 수집이 가능한데 일반적으로 녹색을 사용하며 dsDNA 결합 염료이다. 형광측정계는 열 순환 장치가 작동할 때 실시간으로 형광을 감지하여 PCR의 증폭 과정 전반에 걸쳐 판독값을 제공한다. 결과적으로 정량적 PCR은 실시간 PCR 또는 RT-PCR이라고도 한다. 적절한 표준 곡선 및 참조 값과 함께 반응 속도 및 시간에 대한 이 실시간 정보는 존재하는 DNAA로 변성되고 형광 dye가 분리된다. 온도를 점차적으로 내려줌으로서 dsDNA로 결합되어 형광 dye의 형광신호의 변화를 보여준다. 급격한 형광신호의 변화는 PCR 증폭 산물의 Tm값 근처에서 확인 할 수 있다.9. C57BL/6JC57BL/6J 마우스는 잘 번식하고 수명이 길어 연구에서 가장 많이 사용되는 근친 계통이다. 근친 교배 마우스 계통은 외모, 행동 및 실험 치료에 대한 반응을 포함하는 유전 특성 또는 표현형에서 높은 수준의 균일성을 나타낸다. C57BL/6J 마우스는 또한 형질전환 마우스의 생산에 일반적으로 사용되며 다양한 연구에 사용된다.10. Interpreting Nanodrop Results1) 260nm 흡수 (absorbacne at 260nm)핵산은 260nm 파장을 흡수한다. 이는 퓨린 과 피리밀린 모두가 260nm 파장에서 최대 흡수력을 가지기 때문이다. 따라서 260nm 파장은 핵산의 양을 측정하는 기준으로 사용된다.2) 280nm 흡수 (absorbacne at 280nm)단백질과 페놀 화합물은 280nm 파장에서 최대 흡수력을 가진다.3) 230nm 흡수 (absorbacne at 280nm)유기물질들은 225nm 파장 주변에서 강한 흡수력을 가진다. 페놀과 TRIzol, 염분, 단백질 내의 펩타이트 결합의 경우에는 200nm와 230nm 사이에서 빛을 흡수한다.4) A260/A280 비율 (ratio)단백질에 대한 핵산의 양을 보여주며 순수한 RNA와 DNA 경우에 비율은 각각 2.1과 1.8을 가진다. 비율이 낮을수록 단백질 함량이 높음을 보여준다. 높은 단백질 함량은 핵산을 이용하는 실험에 영향을 미친다.5) A260/A230 비율 (ratio)유기물질과 페놀 등 대한 핵산의 양을 보여준다. 순수한 RNA와 DNA 경우에는 2.0에 근접하는 비율을 가져야 한다. 비율이 1.8보다 낮을 시에는 상당한 양의 유기물질과 페놀 등이 함유되어 있음일 시사하며 이는 순수한 샘플이 획득되지 않음을 보여준다.11. PrimerDNA 달했기 때문에 DNA양이 상대적으로 많다는 것을 의미하고, 늦게 도달하는 샘플은 상대적으로 DNA양이 적어 더 많은 PCR cycle 후 도달한다는 것을 의미한다. DNA가 threshold에 도달하는 지점, 이때의 cycle 수를 threshold cycle이라 하고 Ct값이라고 표현한다. Ct값을 통해 샘플 내 target DNA양을 알 수 있다.20. student t testt-검증은 검증통계량이 student t-분포를 따르는 경우의 통계적 검증방법이다. 예를 들어, 모평균이고 모분산인 정규모집단에서 모분산이 알려지지 않은 소표본의 경우 대신 표본의 표준편차를 이용한 표준화 확률변수가 표준정규분포를 따르지 않고 student t-분포를 따른다. 이를 이용한 가설검증을 t-검증이라고 한다.Ⅱ. Material and methods2.1. Study site, housing전남대학교 수의과대학 실험실에서 수행되었다. 연구는 두 곳에서 시행되었는데 한 그룹은 사육장(23℃)에서, 다른 그룹은 냉장고 (4℃)에서 보관되었다. 표준으로 각 개체 당 동일한 사육장과 이불을 만들지 못하는 깔집, 물, 사료가 제공되었다.2.2. subject몸무게 20g 이상의 strain C57BL/6J 18주령의 수컷 마우스 7마리가 이용되었다. 쥐들은 무작위로 4마리의 cold exposure 그룹과 3마리의 room temperature 그룹으로 나뉘었다.2.3. material가위, 포셋, 패드, 드라이아이스, 냉동고. 70% 에탄올, 튜브, 튜브 랙, Beed, 팁, 디지털 피펫, 원심분리기, Trizol, homogenizer, chloroform, vortex mechine, ice incubation, Isopropanol, DEPC treated water, nano drop, 킴스와이퍼, DDW, oligodT, dNTP, 5x buffer, DTT, DEPC, MLV RT, PCR용 튜브, SYBR green, UPC1 primer, β-actin primer브를 다시 랙에 똑바로 넣고 10분간 air dry를 해준다.23) 튜브에 DEPC가 처리된 물 20μL를 넣고 tapping해서 잘 녹을 수 있게 한다.*DEPC: RNase의 작용기를 akylation하여 inactivation 시킨다.*RNA는 vortexing하면 깨질 수 있어서 안좋다.24) 짧게 원심분리를 하고 이후 과정은 모두 Ice에 넣고 진행을 한다.25) RNA 농도 측정을 위해 Nano drop 기계를 이용한다. 기계에서 nucleic acid 클릭하면 농도를 잴 수 있다, sample type을 rna로 맞춰준다.26) DEPC water로 용액을 놓는 부분에 떨어뜨려 청소하고 먼지가 붙지 않는 킴스와이프로 닦아준다.27) DEPC water 극소량 1-2μL 정도 추출해 가운데에 올려주고 닫은 후 blank를 눌러주면 디폴트가 된다.(농도0, 즉 용매)28) 킴스와이퍼로 닦아주고 샘플을 2μL 추출해 measure 눌러 측정을 한다.29) 28 과정을 모든 샘플에 거쳐 반복해 측정을 한다.3. cDNA synthesis1) 각각의 새 튜브에서 1500ng 만큼의 RNA 샘플을 넣고 공통 용매인 DEPC를 넣어 총 volume이 10.5μL가 되게 한다.2) 프라이머로 oligodT 1μL를 넣어주고 dNTP 1μ를 넣어주어 각 샘플 당 총 volume이 12.5μL가 되게 한다.*여러 용액들을 넣어줘야 해서 튜브에 잘못 들어가지 않도록 튜브 랙 방향을 바꿔준다.3) 튜브의 뚜껑을 닫고 뚜껑에 BAT, IWAT 이라고 이름을 적어준다.4) spin down을 해서 모든 용액을 튜브 바닥에 가라앉게 한다.*용액이 벽에 묻어 있어 반응이 잘 일어나지 않으므로5) 첫 번째 반응을 위해 PCR 기계에 65℃에서 5분간 온도 처리를 해준다.*미리 세팅해 둔 protocol을 사용하며 튜브의 뚜껑이 잘 닫혀 있는지 확인한다.6) 첫 번째 반응이 진행되는 동안 두 번째 반응 물질을 미리 준비한다.7) 새로운 튜브에 5x buffer 60μL, DTT .

자연과학일반| 2022.02.11| 13페이지| 3,500원| 조회(535)

PCR, qPCR, UCP1, qpcr보고서

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