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Taxol (Paclitaxel) (약용자원 ppt 발표)

Taxol ( Paclitaxel )Taxol 의 기원 ; 주목나무 주목나무에서 추출한 Paclitaxel 성분으로 미국 BMS 사가 Taxol 이라는 항암제를 만듦 ( 우리나라에서도 아주 예전부터 신장염 , 부종 , 당뇨병 등에 민간약으로 써온 나무 ) 주목나무 수령은 100 년 성분 추출 어려움 93 년 우리나라에서 세계 최초로 주목씨눈의 인공 배양기술을 개발해 Taxol 양산Taxol Semisynthesis SchemeTaxol 의 개발과 정 1962 년 미국 국립 암 연구소 수많은 종류의 동물 · 식물 · 광물 등 천연물질에서 새로운 항암물질을 개발하기 위해 연구 1971 년 순수정제 Taxol 이라 명명 1979 년 Taxol 의 탁월한 항암효과가 발견 Taxol 의 작용 Mechanism 이 밝혀짐 1983 년 임상연구시작 1992 년 난소암 치료제로 판매시작 1993 년 미국식품의약국 (FDA) 으로부터 항암제로 승인Taxol(Paclitaxel) 화학구조Taxol(Paclitaxel) 작용기How cancer develops? 최초의 암세포 형성 ( 발암개시기 ) - 정상세포의 유전자 DNA 발암인자 전자 빼앗김 돌연변이 발생 암세포 2) 암 발생 촉진기 - 발암물질 : 초발인자 , 촉진인자 - 초발인자 : 정상세포의 유전자에 작용 - 이어서 촉진인자 계속 작용 암 3) 암세포 전이Taxol 의 작용 기전 Taxol ( Paclitaxel ) 미세소관 조립 증진 미세소관 분해 저해 항암 효과미세소관 분해 저해 방추사 형성억제 암 세포 G2 기와 M 기에 정체 Taxol ( Paclitaxel ) 억제Pharmacokinetics 투여물의 약물은 보통 정맥주사 시 분포상의 반감기 : 15 – 30 min 소실상의 반감기 : 1.3 – 8.6 시간Taxol 의 Pharmacokinetics 분포경로 BBB(혈뇌장벽) 는 통과하지 않음 복수로는 분포됨 CSF (뇌척수액) 에 분포하지 않음 간 대사 소실경로 담즙배설 신장을 통해 배설약물의 상호작용 1) 시스플라틴과의 상호작용 2) 독소루비신과의 상호작용 3) 방사선과의 상호작용 4) 항악성 종양제와의 상호작용 5) 기타 약물과의 상호작용시스플라틴 투여 후 Taxol 투여 Taxol 투여 후 시스플라틴 투여 부작용 ( 골수억제 ) 가 더 큼 Taxol 청소율 33% 감소 말초 신경 장애 증가 따라서 Taxol 투여 후 시스플라틴 투여 !!!! 시스플라틴과의 상호작용독소 루비신과의 상호작용 Taxol 과 독소루비신과의 병용 독소루비신의 혈중 농도 증가 심독성 증가골수 억제 증가 위험 상승Taxol 과 방사선조사의 병용 식도암 발생 폐장염 발생 골수억제 증가 방사선과의 상호작용Taxol과 항악성 종양제와의 병용 골수 억제 증가 항악성 종양제와의 상호작용비타민 A, 아졸계항진균제 , 마크롤라이드계 호르몬제 , 디히드로피리딘계 칼슘채널차단제 , 테르페나딘 , 싸이클로스포린 , 베라파밀 , 퀴니딘 , 미다졸람 , 페나세틴 Taxol 대사 저해 기타약물들의 혈중농도 상승 가능 환자의 상태 관찰하며 주의 ! 기타 약물과의 상호작용Taxol ( Paclitaxel) 의 흔한 부작용 1) 조혈계 - 적혈구 수주 , 골수기능억제로 호중구감소증 , 백혈구 감소증 2) 피부 - 거의 모든 환자에서 탈모증 나타남 3) 과민반응 - 용매가 원인 , 30~60 % 정도 나타남4) 근골격계 - 근육통 , 관절통 (54%) 나타남 , 12% 는 심각 5) 소화기계 - 구역 / 구토 (44%), 설사 (25%), 점막염 (20%) 식욕부진 (25%), 변비 (18%) 6) 기타 - 감염 , 출혈가끔 나타나는 부작용 1) 조혈계 - 혈소판 감소증 2) 신경계 - 64% 에서 말초신경질환 나타남 , 4% 에서만 심각하게 나타남 3) 심장 - Rhythm disturbance, 심실성 빈맥 , 무증후성 서맥이 나타남 - heart block, dysrhythmias 가 발생 ( 특히 심장질환을 가졌던 환자에게 )Dosage ( 복용량 ) 용량은 135mg/㎡ 에서 175mg/㎡ 의 범위로 투여 매 3 주마다 한번씩 심한 neutropenia 나 말초신경 병변시 20% 의 용량 감소 Paclitaxel 1 vial 은 5% 포도당이나 normal saline 에 0.3mg/㎖ ~ 1.2mg/㎖ 의 농도로 희석한 후 투여Taxol 의 저장방법 20~ 25 ℃ 에서 보관하며 재사용 NO 투여직전 희석된 용액은 실온에서 차광하지 않은 채로 27 시간 동안 안정Q A감사합니다{nameOfApplication=Show}

의/약학| 2018.05.29| 26페이지| 1,000원| 조회(362)

탁솔, Paclitaxel, taxol, 약용자원, 파클리탁솔

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TLC, HPLC 실험보고서

1. 해당 생약 및 주성분 정보A : 갈근(puerarin)B : 감초(liquiritin)2. TLC의 종류 및 원리크로마토그래피는 혼합물로 된 시료를 이동 유체(mobile fluid)에 의해 고정된 고체상(solid phase) 또는 액체상(liquid phase)을 통하여 분리하는 기술이다. 분리되는 원리는 각 용질의 이동도(mobility)가 이동상과 고정상 사이에서 일정한 분배율에 좌우되는 데 있다. 즉, 고정상에 대해 친화성(affinity)이 높은 것일수록 이동상에 친화성이 큰 용질보다 더 느리게 이동할 것이다.분석하고자 하는 혼합물을 고정상에 주입하면 이동상은 성분을 운반한다. 개개의 분석 물질들은 2개의 상과 다른 방법으로 상호작용을 하게 된다. 다시 말해서 분석 물질들은 이동상과 고정상에 대한 친화력이 다르다. 결과적으로 각각의 분석 물질은 이동이나 배출 패턴이 다르게 존재할 것이며, 이를 이용하여 분서 물질들의 혼합물을 분리하거나 정량분석 할 수 있다.· 고정상(stationary phase) : 3가지 종류가 있다.① column 내부에 고체를 채운 것② 넓고 평평한 물질 표면에 고체 코팅을 한 것③ 열린 관 내부 벽에 액체 코팅을 한 것· 이동상(mobile phase) : 고정상의 주위를 가스나 액체가 연속적으로 흐른다.· Rf value : 이동상(전개용매)에 따른 용질의 이동거리Rf = 용질의 이동거리 / 이동상의 이동거리▷ Chromatography의 분류크로마토그래피 - 기체 크로마토그래피- 액체 크로마토그래피 - 페이퍼 크로마토그래피- 박층 크로마토그래피- column 크로마토그래피 - 흡착 크로마토그래피- 분배 크로마토그래피- 이온 교환크로마토그래피- 겔 크로마토그래피▷ Chromatography의 종류① 흡착 크로마토그래피(adsorption chromatography, AC): 화합물이 고체 표면에 흡착되는 정도 차이를 이용.② 분배 크로마토그래피(partition chromatography, PC): 용매에 녹는 정도가 다른 점(분배계수가 다른 점)을 이용.③ 이온 교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography): 주어진 pH에서 화합물이 해리해서 생긴 이온의 전하의 차이를 이용.④ 겔 투과 크로마토그래피(gel permeation chromatography, GPC): 다공성 젤을 컬럼에 충전시켜 분자량 차이에 의해 물질을 분리하는 방법.⑤ 정상 액체 크로마토그래피(normal phase liquid chromatography): 실리카겔이나 알루미나와 같이 극성이 큰 고체 표면에 물과 같이 극성이 큰 액체 막을 입힌 정지상과 극성이 작은 용액을 이동상으로 사용3. TLC 발색시약 종류Iodine / UV light / Dipping Solution / p-Anisaldehyde / Bromocresolgreen : carboxylic acids / Ceric ammonium Sulfate Spray / CAM / Ceric Sulfate (Ce(SO4)2) Distilled Sater Spray / 2,4-DNP / Dragendorff Reagent / Ferric Chloride Spray / Iodoplatinate / Ninhydrin / PDAB-NaNO2 Reagent - Ehrlichs, Van Urks / Permanganate(KMnO4) / PMA / Sulfanilic Acid Reagent (Diazotized), Pauly's Reagent / Sulfuric Acid / Vanillin4. UV chromophore 란?자외선의 흡수는 바닥상태에서 들뜬 상태로의 에너지 흡수로 이루어지는데, 이렇게 흡수를 일으키는 원자집단을 발색단(chromophore)라고 한다. 이들의 구조적 변화에 의해 흡수에너지와 강도가 변하게 된다.5. HPLC의 구성도 및 각 부분에 대한 설명HPLC(high performance liquid chromatography) 기기는 5개의 구성요소로 이루어진다.? Degasser : 이동상의 기포를 제거하는 기기Degasser에는 Helium purging, Vacuum degassing, Sonication 3가지 종류가 있다.? Pump : 이동상 용매를 운송하는 기기로 분석 시간 별 용매의 혼합 비율 변수를 조절하여 이동상의 조성을 일정(등용매)하게 유지할 것인지 변화(기울기 용매)를 줄지를 결정한다.? Injection : 이동상에 시료를 loading 하여 column으로 보내는 역할을 수행한다.? Column : 컬럼은 머무름 시간 차이를 통해 혼합 성분을 단일 성분으로 분리하는 역할을 수행한다. 사용되는 컬럼에는 Steel, Peek, Glass 컬럼이 있다.? Detector : 컬럼에서 분리된 시료가 검출기를 통과할 때 특정 규칙을 통해 전기적인 신호로 변환하는 역할을 수행한다. 검출기의 종류에는 자외선/가시광선 검출기, 형광 검출기, 굴절률 검출기가 있다.6. 실험 방법? TLC (Thin Layer Chromatography)· TLC plate에 연필을 이용해서 시료를 가할 위치를 표시한다.· 모세관을 이용, 각 분획을 Normal phase TLC plate에 loading한다.· MC:MeOH(8:2) 혼합용매를 만들어 TLC chamber에 넣는다.· TLC chamber의 뚜껑을 닫고 포화시킨다.· 준비된 TLC를 TLC chamber에 넣고 전개시킨다.· UV를 이용하여 365nm와 254nm 각각에서의 물질의 spot을 확인한다.· 발색시약(황산)을 처리하고 heating한다.? 추출물과 표준품의 TLC (Rf value 및 발색) 분석을 통해 생약재 동정· 기 확립 된 TLC조건을 이용하여, 제공된 생약재의 표준품과 추출물 분획을 비교한다.· Rf값과 UV 흡광 및 발색 등을 통해 얻은 정보를 분석하여 실험한 생약과 검출된 주성분을 동정한다.? HPLC· 생약 추출물 1mg을 1ml의 methanol에 녹인다.· HPLC 컬럼을 시작조건 용매로 충분히 안정화를 시켜준다. (용매조건 setting)· 준비된 샘플은 20ul 취하여 injection에 주입한다.· 추출물의 크로마토그램에서 표준품의 peak를 확인한다. (표준품 크로마토그램과 비교)· Peak area(%)법을 이용하여 해당 파장(254nm)에서의 표준물질의 상대적 함량을 확인한다.

의/약학| 2018.05.30| 5페이지| 1,000원| 조회(999)

TLC, HPLC, 감초, 갈근, Liquiritin, Puerarin

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Diazotisation, Azo Coupling 유기 실험 보고서

[이론]1. Diazotisation아질산과 일차 방향족 아민의 nitrosation으로 디아조늄염이 생기고, 반대 이온이 non-nucleophilic 이면 분리될 수 있다.디아조늄염은 halides(Sandmeyer Reaction, Schiemann Reaction)와 azo compounds의 제조를 위한 중요한 중간체이다. 디아조늄염은 유사할로겐화물형 친전자체로 반응할 수 있고, Heck Reaction이나 Suzuki Coupling을 위한 특정 프로토콜에 사용될 수 있다.1차 지방족 아민의 diazotization로 인해 생성된 중간체는 불안정하다. 이 중간체는 질소의 손실 후에 탄소 양이온으로 빠르게 전환되고, 치환, 제거 또는 재배치 과정으로 생성물을 산출한다.· Mechanism of Diazotisation2. Azo Coupling디아조아미노나 아조 화합물을 형성하기 위해 페놀이나 방향족 아민과 아렌디아조늄염의 연결이다. 아렌디아조늄염은 친전자성 시약이고 이것은 디아조아미노 화합물이나 1,3-디아릴트리아젠을 형성하기 위해 약한 산성 용액에서 1차, 2차 방향족 아민과 반응한다.이들은 아미노아조 화합물을 형성하기 위해 디아조아미노-아미노아조 자리옮김을 한다. 3차 방향족 아민과 디아조늄염은 아조 화합물을 산출하기 위해 직접 결합한다.아렌디아조늄은 또한 아조 커플링에서 β-디케톤과 β-케토에스테르와 같은 CH-산성 화합물과 반응한다. 아조 화합물은 히드라존을 형성하기 위해 자리 옮김 하는 반응에서 형성된다. 아조 커플링은 특히 아조 색소의 화학에서 매우 일반적인 반응이다.· Mechanism of Azo Coupling[시약]Pyridoxine~hydrochloride`:` {1.5`g} over {205.8`g/mol} `=`7.29`mmolAniline`=` {7.29`mmol` TIMES `46.5`g/mol} over {1.022`g/ml} `=`0.332`mlSodium~it"ni"trite`=`7.29`mmol` TIMES `69.0`g/mol`=`0.503`g[기구]Conical flask, Pear shaed flask, Ice bath, NMR spectrometer, UV lamp,Electronic scale, TLC plate, pH paper, Magnetic bar / stirrer, Pincet,Beaker, Pasteur pipet, Capillary tube[실험 과정]1. 100ml 삼각 플라스크에Pyridoxine~hydrochloride 1.5g을 넣고H_{ 2}O 10ml에 녹인다.위 시약을 2.5MNaOH로 pH 8에 맞춘다.(이때 열이 발생하므로 ice bath에서 dropwise 하고, pH paper를 이용해 pH를 확인한다.)2. 실온에서 25ml pear-shaped flask(끝이 뾰족한 플라스크)에Aniline 0.332ml를 6MHCl 7ml에 녹인 후 ice bath에서 냉각시킨다.3. 또 다른 pear-shaped flask에NaNO _{2} 0.503g을H_{ 2}O 1.5ml에 녹인 후 ice bath에서 냉각시킨다.4. 3.시약(NaNO _{2} 용액)을 2.시약(Aniline 용액)에 dropwise 한다.(디아조화된Aniline 용액 형성)5. 1.시약(피리독신 용액)에 5.시약(디아조화된Aniline 용액)을 dropwise 한다.(동시에 2.5MNaOH를 dropwise하며 pH paper를 이용해 pH 8을 유지하도록 확인한다.)6. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한다.7. 6MHCl로 pH 3-4로 조절 후 30분 동안 ice bath에서 침전되도록 유지한다.(최종 결과물인 고체가 생성된다)8. 침전물을 여과하고 불순물을 제거하기 위해 에탄올로 씻어준다.9. 충분히 건조 후 최종 생성물을 확인한다. (수득률 계산 & NMR 해석)[실험 결과]1. 수득률 계산· 이론적 수득량 :7.29`mmol` TIMES `309.75`g/mol`=`2.258`g· 최종 생성물 :0.9384`g· 수득률 ={0.9384`g} over {2.258`g} ` TIMES `100`(%)`=`41.559`%2. TLCR _{f}계산R _{f} (S)`=`0.6/6`=`0.1#R _{f} (R)`=`1.8/6`=`0.3#R _{f} (P)`=`2.2/6`=`0.37#R _{f} (Sol)`=`0.5/6`=`0.083. NMR 해석위 결과는 이번 실험에서 최종 product를 수소에 대한 NMR 분광 결과이다.원자의 결합 상태에 따라 원자핵이 받는 가리움 효과의 크기가 달라져 그에 따라 공명 주파수가 달라지는 현상을 화학적 이동이라고 한다. 가리움 효과가 많이 일어나서 높은 공명 진동수를 가진 그룹은 upfield이고, 반대로 가리움 효과가 많이 일어나지 않아 낮은 공명 진동수를 가진 그룹은 downfield이다. 특히 원자핵 주위에 O처럼 높은 전기음성도를 가진 원자가 붙어 있다고 하면, 가리움 효과가 크게 일어나지 않아 downfield된다.NMR에서 동일한 연결상태를 가지고 있는 동일한 그룹끼리는 하나의 peak 묶음을 이루게 된다. peak의 밑넓이는 그 그룹 종류 내의 수소 존재량을 나타낸다.이번 실험의 최종 product는 총 6가지의 서로 다른 H 그룹을 가진다. 하지만 NMR 결과는 보다 많은 peak가 관찰되었다. 이것은 최종 product를 얻을 때 완전히 건조되지 않아 남아있는

의/약학| 2018.05.29| 5페이지| 1,500원| 조회(331)

유기실험, Azo Coupling, diazotisation

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항생물질 저항성의 전파에 미치는 미생물 유전현상

항생물질 생산 미생물에는 immunity gene으로 알려진 내성 단백질을 암호화하는 유전자가 있다. immunity gene는 보통 항생제 생합성 효소를 암호화하는 유전자와 함께 조절된다. 세균의 많은 항생제 내성 유전자가 항생제 생산 균주에서 비생산 균주로 이동되는 수평적 유전자 전달 방법으로 획득된다. 이러한 방법으로 항생제 생산 균주의 외부에 거대한 내성 암호화 유전자 pool이 만들어진다. 세균 집단이 실험실 배양조건에서나 숙주 내에서 특정 항생제에 노출되면 항생제에 민감한 세균은 모두 파괴되지만 그 항생제에 저항성을 나타내는 유전자가 있는 R plasmid를 지니는 세균은 살아남는다. 많은 종류의 R plasmid가 F plasmid처럼 sex pili 유전자를 지니고 있어 conjugation을 통해 한 세포에서 다른 세포로 전달될 수 있다. 또한 빠른 증식, 돌연변이, 유전자 재조합과 같은 메커니즘을 통해 원핵생물 집단은 유전적 변이를 다양하게 축적할 수 있다. 따라서 항생제를 만들지 못하는 세균의 chromosome, plasmid, transposable element 및 다른 이동성 유전인자에 항생제 내성 유전자가 있다는 것은 놀랄만한 일이 아니다. 항생제 내성 유전자는 종종 이동성 유전인자에서 발견되며 이는 세균 사이에서 자유롭게 교환된다. 내성 유전자가 비생산 균주로 전달되면 비생산 균주는 자연스러운 염색체 돌연변이에 의해 내성을 갖게 된다. 보통 이러한 돌연변이는 항생제의 표적을 변화시켜 항생제가 결합할 수 없고 생장을 저해할 수 없다.빈번하게 병원성 세균은 R plasmid 같은 하나 이상의 내성 유전자를 지니고 있어 내성을 가진다. plasmid에 있는 유전자는 종종 항생제를 변형시키거나 파괴하는 효소(ex. penicillin hydrolysis, chloramphenicol, aminoglycoside acetylation)를 암호화하고 있다. plasmid 연합 유전자는 aminoglycoside, chloramphenicol, penicillin, cephalosporin, erythromycin, tetracycline, sulfonamide 및 다른 항생제에 내성을 가진다. 일단 세균이 R plasmid를 갖게 되면 plasmid(or gene)가 수평적 유전자 전달을 통해 빠른 속도로 다른 세포로 전달될 수 있다.항생제 내성 유전자는 plasmid 이외의 다른 유전인자에 위치할 수도 있다. 많은 전이인자가 항생제 내성 유전자를 지니고 있으며 plasmid 사이와 세균 군집을 통해 빠르게 이동할 수 있다. 이들은 Gram(+)과 Gram(-) 모두에서 발견된다. 대표적인 저항성 Marker는 Tn5(kanamycin, bleomycin, streptomycin), Tn21(streptomycin, spectinomycin, sulfonamide), Tn551(erythromycin) 및 Tn4001(gentamicin, tobramycin, kanamycin)이다. Tn5는 복제적 전이인자로 특별하게 주목한다. 그래서 원래의 위치에서 이동할 뿐만 아니라 복사본을 남겨 놓는다. 일부 전이인자는 전이 기능 이외에 conjugation을 통해서 다른 세균에 유전자를 전달하는 유전자를 포함하는 conjugation 전이인자이기 때문에 항생제 내성도 효과적으로 전파할 수 있다.항생제 내성은 integron라는 DNA 조각의 일부이다. integron은 integrase를 암호화하는 유전자와 하나 이상의 유전자(ex. immunity gene)로 구성되어 ‘Gene cassette’를 형성한다. integrase enzyme은 integron에서 Gene cassette를 잘라내는 반응을 촉매 한다. cassette는 다른 integrase enzyme에 의해 다른 integron를 구성할 수도 있다. 이러한 방법으로 Gene cassette가 한 integron에서 다른 integron로 이동할 수 있다. 만일 Gene cassette가 conjugation 전이인자에 있는 integron에 삽입되면 conjugation을 통해 다른 세포로 이동할 수 있다.항생물질 생산 미생물의 immunity gene은 다양한 경로를 통해 전달된다.1. 수직적 유전자 전달(vertical gene transfer)유전자가 부모에서 자손에게로 전달되는 수직적 유전자 전달은 모든 생물에서 관찰된다. 유성생식이 가능한 진핵생물에서 수직적 유전자 전달은 두 가지 방식에 의한 유전자 재조합이 동반된다. 첫 번째는 감수분열 시기에 일어나는 자매 염색체 사이의 교차이다. 이는 상동 염색체에 새로운 대립유전자 조합을 만든다. 두 번째 형식의 재조합은 생식세포 융합의 결과이다. 각 생식세포는 부모로부터 받은 대립 유전자를 가지고 있어 융합되면 부모의 대립유전자가 접합체에서 결합한다. 이러한 두 가지 방식의 재조합 결과로 자손 생물은 부모와도 다른 자손 생물과도 동일하지 않다. 따라서 immunity gene을 가지는 부모로부터 자손에게 수직적 유전자 전달을 통해 항생제 내성 유전자가 전달될 수 있다.2. 수평적 유전자 전달(horizontal gene transfer, HGT)세균과 고세균은 유성생식으로 증식하지 않는다. 이로 인해 원핵생물 집단에서 생기는 유전적 다양성은, 새로운 돌연변이가 생성되어 다음 세대로 전달되는 과정에 의해서만 일어나는 비교적 제한적인 것으로 생각되기도 했으나 그렇지는 않다. 세균과 고세균은 별개의 성숙한 개체에서 다른 개체로 유전자가 이동하며 종종 공여세포와 수용세포의 특징을 모두 가지는 안정된 재조합체를 생성한다. 공여 DNA는 수용세포에서 다음과 같은 네 가지 경로를 겪게 된다. 첫째, 공여 DNA와 수용세포의 염색체 사이에 상동 서열이 존재하면, 공여 DNA가 염색체에 삽입된다. 즉, 공여세포의 DNA는 수용세포의 DNA와 쌍을 이룬 다음 수용세포 염색체에 삽입되어 재조합 유전체를 만든다. 재조합체는 증식하여 안정된 재조합체 개체군을 형성한다. 둘째, 공여 DNA가 스스로 복제할 수 있다면(ex. plasmid) 수용세포의 염색체와 별개로 존재할 수 있다. 수용세포가 증식함에 따라 공여 DNA도 복제되면서 안정된 재조합체 개체군을 형성한다. 셋째, 공여 DNA가 세포질에 존재하기는 하지만 복제되지 않는다. 수용세포가 증식할 때 자손 세포는 공여 DNA를 갖지 못하여 결국 개체군에서 사라진다. 마지막 네 번째 경로는 숙주 제한(host restriction)이라 불린다. 이 과정에서 숙주세포의 핵산가수분해효소는 공여 DNA를 분해하여 재조합체가 형성되는 것을 막는다. 따라서 공여 DNA가 immunity gene이고 첫 번째 경로와 두 번째 경로를 따라 전달된다면 항생물질 저항성을 가진 안정된 재조합체 집단을 형성할 수 있다.수평적 유전자 전달이 일어나는 동안, 유전자는 세 가지 방법으로 전달될 수 있다. 일시적으로 맞닿아 있는 두 세포 사이에서의 직접 전달(conjugation), 아무것에도 둘러싸이지 않은 DNA 조각의 전달(transformation), 바이러스에 의한 DNA 전달(transduction)이 여기에 속한다.1) ConjugationConjugation은 두 세균이 직접 접촉해 DNA를 전달하는 방법이며, conjugation plasmid가 존재할 때 일어난다. 가장 잘 알려진 conjugation plasmid는 F factor이고 conjugation 방식에는 여러 가지가 있다.첫 번째로 F+*F-교배가 있다. F+ 균주는 sex pili 형성과 plasmid 전달에 관여하는 유전자가 포함된 F factor를 염색체와 별도로 가지고 있다. 유전자는 공여세포(F+)에서 수용세포(F-)로 이동하고 역방향의 교환은 일어나지 않는다. 또한 염색체 유전자는 거의 이동하지 않기 때문에 immunity gene의 전달은 쉽지 않다.두 번째로 Hfr conjugation이 있다. Hfr 균주는 F factor가 세포질에 자유롭게 있는 것이 아니라 염색체에 삽입되어 있다. 공여세포(Hfr strain)의 염색체 유전자가 conjugation을 통해 높은 빈도로 수용세포로 전달된다. 따라서 이 교배에서 높은 빈도의 재조합체가 생성되므로 공여세포의 immunity gene이 수용세포로 전달될 수 있다.세 번째로 F’ conjugation이 있다. F plasmid는 에피솜이므로, 염색체에 삽입되었던 것이 다시 빠져나와 독립적인 F factor로 자리 잡을 수 있다. 때로 이 과정 중에 오류가 발생하여 F plasmid가 염색체의 일부 유전자를 가지고 나올 수 있다. F’ plasmid를 지니는 세포는 일부 유전자가 F plasmid에 들어 있기는 하지만 자신의 유전자를 모두 지니고 있다. F’*F- 교배는 F+*F- 교배와 비슷하다. plasmid는 회전환 복제로 복사되면서 이동한다. 염색체 상의 세균 유전자는 이동하지 않으나, F’ plasmid 상의 세균 유전자는 이동한다. 이 유전자들은 수용세포 염색체에 삽입되지 않아도 발현될 수 있다. 이와 같은 방법으로 immunity gene이 집단에 빠르게 전파될 수 있다.

의/약학| 2018.05.29| 7페이지| 1,500원| 조회(180)

미생물, 항생물질, 저항성, 유전현상

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PCR(polymerase chain reaction)과 Agarose gel electrophoresis (약대 실험보고서)

PCR(polymerase chain reaction)과Agarose gel electrophoresis1. 방법1) PCR (polymerase chain reaction, 중합효소 연쇄 반응)a. PCR-tube에 sample을 넣어주고 용액을 첨가한다.b. PCR-tube를 잘 섞어 주고 원심분리기로 Spin-down 한다.c. PCR 기계로 PCR 한다.d. PCR이 끝나면 electrophoresis로 확인한다.2) Gel electrophoresis (겔 전기영동 법)a. TAE(Tris-acetic acid, EDTA) buffer와 agarose를 이용하여 agarose gel을 만든다.b. Agarose gel이 투명해지도록 전자레인지로 용해시킨다.c. 굳기 전에 EtBr(Etidium Bromide)을 넣고 섞어준다.d. Agarose gel이 식으면 틀에 붓고 굳을 때까지 기다린다.e. Agarose gel이 굳으면 전기영동 장치에 넣고 고정한다.f. 전기영동 장치에 Agarose gel이 잠기도록 TAE buffer를 부어준다.g. Agarose gel의 well에 각 sample 5μl씩 넣는다.h. 전기영동한다.I. 전기영동 후 gel을 분리하여 UV lamp로 결과를 관찰한다.2. 결과DNA LadderPlasmidPlasmid+제한효소1μl2μl4μl왼쪽 사진은 우리 조(6조) 결과이고. 오른쪽 사진은 DNA Ladder이다.Plasmid(Lane1)의 분자량은 DNA ladder(Lane2)와 비교하여 2000kDa보다 크다는 것을 알 수 있다. Plasmid에 제한효소를 첨가하여 전기영동 한 결과(Lane3) Plasmid가 분자량이 2000kDa보다 크지만 Plasmid보다 작은 큰가닥과 약 600kDa인 작은 가닥으로 두 개로 잘린 것을 확인할 수 있었다. 그리고 1μl, 2μl, 4μl (Lane4, 5, 6)순으로 농도를 증가시켰을 때 밴드가 점점 진해지는 것을 관찰 할 수 있는데 잘린 Plasmid 조각이 많아지기 때문이다. 그리고 1μl, 2μl, 4μl (Lane4, 5, 6) 순으로 농도를 증가시키면 밴드 역시 더 진해지는 것을 관찰할 수 있는데 이것은 잘린 Plasmid 조각이 많아지기 때문이다.3. 고찰PCR를 통해 관찰하고자 하는 표적 유전물질을 증폭하고 Agarose gel 전기영동 실험을 통해 전기영동 시 유전물질들이 크기에 따라 분리가 되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 제한효소에 의해 잘린 Plasmid의 크기를 유추할 수 있었다. 하지만 DNA Ladder를 통해서는 2,000kDa 이상의 크기는 확인하기 힘들었기 때문에 Plasmid의 대략적인 크기와 제한효소로 절단된 Plasmid의 큰가닥의 대략적인 크기도 알 수 없었다. DNA Ladder를 통해 확인 가능했던 결과 또한 눈으로 보고 판단하는 것이기에 정확한 크기라고 단정 짓기 힘들다. 마지막으로 농도가 높아질수록 띠가 더 진하게 관찰되었다.SDS-PAGE(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)1. 방법1) 실험세트에 유리판을 고정한다.2) Running gel을 만든다.- Running gel(15%) : Acrylamide + Bisacrylamide(cross-linking) + SDS+ APS(Ammonium PerSulafte) 50μl + TEMED 5μl3) 유리판 사이에 gel을 넣어준 뒤, 그 위에 물을 넣어준다.4) Running gel이 굳으면 휴지를 이용하여 물을 제거한다.5) Running gel 위에 0.1% SDS를 뿌렸다가 제거한다.(Running gel의 경계를 균일하게 하기 위함)6) Stacking gel을 만든다.- Stacking gel(4-5%) : Acrylamide + Bisacrylamide(cross-linking) + SDS+ APS(Ammonium PerSulafte) 10μl + TEMED 2μl7) 굳은 Running gel 위에 Stacking gel을 넣어주고 빗을 꽂아준다.8) Stacking gel이 굳으면 흐르는 물 아래에서 빗을 빼준다.9) 전기영동 탱크에 (+),(-)를 맞추어 유리판을 고정시킨다.10) 전기영동 탱크에 buffer를 가득 채운다.11) gel의 well에 각 sample 10μl씩 주입한다.12) 파워서플라이를 이용하여 전기영동을 실시한다.(먼저 120V로 시작하여 sample이 모두 stacking gel로 이동하면 200V로 높여준다.)13) 전기영동이 끝나면 겔을 분리하여 coomasie blue로 염색한다.14) 탈염색 후 결과를 확인한다.2. 결과LysPelletSupFtF1MarkerF2F3F4F5F6F7왼쪽 사진은 우리 조(6조) 결과이고. 오른쪽 사진은 Protein Marker이다.LYS(Lane1)은 세포를 깨서 나온 세포 추출물이므로 세포 내에 여러 종류의(다양한 크기의) 단백질이 있었다는 것을 확인할 수 있다. Protein Marker(Lane6)와 비교하여 보면 이 세포에는 분자량이 약 70kDa인 단백질이 가장 많고 분자량이 약 10kDa인 단백질이 그다음 순으로 많다는 것으로 확인할 수 있다. F1-7(Lane5,7-12)에서 비슷한 패턴이 보였으면 띠의 굵기가 점점 작아지는 것으로 보아 리간드의 농도가 점점 낮아지는 것을 알 수 있다. F1-7에는 특히 분자량이 약 70kDa인 단백질이 많다는 것 또한 알 수 있다.3. 고찰SDS-PAGE 실험에서 Protein Marker의 70kDa인 빨간 마커는 확실하게 보였지만 10kDa인 초록색 마커는 보이지 않았다. 이 때문에 Sample들을 전기영동 시켜 나타난 띠들 중 아래에 나타난 굵은 띠가 약 10kDa이라고 추측하지만 확신할 수 없었다. 첫 번째 실험과 마찬가지로 Protein Marker와 Sample에서 나타난 띠들을 눈으로 비교하여 크기를 확인하여야 하므로 정확한 크기를 알기는 힘들다. 또한 실험 결과에서 F1에서 나타난 띠의 굵기가 F2의 띠보다 작게 관찰되었는데 이것은 실험적 실수가 있었을 것이라 생각했기 때문에 결과에 F1에서 F7로 갈수록 리간드의 농도가 점점 낮아진다고 하였다. 전기영동 전 F1을 well에 넣어 줄 때 피펫팅을 잘못하여 10μl보다 적은 양을 넣어서 위와 같은 결과가 나타났을 것이라 예상한다.

의/약학| 2018.05.29| 4페이지| 1,000원| 조회(391)

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